UT iGEM 2012: Caffeinated coli - PowerPoint PPT Presentation

UT ¡iGEM ¡2012: ¡Caffeinated ¡coli ¡ h7p://2012.igem.org/Team:AusAn_Texas ¡

Caffeine • Caffeine ¡is ¡1,3,7-­‑trimethyl xanthine ¡ • Xanthine ¡is ¡a ¡guanine ¡precursor ¡ • Used ¡in ¡many ¡foods, ¡beverages, ¡and ¡ ¡ Caffeine pharmaceuAcals ¡ • ¡120,000 ¡tons/year ¡made ¡by ¡humans ¡ ¡ Xanthine

Environmental Impact • Most ¡organisms ¡cannot ¡efficiently ¡ degrade ¡caffeine ¡ • Significant ¡accumulaAon ¡in ¡the ¡ environment ¡from ¡industrial ¡and ¡ waste ¡water ¡sources ¡ • Caffeine ¡levels ¡are ¡used ¡to ¡measure ¡ human ¡impact ¡on ¡bodies ¡of ¡water ¡ Rodriguez et al. (2012) Marine Pollution Bulletin , 64 : 1417-1424. ¡

Environmental Impact • Most ¡organisms ¡cannot ¡efficiently ¡ degrade ¡caffeine ¡ • Significant ¡accumulaAon ¡in ¡the ¡ environment ¡from ¡industrial ¡and ¡ waste ¡water ¡sources ¡ • Caffeine ¡levels ¡are ¡used ¡to ¡measure ¡ human ¡impact ¡on ¡bodies ¡of ¡water ¡ http://www.geog.ucsb.edu

And who is to blame? Source: The Huffington Post (originally from http://www.ilovecoffee.jp)

Decaffeination • Clean ¡up ¡the ¡environmental ¡ impacts ¡of ¡caffeine ¡polluAon ¡ • Detoxify ¡caffeine ¡industrial ¡ waste ¡for ¡use ¡as ¡feed ¡stock ¡ • Produce ¡new ¡methylxanthine ¡ https://www.avma.org/News/PressRoom/Cows/k7964-1.jpg based ¡drugs ¡ http://www.sfms.org/Portals/3/assets/images/Blog/Pills.jpg

Pseudomonas ¡pu,da ¡ CBB5 ¡ • Discovered ¡by ¡Ryan ¡Summers ¡and ¡Mani ¡ Subramanian ¡at ¡the ¡University ¡of ¡Iowa ¡ ¡ • Can ¡live ¡on ¡caffeine ¡as ¡the ¡sole ¡carbon ¡and ¡ nitrogen ¡source ¡ Summers RM et al. (2012) J. Bact. 194 :2041-2049.

CBB5 ¡Caffeine ¡DemethylaAon ¡Pathway ¡ • CBB5 ¡metabolizes ¡caffeine ¡and ¡other ¡methylxanthines ¡to ¡ xanthine ¡using ¡an ¡ N -­‑demethylaAon ¡pathway ¡

“Addicting” E.coli to Caffeine PRPP ¡ IMP inosine-5'-phosphate GuaB (IMP Dehydrogenase) XMP Xanthine Xanthosine-5’-Phosphate gpt CBB5 operon Caffeine DNA and RNA dGTP Xanthine salvage pathway

Cloning ¡naAve ¡CBB5 ¡demethylaAon ¡operon ¡ - 13.2 kb known sequence - Cloned into pACYC184 plasmid - Transformed into guaB knockout No growth Possible incompatibilities: P. putida CBB5 optimizing for E. coli non-optimal RBSs experimentally proven RBSs non-optimal promoters experimentally proven promoters Will refactoring restore GTG start codons ATG start codons functionality? uncharacterized regulators constitutive expression

Refactored ¡demethylaAon ¡operon ¡ Promoter: ¡(BBa_J23100) ¡ RBS: ¡(BBa_B0034) ¡ ¡ AAAGAGGAGAAA ¡ ndmABCD ¡ ¡ refactored ¡from ¡ ¡ P. ¡pu,da ¡ CBB5, ¡including ¡ ATG ¡replacements ¡ gst9 : ¡ ¡ Janthinobacterium ¡Marseille ¡ orf8 (partial sequence)

Assembly: ¡One-­‑step, ¡6-­‑piece ¡Gibson ¡assembly ¡ promoter ¡ = ¡RBS ¡(from ¡BBa_B0034) ¡+ ¡ATG ¡ ndmA ¡ ndmB ¡ ndmC ¡ ndmD ¡ gst9 ¡ pSB1C3 ¡ Gibson isothermal assembly BBa_23100 ¡ ndmA ¡ ndmC ¡ ndmD ¡ gst9 ¡ ndmB ¡ promoter ¡ pSB1C3 ¡ BBa_K734000

Growth of guaB knockout with and without decaffeination operon !#$" !#($" !#(" !#'$" !#'" ,"-./0-1"2"!34"53..6/7/18" !"#$#% 2"-./0-1"2"!34"53..6/7/18" !#&$" ,"-./0-1"2"%!!34"9:18;<1/" !#&" 2"-./0-1"2"%!!34"9:18;<1/" ,"-./0-1"2"%!!34"=:>/<1/" !#%$" 2"-./0-1"2"%!!34"=:>/<1/" !#%" !#!$" !" !" &" (" )" *" %&" %(" %+" %*" &%" &(" &'()*%

Growth in caffeinated beverages – + decaffeination operon – + decaffeination operon

Growth in caffeinated beverages – + decaffeination operon

• Growth of guaB knockout E.coli with decaffeination operon shows linear dependence on caffeine concentration. 7.6 ± 0.8 pg caffeine required per E. coli cell • Beyond 250 µ M, growth is saturated, apparently because another nutrient becomes limiting.

Caffeine content calculations Calc lcula lated c caffeine ne Actual c l caffeine ne cont ntent nt ( (mg mg/L) cont ntent nt ( (mg mg/L) Coca-Cola 99.1 98.6 Espresso 44.7 39.5* * Reported value; may vary depending on preparation

TranscripAonal ¡Regulators ¡& ¡Promoters ¡ • SyntheAc ¡biology ¡needs ¡more ¡ inducible ¡promoters! ¡ • IPTG ¡is ¡expensive ¡(>$10.00/g) ¡ • DegradaAon ¡operon ¡is ¡likely ¡ regulated ¡by ¡methylxanthines ¡ in ¡ Pseudomonas ¡pu,d a ¡CBB5. ¡ ¡ • Caffeine ¡is ¡cheap ¡($0.30/g) ¡ Collins ¡et ¡al. ¡SyntheAc ¡gene ¡networks ¡ that ¡count. ¡Science, ¡2009 ¡ ¡

TranscripAonal ¡Regulators ¡& ¡Promoters ¡ P. ¡pu,da ¡ naAve ¡caffeine ¡degradaAon ¡operon ¡ • Two ¡putaAve ¡transcripAonal ¡regulators ¡ • Intergenic ¡regions ¡may ¡contain ¡regulated ¡promoters ¡

TranscripAonal ¡Regulators ¡& ¡Promoters ¡ P. ¡pu,da ¡ naAve ¡caffeine ¡degradaAon ¡operon ¡ • Two ¡putaAve ¡transcripAonal ¡ regulators ¡ • Intergenic ¡regions ¡may ¡contain ¡regulated ¡promoters ¡

TranscripAonal ¡Regulators ¡& ¡Promoters ¡ P. ¡pu,da ¡ naAve ¡caffeine ¡degradaAon ¡operon ¡ • Two ¡putaAve ¡transcripAonal ¡regulators ¡ • Intergenic ¡regions ¡may ¡contain ¡ regulated ¡promoters ¡

TranscripAonal ¡Regulators ¡& ¡Promoters ¡ P. ¡pu,da ¡ naAve ¡caffeine ¡degradaAon ¡operon ¡ LacZ ¡ • Two ¡putaAve ¡transcripAonal ¡regulators ¡ • Intergenic ¡regions ¡may ¡contain ¡regulated ¡promoters ¡

TranscripAonal ¡Regulators ¡& ¡Promoters ¡ P. ¡pu,da ¡ naAve ¡caffeine ¡degradaAon ¡operon ¡ LacZ ¡ Orf1 ¡or ¡Orf4 ¡ • Two ¡putaAve ¡transcripAonal ¡regulators ¡ • Intergenic ¡regions ¡may ¡contain ¡regulated ¡promoters ¡

Protein ¡Based ¡Repression ¡of ¡ ndmA ¡Promoter ¡ 12000 ¡ Miller ¡Units ¡ 10000 ¡ 8000 ¡ 6000 ¡ 4000 ¡ 2000 ¡ 0 ¡ ndmA ¡Promoter ¡ ndmA ¡Promoter ¡+ ¡ORF1 ¡ ndmA ¡Promoter ¡+ ¡ORF4 ¡ • Confirms ¡presence ¡of ¡ ndmA ¡promoter ¡ • orf4 ¡protein ¡regulates ¡ ndmA ¡ expression ¡

TesAng ¡for ¡Substrate ¡InducAon ¡ Induc9on ¡of ¡ ndmA ¡promoter ¡via ¡Methylxanthine ¡Supplementa9on ¡ 700 ¡ 600 ¡ Miller ¡Units ¡ 500 ¡ Caffeine ¡ 400 ¡ 300 ¡ Theobromine ¡ 200 ¡ Theophylline ¡ 100 ¡ 0 ¡ 0 ¡ 1 ¡ 2 ¡ 3 ¡ 4 ¡ 5 ¡ 6 ¡ Supplement ¡Concentra9on ¡(mM) ¡ • ndmA ¡ promoter ¡is ¡induced ¡by ¡methylxanthines ¡

Summary of Results • Refactored decaffeination operon from P. putida CBB5 into E. coli. • “Addicted" E. coli to caffeine. • Used the addicted cells to accurately measure caffeine content of common beverages. • Characterized a methylxanthine- responsive transcriptional regulator.

UT Austin iGEM 2012 Undergraduates Ben Slater Peter Outopal Razan Alnahhas Logan Bachman Aurko Dasgupta Will Darden Advisors Dr. Jeff Barrick Michael Hammerling Erik Quandt Jared Ellefson