UT iGEM 2012: Caffeinated coli - - PowerPoint PPT Presentation

UT ¡iGEM ¡2012: ¡Caffeinated ¡coli ¡

h7p://2012.igem.org/Team:AusAn_Texas ¡

Caffeine

• P. putida CBB5

Addiction Refactored operon Measurement Inducible promoter

Caffeine

• Caffeine ¡is ¡1,3,7-­‑trimethylxanthine ¡
• Xanthine ¡is ¡a ¡guanine ¡precursor ¡
• Annual ¡producAon: ¡120,000 ¡tons ¡ ¡

Caffeine Xanthine

Environmental Impact

http://www.geog.ucsb.edu

• Most ¡organisms ¡cannot ¡efficiently ¡

degrade ¡caffeine ¡

• Significant ¡accumulaAon ¡in ¡the ¡

environment ¡from ¡industrial ¡and ¡ waste ¡water ¡sources ¡

• Caffeine ¡levels ¡are ¡used ¡to ¡measure ¡

human ¡impact ¡on ¡bodies ¡of ¡water ¡

• As ¡high ¡as ¡70ug/L ¡measured ¡in ¡water ¡

around ¡populated ¡areas ¡(Switzerland)* ¡

*Buerge ¡et ¡al. ¡(2003) ¡Caffeine, ¡an ¡Anthropogenic ¡Marker ¡for ¡Wastewater ¡ ContaminaAon ¡of ¡Surface ¡Waters, ¡Environ. ¡Sci. ¡Technol. ¡2003, ¡37, ¡691-­‑700

And who is to blame?

Source: The Huffington Post (originally from http://www.ilovecoffee.jp)

Decaffeination

• Clean ¡up ¡the ¡environmental ¡

impacts ¡of ¡caffeine ¡polluAon ¡

• Detoxify ¡caffeinated ¡industrial ¡

waste ¡for ¡use ¡as ¡feed ¡stock ¡

• Produce ¡precursors ¡for ¡

methylxanthine-­‑based ¡drugs ¡

h7p://www.sfms.org/Portals/3/assets/images/Blog/Pills.jpg ¡ h7ps://www.avma.org/News/PressRoom/Cows/k7964-­‑1.jpg ¡

Trental-­‑ ¡an ¡arterial ¡dilator ¡from ¡theobromine ¡

PolluAon ¡Drives ¡EvoluAon? ¡

• Nylon ¡first ¡produced ¡in ¡

1935 ¡

• Nylon-­‑eaAng ¡

Flavobacterium ¡found ¡in ¡ wastewater ¡of ¡nylon ¡ producAon ¡factory ¡in ¡1975 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡

• Are ¡there ¡bacteria ¡

capable ¡of ¡degrading ¡ caffeine? ¡

Caffeine

• P. putida CBB5

Addiction Refactored operon Measurement Inducible promoter

Pseudomonas ¡pu4da ¡CBB5 ¡

• Discovered ¡by ¡Ryan ¡Summers ¡and ¡Mani ¡

Subramanian ¡at ¡the ¡University ¡of ¡Iowa ¡ ¡

• Can ¡live ¡on ¡caffeine ¡as ¡the ¡sole ¡carbon ¡and ¡

nitrogen ¡source ¡

Summers RM et al. (2012) J. Bact. 194:2041-2049.

• CBB5 ¡metabolizes ¡caffeine ¡and ¡other ¡methylxanthines ¡to ¡

xanthine ¡using ¡an ¡N-­‑demethylaAon ¡pathway ¡

CBB5 ¡Caffeine ¡DemethylaAon ¡Pathway ¡

• rf1 ¡ orf2 ¡

ndmA ¡ orf3 ¡

• rf4 ¡ ndmB ¡ orf5 ¡
• rf6 ¡

ndmC ¡ ndmD ¡ orf8 ¡

Caffeine

• P. putida CBB5

Addiction Refactored operon Measurement Inducible promoter

“Addicting” E.coli to Caffeine

PRPP ¡

IMP inosine-5'-phosphate XMP Xanthosine-5’-Phosphate dGTP DNA and RNA

(IMP Dehydrogenase)

GuaB

Caffeine

Xanthine

CBB5 operon gpt (Xanthine salvage pathway)

Cloning ¡naAve ¡CBB5 ¡demethylaAon ¡operon ¡

No growth

Operon_pACYC184

15815 bps

2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000

EcoRI XbaI PstI PstI XbaI PstI EcoRI EcoRI EcoRI XbaI EcoRI Reg1 fdh NdmA Mem Reg2 NdmB trans ORF-5 NdmC NdmD chlR

• 13.2 kb known sequence
• Cloned into pACYC184 plasmid
• Transformed into guaB knockout

Will refactoring restore functionality?

• P. putida CBB5
• ptimizing for E. coli

non-optimal RBSs experimentally proven RBSs non-optimal promoters experimentally proven promoters GTG start codons ATG start codons uncharacterized regulators constitutive expression

Possible incompatibilities:

• rf1 ¡ orf2 ¡

ndmA ¡ orf3 ¡

• rf4 ¡ ndmB ¡ orf5 ¡
• rf6 ¡

ndmC ¡ ndmD ¡ orf8 ¡

Caffeine

• P. putida CBB5

Addiction Refactored operon Measurement Inducible promoter

Refactored ¡demethylaAon ¡operon ¡

Promoter: ¡(BBa_J23100) ¡ RBS: ¡(BBa_B0034) ¡ ¡

AAAGAGGAGAAA ¡ ¡

gst9: ¡ ¡

Janthinobacterium ¡Marseille ¡

ndmABCD ¡ ¡

refactored ¡from ¡ ¡

• P. ¡pu4da ¡CBB5, ¡including ¡

ATG ¡replacements ¡

• rf1 ¡ orf2 ¡

ndmA ¡ orf3 ¡

• rf4 ¡ ndmB ¡ orf5 ¡
• rf6 ¡

ndmC ¡ ndmD ¡ orf8 ¡

Assembly: ¡One-­‑step, ¡6-­‑piece ¡Gibson ¡assembly ¡

BBa_K734000

BBa_23100 ¡ promoter ¡

ndmA ¡ ndmB ¡ ndmC ¡ ndmD ¡ gst9 ¡

pSB1C3 ¡ pSB1C3 ¡ = ¡RBS ¡(from ¡BBa_B0034) ¡+ ¡ATG ¡

promoter ¡

ndmA ¡ ndmB ¡ ndmC ¡ ndmD ¡

gst9 ¡

Gibson isothermal assembly

BBa_23100 ¡ promoter ¡

ndmA ¡ ndmB ¡ ndmC ¡ ndmD ¡ gst9 ¡

pSB1C3 ¡

Is it time for a new standard?

BioBroken?

Caffeine

• P. putida CBB5

Addiction Refactored operon Measurement Inducible promoter

Growth of guaB knockout with and without decaffeination operon

0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 5 10 15 20 25 OD595 Hours

• Operon + 0uM Supplement

+ Operon + 0uM Supplement

• Operon + 100uM Xanthine

+ Operon + 100uM Xanthine

• Operon + 100uM Caffeine

+ Operon + 100uM Caffeine

Growth in caffeinated beverages

– + decaffeination operon – + decaffeination operon

– + decaffeination operon – + decaffeination operon

Growth in caffeinated beverages

– + decaffeination operon

Growth in caffeinated beverages

• Growth of guaB knockout E.coli with decaffeination operon

shows linear dependence on caffeine concentration.

• Calculated that 7.6 +/- 0.8pg of caffeine was used per cell

Molecular ¡AccounAng ¡

Mole lecule les p per cell ll Guanine required (theoretical) 2.55×1010 Caffeine consumed (measured) 2.40×1010

• Calculated that 7.6 +/- 0.8 pg of caffeine was used per cell

Caffeine Content Calculations

Beverage ¡ Measured Caffeine Content (mg/L) ¡ Reported Caffeine Content (mg/L) ¡ Coke ¡ 105 ± 6 ¡ 99 ¡ Diet Coke ¡ 133 ± 10 ¡ 130 ¡ Monster ¡ 374 ± 31 ¡ 338 ¡ Red Bull ¡ 263 ± 15 ¡ 322 ¡

Errors (±) are standard deviations OD 600 = 0.0142*(uM Caffeine) + 0.1058

Caffeine

• P. putida CBB5

Addiction Refactored operon Measurement Inducible promoter

TranscripAonal ¡Regulators ¡& ¡Promoters ¡

• SyntheAc ¡biology ¡needs ¡more ¡

inducible ¡promoters! ¡

• IPTG ¡is ¡expensive ¡(>$10.00/g) ¡
• DegradaAon ¡operon ¡is ¡likely ¡

regulated ¡by ¡methylxanthines ¡ in ¡Pseudomonas ¡pu4da ¡CBB5. ¡ ¡

• Caffeine ¡is ¡cheap ¡($0.30/g) ¡

Collins ¡et ¡al. ¡SyntheAc ¡gene ¡ networks ¡that ¡count. ¡Science, ¡2009 ¡ ¡

• rf1 ¡ orf2 ¡

ndmA ¡

• rf3 ¡
• rf4 ¡ ndmB ¡
• rf5 ¡
• rf6 ¡ ndmC ¡ ndmD ¡ orf8 ¡

TranscripAonal ¡Regulators ¡& ¡Promoters ¡

• Two ¡putaAve ¡transcripAonal ¡regulators ¡
• Intergenic ¡regions ¡may ¡contain ¡regulated ¡promoters ¡
• P. ¡pu4da ¡naAve ¡caffeine ¡degradaAon ¡operon ¡

LacZ ¡

• rf1 ¡

Or

• rf4 ¡

Protein ¡Based ¡Repression ¡of ¡ndmA ¡Promoter ¡

• Confirms ¡presence ¡of ¡ndmA ¡promoter ¡
• orf4 ¡protein ¡regulates ¡ndmA ¡expression ¡

*credit Monty Python and the Holy Grail, Michael White Productions

HELP! HELP!

I’m Being Repressed!

Caffeine-based Induction

• f ndmA Promoter

Summary of Results

• Refactored decaffeination operon

from P. putida CBB5 into E. coli.

• “Addicted" E. coli to caffeine.
• Used the addicted cells to

accurately measure caffeine content of common beverages.

• Characterized a methylxanthine-

responsive transcriptional regulator.

UT Austin iGEM 2012

Undergraduates Ben Slater Peter Outopal Razan Alnahhas Logan Bachman Aurko Dasgupta Will Darden Advisors

• Prof. Jeff Barrick

Michael Hammerling Erik Quandt Jared Ellefson

Looking face down on a coffee cup Questions?

Questions?

• Refactored decaffeination operon

from P. putida CBB5 into E. coli.

• “Addicted" E. coli to caffeine.
• Used the addicted cells to

accurately measure caffeine content of common beverages.

• Characterized a methylxanthine-

responsive transcriptional regulator.

I-SceI I-CeuI

• 1. Parts amplified by PCR
• 2. Assembled via overlapping homologies (Gibson, OLE, MEGAWHOP, etc)
• 3. New standard vector with new prefix and suffix for quality control
• 4. Homing endonuclease sites I-SceI and I-CeuI

Advantages:

• Reduces likelihood of presence of incompatible restriction sites in

natural and engineered parts to negligible levels

• Compatible with both restriction and Gibson assembly methods
• Both homing endonucleases have ≥50% activity in NEBuffer 4,

supporting quality control via restriction enzyme cleavage

RFC512: A universal standard for fast, seamless part assembly

TheoreAcal ¡Guanine ¡ConcentraAon ¡

• The ¡dry ¡weight ¡of ¡E. ¡coli ¡is ¡280 ¡fg ¡

– Approximately ¡20% ¡RNA ¡(dry ¡weight) ¡ – DNA ¡is ¡negligible ¡in ¡comparison ¡

• ~25% ¡Guanine ¡
• 330g/mol ¡per ¡average ¡DNA ¡base ¡
• Thus, ¡2.55 ¡x ¡1010 ¡guanines ¡per ¡cell ¡