UT iGEM 2012: Caffeinated coli - - PowerPoint PPT Presentation

UT ¡iGEM ¡2012: ¡Caffeinated ¡coli ¡

h7p://2012.igem.org/Team:AusAn_Texas ¡

Caffeine

• Caffeine ¡is ¡1,3,7-­‑trimethylxanthine ¡
• Xanthine ¡is ¡a ¡guanine ¡precursor ¡
• Used ¡in ¡many ¡foods, ¡beverages, ¡and ¡ ¡

pharmaceuAcals ¡

• ¡120,000 ¡tons/year ¡made ¡by ¡humans ¡ ¡

Caffeine Xanthine

Environmental Impact

Rodriguez et al. (2012) Marine Pollution Bulletin, 64: 1417-1424. ¡

• Most ¡organisms ¡cannot ¡efficiently ¡

degrade ¡caffeine ¡

• Significant ¡accumulaAon ¡in ¡the ¡

environment ¡from ¡industrial ¡and ¡ waste ¡water ¡sources ¡

• Caffeine ¡levels ¡are ¡used ¡to ¡measure ¡

human ¡impact ¡on ¡bodies ¡of ¡water ¡

Environmental Impact

http://www.geog.ucsb.edu

• Most ¡organisms ¡cannot ¡efficiently ¡

degrade ¡caffeine ¡

• Significant ¡accumulaAon ¡in ¡the ¡

environment ¡from ¡industrial ¡and ¡ waste ¡water ¡sources ¡

• Caffeine ¡levels ¡are ¡used ¡to ¡measure ¡

human ¡impact ¡on ¡bodies ¡of ¡water ¡

And who is to blame?

Source: The Huffington Post (originally from http://www.ilovecoffee.jp)

Decaffeination

• Clean ¡up ¡the ¡environmental ¡

impacts ¡of ¡caffeine ¡polluAon ¡

• Detoxify ¡caffeine ¡industrial ¡

waste ¡for ¡use ¡as ¡feed ¡stock ¡

• Produce ¡new ¡methylxanthine ¡

based ¡drugs ¡

http://www.sfms.org/Portals/3/assets/images/Blog/Pills.jpg https://www.avma.org/News/PressRoom/Cows/k7964-1.jpg

Pseudomonas ¡pu,da ¡CBB5 ¡

• Discovered ¡by ¡Ryan ¡Summers ¡and ¡Mani ¡

Subramanian ¡at ¡the ¡University ¡of ¡Iowa ¡ ¡

• Can ¡live ¡on ¡caffeine ¡as ¡the ¡sole ¡carbon ¡and ¡

nitrogen ¡source ¡

Summers RM et al. (2012) J. Bact. 194:2041-2049.

• CBB5 ¡metabolizes ¡caffeine ¡and ¡other ¡methylxanthines ¡to ¡

xanthine ¡using ¡an ¡N-­‑demethylaAon ¡pathway ¡

CBB5 ¡Caffeine ¡DemethylaAon ¡Pathway ¡

“Addicting” E.coli to Caffeine

PRPP ¡

IMP inosine-5'-phosphate XMP Xanthosine-5’-Phosphate dGTP DNA and RNA

(IMP Dehydrogenase)

GuaB

Caffeine

Xanthine

CBB5 operon gpt Xanthine salvage pathway

Cloning ¡naAve ¡CBB5 ¡demethylaAon ¡operon ¡

No growth

• 13.2 kb known sequence
• Cloned into pACYC184 plasmid
• Transformed into guaB knockout

Will refactoring restore functionality?

• P. putida CBB5
• ptimizing for E. coli

non-optimal RBSs experimentally proven RBSs non-optimal promoters experimentally proven promoters GTG start codons ATG start codons uncharacterized regulators constitutive expression

Possible incompatibilities:

Refactored ¡demethylaAon ¡operon ¡

Promoter: ¡(BBa_J23100) ¡ RBS: ¡(BBa_B0034) ¡ ¡

AAAGAGGAGAAA ¡

gst9: ¡ ¡

Janthinobacterium ¡Marseille ¡

ndmABCD ¡ ¡

refactored ¡from ¡ ¡

• P. ¡pu,da ¡CBB5, ¡including ¡

ATG ¡replacements ¡

• rf8 (partial sequence)

Assembly: ¡One-­‑step, ¡6-­‑piece ¡Gibson ¡assembly ¡

BBa_23100 ¡ promoter ¡

ndmA ¡ ndmB ¡ ndmC ¡ ndmD ¡ gst9 ¡

pSB1C3 ¡ pSB1C3 ¡ = ¡RBS ¡(from ¡BBa_B0034) ¡+ ¡ATG ¡

promoter ¡ ndmA ¡ ndmB ¡ ndmC ¡ ndmD ¡ gst9 ¡

BBa_K734000

Gibson isothermal assembly

Growth of guaB knockout with and without decaffeination operon

!" !#!$" !#%" !#%$" !#&" !#&$" !#'" !#'$" !#(" !#($" !#$" !" &" (" )" *" %&" %(" %+" %*" &%" &(" !"#$#% &'()*%

,"-./0-1"2"!34"53..6/7/18" 2"-./0-1"2"!34"53..6/7/18" ,"-./0-1"2"%!!34"9:18;<1/" 2"-./0-1"2"%!!34"9:18;<1/" ,"-./0-1"2"%!!34"=:>/<1/" 2"-./0-1"2"%!!34"=:>/<1/"

Growth in caffeinated beverages

– + decaffeination operon – + decaffeination operon

– + decaffeination operon

Growth in caffeinated beverages

• Growth of guaB knockout E.coli with decaffeination operon

shows linear dependence on caffeine concentration. 7.6 ± 0.8 pg caffeine required per E. coli cell

• Beyond 250 µM, growth is saturated, apparently because

another nutrient becomes limiting.

Caffeine content calculations

* Reported value; may vary depending on preparation

Calc lcula lated c caffeine ne cont ntent nt ( (mg mg/L) Actual c l caffeine ne cont ntent nt ( (mg mg/L) Coca-Cola 99.1 98.6 Espresso 44.7 39.5*

TranscripAonal ¡Regulators ¡& ¡Promoters ¡

• SyntheAc ¡biology ¡needs ¡more ¡

inducible ¡promoters! ¡

• IPTG ¡is ¡expensive ¡(>$10.00/g) ¡
• DegradaAon ¡operon ¡is ¡likely ¡

regulated ¡by ¡methylxanthines ¡ in ¡Pseudomonas ¡pu,da ¡CBB5. ¡ ¡

• Caffeine ¡is ¡cheap ¡($0.30/g) ¡

Collins ¡et ¡al. ¡SyntheAc ¡gene ¡networks ¡ that ¡count. ¡Science, ¡2009 ¡ ¡

TranscripAonal ¡Regulators ¡& ¡Promoters ¡

• Two ¡putaAve ¡transcripAonal ¡regulators ¡
• Intergenic ¡regions ¡may ¡contain ¡regulated ¡promoters ¡
• P. ¡pu,da ¡naAve ¡caffeine ¡degradaAon ¡operon ¡

TranscripAonal ¡Regulators ¡& ¡Promoters ¡

• Two ¡putaAve ¡transcripAonal ¡regulators ¡
• Intergenic ¡regions ¡may ¡contain ¡regulated ¡promoters ¡
• P. ¡pu,da ¡naAve ¡caffeine ¡degradaAon ¡operon ¡

TranscripAonal ¡Regulators ¡& ¡Promoters ¡

• Two ¡putaAve ¡transcripAonal ¡regulators ¡
• Intergenic ¡regions ¡may ¡contain ¡regulated ¡promoters ¡
• P. ¡pu,da ¡naAve ¡caffeine ¡degradaAon ¡operon ¡

TranscripAonal ¡Regulators ¡& ¡Promoters ¡

• Two ¡putaAve ¡transcripAonal ¡regulators ¡
• Intergenic ¡regions ¡may ¡contain ¡regulated ¡promoters ¡
• P. ¡pu,da ¡naAve ¡caffeine ¡degradaAon ¡operon ¡

LacZ ¡

TranscripAonal ¡Regulators ¡& ¡Promoters ¡

• Two ¡putaAve ¡transcripAonal ¡regulators ¡
• Intergenic ¡regions ¡may ¡contain ¡regulated ¡promoters ¡
• P. ¡pu,da ¡naAve ¡caffeine ¡degradaAon ¡operon ¡

LacZ ¡ Orf1 ¡or ¡Orf4 ¡

Protein ¡Based ¡Repression ¡of ¡ndmA ¡Promoter ¡

• Confirms ¡presence ¡of ¡ndmA ¡promoter ¡
• orf4 ¡protein ¡regulates ¡ndmA ¡expression ¡

0 ¡ 2000 ¡ 4000 ¡ 6000 ¡ 8000 ¡ 10000 ¡ 12000 ¡ ndmA ¡Promoter ¡ ndmA ¡Promoter ¡+ ¡ORF1 ¡ ndmA ¡Promoter ¡+ ¡ORF4 ¡

Miller ¡Units ¡

TesAng ¡for ¡Substrate ¡InducAon ¡

0 ¡ 100 ¡ 200 ¡ 300 ¡ 400 ¡ 500 ¡ 600 ¡ 700 ¡

0 ¡ 1 ¡ 2 ¡ 3 ¡ 4 ¡ 5 ¡ 6 ¡

Miller ¡Units ¡ Supplement ¡Concentra9on ¡(mM) ¡

Induc9on ¡of ¡ndmA ¡promoter ¡via ¡Methylxanthine ¡Supplementa9on ¡ Caffeine ¡ Theobromine ¡ Theophylline ¡

• ndmA ¡promoter ¡is ¡induced ¡by ¡methylxanthines ¡

Summary of Results

• Refactored decaffeination operon

from P. putida CBB5 into E. coli.

• “Addicted" E. coli to caffeine.
• Used the addicted cells to

accurately measure caffeine content of common beverages.

• Characterized a methylxanthine-

responsive transcriptional regulator.

UT Austin iGEM 2012

Undergraduates Ben Slater Peter Outopal Razan Alnahhas Logan Bachman Aurko Dasgupta Will Darden Advisors

• Dr. Jeff Barrick

Michael Hammerling Erik Quandt Jared Ellefson