Northwestern U University iGEM iGEM 20 2013: 3: A n novel a - PowerPoint PPT Presentation

Northwestern U University iGEM iGEM 20 2013: 3: A n novel a approach t to o oral h health

The Problem: Tooth Decay

Tooth Decay: Quick Facts 36% ¡ of ¡people ¡worldwide ¡have ¡dental ¡caries ¡in ¡ their ¡permanent ¡teeth. ¡ 9% ¡ of ¡all ¡babies ¡suffer ¡from ¡dental ¡caries. ¡ 5X ¡ more ¡common ¡than ¡asthma ¡among ¡children ¡ in ¡the ¡United ¡States ¡

Tooth Decay: Prevalence (US 1999-2004) 100 ¡ 90 ¡ 80 ¡ Percentage ¡with ¡Dental ¡Caries ¡ 70 ¡ 60 ¡ 50 ¡ 40 ¡ 30 ¡ 20 ¡ 10 ¡ 0 ¡ 2-­‑11 ¡yrs ¡ 12-­‑19 ¡yrs ¡ 20-­‑34 ¡yrs ¡ 35-­‑49 ¡yrs ¡ 50-­‑64 ¡yrs ¡ Age ¡Group ¡

Progression of Tooth Decay Consume ¡ Acidogenic ¡ Produce ¡ ¡sugars ¡ ¡ bacteria ¡ lactic ¡acid ¡ during ¡ ¡ ¡in ¡ ¡ through ¡ mealtimes ¡ ¡ oral ¡cavity ¡ glycolysis ¡ Tooth ¡decay ¡ and ¡ cavitation ¡ DENTAL ¡CARIES ¡

The Culprit: Streptococcus mutans

Existing Solutions  Flossing ¡and ¡brushing ¡ regularly ¡  Water ¡fluoridation ¡  Sealants ¡  Dental ¡fillings ¡  Current ¡solutions ¡are ¡ costly, ¡require ¡too ¡much ¡ effort, ¡or ¡are ¡not ¡enough. ¡ ¡

Possible SynBio Solution  Beneficial ¡bacteria ¡native ¡to ¡oral ¡biome ¡have ¡developed ¡ arginine ¡deiminase ¡(AD) ¡system ¡  AD ¡system ¡produces ¡ammonia; ¡can ¡counteract ¡pH ¡drops ¡due ¡to ¡ lactic ¡acid ¡production ¡from ¡S. ¡mutans ¡  But ¡beneficial ¡bacteria ¡are ¡easily ¡suppressed ¡by ¡S. ¡mutans ¡  Solution: ¡isolate ¡AD ¡system ¡and ¡express ¡in ¡bacteria ¡not-­‑so-­‑ easily ¡antagonized ¡by ¡S. ¡mutans ¡  In ¡order ¡to ¡use ¡the ¡AD ¡system ¡safely ¡and ¡effectively, ¡we ¡need ¡ very ¡specific ¡transcriptional ¡control. ¡Creating ¡this ¡regulatory ¡ element ¡is ¡the ¡first ¡step. ¡ ¡

3 Requirements of Transcriptional Regulatory Element for AD system 1. ¡Must ¡have ¡low ¡expression ¡level ¡capabilities ¡ for ¡slight ¡pH ¡fluctuations ¡ 2. High ¡expression ¡levels ¡only ¡induced ¡when ¡ absolutely ¡necessary ¡at ¡meal ¡times ¡ 3. Able ¡to ¡place ¡pathway ¡on ¡single ¡plasmid ¡ without ¡burdening ¡cell, ¡but ¡still ¡having ¡bi-­‑ modal ¡expression ¡levels ¡

The Dual-State Promoter

The Dual-State Promoter Inducible ¡ Constitutive ¡ Spacer ¡ Gene ¡ RBS ¡ Promoter ¡ Promoter ¡

The Dual-State Promoter: pH pH ¡> ¡5.5 ¡ RNA ¡ polymerase ¡ pH-­‑Inducible ¡ Constitutive ¡ Spacer ¡ RBS ¡ Gene ¡ Promoter ¡ Promoter ¡ pH ¡< ¡5.5 ¡ RNA ¡ RNA ¡ RNA ¡ RNA ¡ polymerase ¡ polymerase ¡ polymerase ¡ polymerase ¡ pH-­‑Inducible ¡ Constitutive ¡ Spacer ¡ RBS ¡ Gene ¡ Promoter ¡ Promoter ¡

The Dual-State Promoter: Design

Identifying pH-Inducible Promoters  Demineralization ¡of ¡the ¡tooth ¡occurs ¡at ¡pH ¡5.5 ¡and ¡below ¡  So ¡it ¡is ¡necessary ¡to ¡identify ¡promoters ¡induced ¡at ¡pH ¡5.5 ¡

ASR: Acid-Shock RNA gene  Asr’s ¡expression ¡level ¡was ¡more ¡than ¡30 ¡times ¡higher ¡at ¡pH ¡5.5 ¡  According ¡to ¡Iient ¡et ¡al., ¡asr ¡is ¡a ¡gene ¡for ¡periplasmic ¡protein. ¡ ¡  The ¡mechanism ¡is ¡unclear. ¡However, ¡transcription ¡of ¡asr ¡is ¡affected ¡phoBR ¡ operon. ¡ ¡  Discrepancy ¡exists ¡in ¡location ¡of ¡start ¡codon ¡of ¡asr ¡gene. ¡Decided ¡to ¡test ¡ both ¡versions ¡of ¡promoter, ¡and ¡termed ¡them ¡asr ¡long ¡and ¡asr ¡short ¡

GadA: Glutamate Decarboxylase- based acid resistance system  Expression ¡ ¡of ¡GadA ¡gene ¡enables ¡the ¡survival ¡of ¡E. ¡coli ¡under ¡acid ¡stress ¡ conditions ¡  Transcriptional ¡control ¡over ¡the ¡gad ¡system ¡is ¡rather ¡complex. ¡ ¡  Strategy ¡was ¡to ¡characterize ¡the ¡gadA ¡promoter ¡empirically ¡by ¡measuring ¡ its ¡expression ¡of ¡GFP ¡  Motivation ¡was ¡to ¡improve ¡Univ. ¡Wisconsin-­‑Madison ¡iGEM ¡2010’s ¡ characterization ¡ ¡of ¡GadA ¡

The Need for A Spacer Region  RNA ¡polymerases ¡may ¡block ¡each ¡other ¡due ¡to ¡steric ¡  This ¡problem ¡might ¡be ¡avoided ¡if ¡ample ¡space ¡is ¡provided ¡ hindrance ¡if ¡no ¡spacer ¡region ¡is ¡included ¡ between ¡promoters. ¡ ¡ RNA ¡ RNA ¡ polymerase ¡ polymerase ¡ RNA ¡ RNA ¡ RNA ¡ polymerase ¡ polymerase ¡ polymerase ¡ pH ¡-­‑ ¡Inducible ¡ pH ¡-­‑ ¡Inducible ¡ Constitutive ¡ Constitutive ¡ Spacer ¡ RBS ¡ RBS ¡ Gene ¡ Gene ¡ Promoter ¡ Promoter ¡ Promoter ¡ Promoter ¡

Determining Spacer Length

Summary of Constructs pH ¡-­‑ ¡Inducible ¡ Constitutive ¡ Spacer ¡ RBS ¡ Gene ¡ Promoter ¡ Promoter ¡ • Asr ¡ • 0 ¡bp ¡ • GFP ¡ • Lpp-­‑RBS ¡ promoter ¡ ¡ ¡ ¡(Part ¡BBa_E0040) ¡ (short ¡& ¡long) ¡ • 64 ¡bp ¡ • GadA ¡ • 128 ¡bp ¡ ¡ promoter ¡  All ¡constructs ¡done ¡in ¡low-­‑copy ¡plasmid ¡pSB4A5 ¡(part ¡ ¡BBa_I50042) ¡  All ¡transcriptional ¡regulation ¡constructs ¡tested ¡with ¡GFP ¡in ¡E. ¡coli ¡to ¡ demonstrate ¡proof ¡of ¡principle. ¡ ¡

Single-State Constructs Achieved: Acronym: ¡ARG ¡ Asr ¡promoter ¡ RBS ¡ GFP ¡ Acronym: ¡GRG ¡ GadA ¡promoter ¡ RBS ¡ GFP ¡ Acronym: ¡LRG ¡ Lpp ¡promoter ¡ GFP ¡ RBS ¡  Isolating ¡single-­‑state ¡promoters ¡and ¡characterizing ¡ them ¡serve ¡as ¡important ¡controls ¡for ¡comparison ¡with ¡ their ¡behavior ¡when ¡these ¡promoters ¡are ¡placed ¡into ¡a ¡ dual-­‑state ¡construct ¡

Dual-State Constructs Achieved: GadA ¡promoter ¡ 128 ¡bp ¡spacer ¡ Lpp ¡promoter ¡ RBS ¡ GFP ¡ Acronym: ¡AL-­‑LRG ¡ Asr ¡promoter ¡ Lpp ¡promoter ¡ GFP ¡ RBS ¡ Tested ¡dual-­‑state ¡constructs: ¡ ¡ (long) ¡ Acronym: ¡AS ¡– ¡64 ¡-­‑LRG ¡ Asr ¡promoter ¡ 64bp ¡spacer ¡ Lpp ¡promoter ¡ RBS ¡ GFP ¡ (short) ¡ Acronym: ¡AL– ¡128 ¡-­‑LRG ¡ Asr ¡promoter ¡ 128 ¡bp ¡spacer ¡ Lpp ¡promoter ¡ GFP ¡ RBS ¡ (long) ¡

Methods and Results

Experimental Conditions ● M9 ¡media ¡ ¡ ● We ¡used ¡biologically ¡friendly ¡buffers ¡to ¡ minimize ¡toxicity ¡within ¡media ¡ Buffer ¡(Target ¡pH) ¡ pH ¡Range ¡ Concentration ¡ Citrate ¡(3.5) ¡ 3-­‑6.2 ¡ 50 ¡mM ¡ Citrate ¡(4.5) ¡ 3-­‑6.2 ¡ 50 ¡mM ¡ MES ¡(5.5) ¡ 5.5-­‑6.7 ¡ 100 ¡mM ¡ MOPS ¡(6.5) ¡ 6.5-­‑7.9 ¡ 150 ¡mM ¡ Tris ¡(7.5) ¡ 7.5-­‑9 ¡ 150 ¡mM ¡

Characterization of single promoter ● Objective: ¡Determine ¡a ¡baseline ¡depicting ¡ how ¡single ¡promoters ¡respond ¡to ¡pH ¡ ● Method: ¡ ¡ ○ Cells ¡grew ¡into ¡exponential ¡phase ¡in ¡M9 ¡ ○ Inoculate ¡into ¡pH ¡M9 ¡media ¡ ○ Test ¡fluorescence ¡in ¡plate ¡reader ¡ ○ Normalize ¡data ¡per ¡OD ¡(OD ¡data ¡included ¡in ¡ appendix) ¡ ○ Consider ¡cells ¡in ¡log ¡phase ¡

Acronyms Acronym ¡ Construct ¡ ARG ¡ Asr ¡– ¡RBS ¡-­‑GFP ¡ LRG ¡ Lpp ¡– ¡RGS ¡-­‑GFP ¡ GRG ¡ GadA ¡– ¡RBS ¡– ¡GFP ¡ AL ¡LRG ¡ Asr ¡Long ¡– ¡Lpp ¡– ¡RBS ¡– ¡GFP ¡ AL ¡128 ¡LRG ¡ Asr ¡Long ¡– ¡ ¡128 ¡bp ¡spacer ¡– ¡Lpp ¡– ¡RBS ¡-­‑ ¡GFP ¡ AS ¡64 ¡LRG ¡ Asr ¡Short ¡– ¡64 ¡bp ¡spacer ¡– ¡Lpp ¡– ¡RBS ¡-­‑ ¡GFP ¡

OD Measurements

Characterization of single promoter LRG: ¡Normalized ¡Fluorescence ¡ 2.0E+05 ¡ 1.8E+05 ¡ 1.6E+05 ¡ 1.4E+05 ¡ Fluorescence/OD ¡ 1.2E+05 ¡ 1.0E+05 ¡ 5.5 ¡100mM ¡ 6.5 ¡150mM ¡ 8.0E+04 ¡ 7.5 ¡150mM ¡ 6.0E+04 ¡ 4.0E+04 ¡ 2.0E+04 ¡ 0.0E+00 ¡ 2 ¡ 3 ¡ 4 ¡ 5 ¡ 6 ¡ 7 ¡ 8 ¡ Time ¡Post ¡Inoculation ¡(hrs) ¡