Northwestern U University iGEM iGEM 20 2013: 3: A n novel a - - PowerPoint PPT Presentation

Northwestern U University iGEM iGEM 20 2013: 3: A n novel a approach t to o

• ral h

health

The Problem: Tooth Decay

Tooth Decay: Quick Facts

36% ¡ 9% ¡ 5X ¡

• f ¡people ¡worldwide ¡have ¡dental ¡caries ¡in ¡

their ¡permanent ¡teeth. ¡

• f ¡all ¡babies ¡suffer ¡from ¡dental ¡caries. ¡

more ¡common ¡than ¡asthma ¡among ¡children ¡ in ¡the ¡United ¡States ¡

Tooth Decay: Prevalence (US 1999-2004)

0 ¡ 10 ¡ 20 ¡ 30 ¡ 40 ¡ 50 ¡ 60 ¡ 70 ¡ 80 ¡ 90 ¡ 100 ¡ 2-­‑11 ¡yrs ¡ 12-­‑19 ¡yrs ¡ 20-­‑34 ¡yrs ¡ 35-­‑49 ¡yrs ¡ 50-­‑64 ¡yrs ¡

Percentage ¡with ¡Dental ¡Caries ¡ Age ¡Group ¡

Progression of Tooth Decay

Acidogenic ¡ bacteria ¡ ¡in ¡ ¡

• ral ¡cavity ¡

Consume ¡ ¡sugars ¡ ¡ during ¡ ¡ mealtimes ¡ ¡ Produce ¡ lactic ¡acid ¡ through ¡ glycolysis ¡ Tooth ¡decay ¡ and ¡ cavitation ¡

DENTAL ¡CARIES ¡

The Culprit: Streptococcus mutans

Existing Solutions

• Flossing ¡and ¡brushing ¡

regularly ¡

• Water ¡fluoridation ¡
• Sealants ¡
• Dental ¡fillings ¡
• Current ¡solutions ¡are ¡

costly, ¡require ¡too ¡much ¡ effort, ¡or ¡are ¡not ¡enough. ¡ ¡

Possible SynBio Solution

• Beneficial ¡bacteria ¡native ¡to ¡oral ¡biome ¡have ¡developed ¡

arginine ¡deiminase ¡(AD) ¡system ¡

• AD ¡system ¡produces ¡ammonia; ¡can ¡counteract ¡pH ¡drops ¡due ¡to ¡

lactic ¡acid ¡production ¡from ¡S. ¡mutans ¡

• But ¡beneficial ¡bacteria ¡are ¡easily ¡suppressed ¡by ¡S. ¡mutans ¡
• Solution: ¡isolate ¡AD ¡system ¡and ¡express ¡in ¡bacteria ¡not-­‑so-­‑

easily ¡antagonized ¡by ¡S. ¡mutans ¡

• In ¡order ¡to ¡use ¡the ¡AD ¡system ¡safely ¡and ¡effectively, ¡we ¡need ¡

very ¡specific ¡transcriptional ¡control. ¡Creating ¡this ¡regulatory ¡ element ¡is ¡the ¡first ¡step. ¡ ¡

3 Requirements of Transcriptional Regulatory Element for AD system

1. ¡Must ¡have ¡low ¡expression ¡level ¡capabilities ¡ for ¡slight ¡pH ¡fluctuations ¡

• 2. High ¡expression ¡levels ¡only ¡induced ¡when ¡

absolutely ¡necessary ¡at ¡meal ¡times ¡

• 3. Able ¡to ¡place ¡pathway ¡on ¡single ¡plasmid ¡

without ¡burdening ¡cell, ¡but ¡still ¡having ¡bi-­‑ modal ¡expression ¡levels ¡

The Dual-State Promoter

The Dual-State Promoter

Inducible ¡ Promoter ¡ Spacer ¡ RBS ¡ Constitutive ¡ Promoter ¡ Gene ¡

The Dual-State Promoter: pH

pH-­‑Inducible ¡ Promoter ¡ Spacer ¡ RBS ¡ Constitutive ¡ Promoter ¡ Gene ¡ pH-­‑Inducible ¡ Promoter ¡ Spacer ¡ RBS ¡ Constitutive ¡ Promoter ¡ Gene ¡

pH ¡> ¡5.5 ¡ pH ¡< ¡5.5 ¡

RNA ¡ polymerase ¡ RNA ¡ polymerase ¡ RNA ¡ polymerase ¡ RNA ¡ polymerase ¡ RNA ¡ polymerase ¡

The Dual-State Promoter: Design

Identifying pH-Inducible Promoters

• Demineralization ¡of ¡the ¡tooth ¡occurs ¡at ¡pH ¡5.5 ¡and ¡below ¡
• So ¡it ¡is ¡necessary ¡to ¡identify ¡promoters ¡induced ¡at ¡pH ¡5.5 ¡

ASR: Acid-Shock RNA gene

• Asr’s ¡expression ¡level ¡was ¡more ¡than ¡30 ¡times ¡higher ¡at ¡pH ¡5.5 ¡
• According ¡to ¡Iient ¡et ¡al., ¡asr ¡is ¡a ¡gene ¡for ¡periplasmic ¡protein. ¡ ¡
• The ¡mechanism ¡is ¡unclear. ¡However, ¡transcription ¡of ¡asr ¡is ¡affected ¡phoBR ¡
• peron. ¡ ¡
• Discrepancy ¡exists ¡in ¡location ¡of ¡start ¡codon ¡of ¡asr ¡gene. ¡Decided ¡to ¡test ¡

both ¡versions ¡of ¡promoter, ¡and ¡termed ¡them ¡asr ¡long ¡and ¡asr ¡short ¡

GadA: Glutamate Decarboxylase- based acid resistance system

• Expression ¡ ¡of ¡GadA ¡gene ¡enables ¡the ¡survival ¡of ¡E. ¡coli ¡under ¡acid ¡stress ¡

conditions ¡

• Transcriptional ¡control ¡over ¡the ¡gad ¡system ¡is ¡rather ¡complex. ¡ ¡
• Strategy ¡was ¡to ¡characterize ¡the ¡gadA ¡promoter ¡empirically ¡by ¡measuring ¡

its ¡expression ¡of ¡GFP ¡

• Motivation ¡was ¡to ¡improve ¡Univ. ¡Wisconsin-­‑Madison ¡iGEM ¡2010’s ¡

characterization ¡ ¡of ¡GadA ¡

The Need for A Spacer Region

pH ¡-­‑ ¡Inducible ¡ Promoter ¡ RBS ¡ Constitutive ¡ Promoter ¡ Gene ¡

RNA ¡ polymerase ¡ RNA ¡ polymerase ¡ RNA ¡ polymerase ¡

pH ¡-­‑ ¡Inducible ¡ Promoter ¡ Spacer ¡ RBS ¡ Constitutive ¡ Promoter ¡ Gene ¡

RNA ¡ polymerase ¡ RNA ¡ polymerase ¡

• RNA ¡polymerases ¡may ¡block ¡each ¡other ¡due ¡to ¡steric ¡

hindrance ¡if ¡no ¡spacer ¡region ¡is ¡included ¡

• This ¡problem ¡might ¡be ¡avoided ¡if ¡ample ¡space ¡is ¡provided ¡

between ¡promoters. ¡ ¡

Determining Spacer Length

Summary of Constructs

pH ¡-­‑ ¡Inducible ¡ Promoter ¡ Spacer ¡ RBS ¡ Constitutive ¡ Promoter ¡ Gene ¡

• Asr ¡

promoter ¡ ¡ ¡ (short ¡& ¡long) ¡

• GadA ¡

promoter ¡

• 0 ¡bp ¡
• 64 ¡bp ¡
• 128 ¡bp ¡ ¡
• Lpp-­‑RBS ¡
• GFP ¡

¡(Part ¡BBa_E0040) ¡

• All ¡constructs ¡done ¡in ¡low-­‑copy ¡plasmid ¡pSB4A5 ¡(part ¡ ¡BBa_I50042) ¡
• All ¡transcriptional ¡regulation ¡constructs ¡tested ¡with ¡GFP ¡in ¡E. ¡coli ¡to ¡

demonstrate ¡proof ¡of ¡principle. ¡ ¡

Single-State Constructs Achieved:

Asr ¡promoter ¡ RBS ¡ GFP ¡ GadA ¡promoter ¡ RBS ¡ GFP ¡ RBS ¡ Lpp ¡promoter ¡ GFP ¡

• Isolating ¡single-­‑state ¡promoters ¡and ¡characterizing ¡

them ¡serve ¡as ¡important ¡controls ¡for ¡comparison ¡with ¡ their ¡behavior ¡when ¡these ¡promoters ¡are ¡placed ¡into ¡a ¡ dual-­‑state ¡construct ¡

Acronym: ¡ARG ¡ Acronym: ¡GRG ¡ Acronym: ¡LRG ¡

Tested ¡dual-­‑state ¡constructs: ¡ ¡

Dual-State Constructs Achieved:

Asr ¡promoter ¡ (long) ¡ RBS ¡ Lpp ¡promoter ¡ GFP ¡ Asr ¡promoter ¡ (short) ¡ 64bp ¡spacer ¡ RBS ¡ Lpp ¡promoter ¡ GFP ¡ Asr ¡promoter ¡ (long) ¡ 128 ¡bp ¡spacer ¡ RBS ¡ Lpp ¡promoter ¡ GFP ¡ GadA ¡promoter ¡ 128 ¡bp ¡spacer ¡ RBS ¡ Lpp ¡promoter ¡ GFP ¡ Acronym: ¡AL-­‑LRG ¡ Acronym: ¡AS ¡– ¡64 ¡-­‑LRG ¡ Acronym: ¡AL– ¡128 ¡-­‑LRG ¡

Methods and Results

Experimental Conditions

• M9 ¡media ¡ ¡
• We ¡used ¡biologically ¡friendly ¡buffers ¡to ¡

minimize ¡toxicity ¡within ¡media ¡

Buffer ¡(Target ¡pH) ¡ pH ¡Range ¡ Concentration ¡ Citrate ¡(3.5) ¡ 3-­‑6.2 ¡ 50 ¡mM ¡ Citrate ¡(4.5) ¡ 3-­‑6.2 ¡ 50 ¡mM ¡ MES ¡(5.5) ¡ 5.5-­‑6.7 ¡ 100 ¡mM ¡ MOPS ¡(6.5) ¡ 6.5-­‑7.9 ¡ 150 ¡mM ¡ Tris ¡(7.5) ¡ 7.5-­‑9 ¡ 150 ¡mM ¡

Characterization of single promoter

• Objective: ¡Determine ¡a ¡baseline ¡depicting ¡

how ¡single ¡promoters ¡respond ¡to ¡pH ¡

• Method: ¡ ¡

○ Cells ¡grew ¡into ¡exponential ¡phase ¡in ¡M9 ¡ ○ Inoculate ¡into ¡pH ¡M9 ¡media ¡ ○ Test ¡fluorescence ¡in ¡plate ¡reader ¡ ○ Normalize ¡data ¡per ¡OD ¡(OD ¡data ¡included ¡in ¡

appendix) ¡

○ Consider ¡cells ¡in ¡log ¡phase ¡

Acronyms

Acronym ¡ Construct ¡ ARG ¡ Asr ¡– ¡RBS ¡-­‑GFP ¡ LRG ¡ Lpp ¡– ¡RGS ¡-­‑GFP ¡ GRG ¡ GadA ¡– ¡RBS ¡– ¡GFP ¡ AL ¡LRG ¡ Asr ¡Long ¡– ¡Lpp ¡– ¡RBS ¡– ¡GFP ¡ AL ¡128 ¡LRG ¡ Asr ¡Long ¡– ¡ ¡128 ¡bp ¡spacer ¡– ¡Lpp ¡– ¡RBS ¡-­‑ ¡GFP ¡ AS ¡64 ¡LRG ¡ Asr ¡Short ¡– ¡64 ¡bp ¡spacer ¡– ¡Lpp ¡– ¡RBS ¡-­‑ ¡GFP ¡

OD Measurements

Characterization of single promoter

0.0E+00 ¡ 2.0E+04 ¡ 4.0E+04 ¡ 6.0E+04 ¡ 8.0E+04 ¡ 1.0E+05 ¡ 1.2E+05 ¡ 1.4E+05 ¡ 1.6E+05 ¡ 1.8E+05 ¡ 2.0E+05 ¡ 2 ¡ 3 ¡ 4 ¡ 5 ¡ 6 ¡ 7 ¡ 8 ¡

Fluorescence/OD ¡ Time ¡Post ¡Inoculation ¡(hrs) ¡

LRG: ¡Normalized ¡Fluorescence ¡

5.5 ¡100mM ¡ 6.5 ¡150mM ¡ 7.5 ¡150mM ¡

Characterization of single promoter

0.0E+00 ¡ 2.0E+02 ¡ 4.0E+02 ¡ 6.0E+02 ¡ 8.0E+02 ¡ 1.0E+03 ¡ 1.2E+03 ¡ 1.4E+03 ¡ 2 ¡ 3 ¡ 4 ¡ 5 ¡ 6 ¡ 7 ¡ 8 ¡

Fluorescence/OD ¡ Time ¡Post ¡Inoculation ¡(hrs) ¡

GRG: ¡Normalized ¡Fluorescence ¡

5.5 ¡ 6.5 ¡ 7.5 ¡

Characterization of single promoter

0.0E+00 ¡ 2.0E+04 ¡ 4.0E+04 ¡ 6.0E+04 ¡ 8.0E+04 ¡ 1.0E+05 ¡ 1.2E+05 ¡ 1.4E+05 ¡ 2 ¡ 3 ¡ 4 ¡ 5 ¡ 6 ¡ 7 ¡ 8 ¡

Fluorescence/OD ¡ Time ¡Post ¡Inoculation ¡(hrs) ¡

ARG: ¡Normalized ¡Fluorescence ¡

5.5 ¡ 6.5 ¡ 7.5 ¡

Characterization of dual state

• Objective: ¡Determine ¡whether ¡the ¡constructs ¡

will ¡display ¡the ¡dual ¡state ¡characteristic ¡that ¡ was ¡desired ¡

• Methods: ¡

○ Same ¡as ¡single ¡state ¡promoters ¡fluorescence ¡

assay ¡

Characterization of dual state

0.0E+00 ¡ 2.0E+04 ¡ 4.0E+04 ¡ 6.0E+04 ¡ 8.0E+04 ¡ 1.0E+05 ¡ 1.2E+05 ¡ 1.4E+05 ¡ 1.6E+05 ¡ 1.8E+05 ¡ 2.0E+05 ¡ 2 ¡ 3 ¡ 4 ¡ 5 ¡ 6 ¡ 7 ¡ 8 ¡

Fluorescence/OD ¡ Time ¡Post ¡Inoculation ¡(hrs) ¡

AL ¡LRG: ¡Normalized ¡Fluorescence ¡

5.5 ¡100mM ¡ 6.5 ¡150mM ¡ 7.5 ¡150mM ¡

0.E+00 ¡ 2.E+04 ¡ 4.E+04 ¡ 6.E+04 ¡ 8.E+04 ¡ 1.E+05 ¡ 1.E+05 ¡ 1.E+05 ¡ 2.E+05 ¡ 2.E+05 ¡ 2.E+05 ¡ 2 ¡ 3 ¡ 4 ¡ 5 ¡ 6 ¡ 7 ¡ 8 ¡

Fluorescence/OD ¡ Time ¡Post ¡Inoculation ¡(hrs) ¡

AL ¡128 ¡LRG: ¡Normalized ¡Fluorescence ¡

5.5 ¡100mM ¡ 6.5 ¡150mM ¡ 7.5 ¡150mM ¡

Characterization of dual state

0.0E+00 ¡ 2.0E+04 ¡ 4.0E+04 ¡ 6.0E+04 ¡ 8.0E+04 ¡ 1.0E+05 ¡ 1.2E+05 ¡ 1.4E+05 ¡ 1.6E+05 ¡ 1.8E+05 ¡ 2.0E+05 ¡ 2 ¡ 3 ¡ 4 ¡ 5 ¡ 6 ¡ 7 ¡ 8 ¡

Fluorescence/OD ¡ Time ¡Post ¡Inoculation ¡(hrs) ¡

AS ¡64 ¡LRG: ¡Normalized ¡Fluorescence ¡

5.5 ¡100mM ¡ 6.5 ¡150mM ¡ 7.5 ¡150mM ¡

Characterization of dual state

Conclusions

• We ¡have ¡created ¡dual ¡state ¡constructs ¡in ¡

which ¡both ¡promoters ¡are ¡active ¡

• However, ¡the ¡result ¡is ¡not ¡purely ¡additive ¡

○ Dual ¡state ¡promoter ¡appears ¡to ¡be ¡a ¡

superposition ¡of ¡the ¡both ¡inducible ¡and ¡ constitutive ¡promoter ¡

• Spacers ¡do ¡not ¡appear ¡to ¡be ¡important ¡
• Asr ¡short ¡is ¡the ¡promoter ¡region ¡

Next steps

• Test ¡change ¡in ¡pH ¡response ¡to ¡determine ¡

how ¡quickly ¡dual ¡state ¡promoter ¡can ¡turn ¡on ¡

• Complete ¡the ¡list ¡of ¡constructs ¡by ¡creating ¡all ¡
• f ¡the ¡dual ¡states ¡

○ Help ¡determine ¡the ¡importance ¡of ¡spacers ¡in ¡

such ¡construct ¡

Human Practices

Novel Approach

• Bacteria ¡eventually ¡incorporated ¡into ¡

bacterial ¡toothpaste ¡

– Consumer ¡hesitation ¡against ¡the ¡use ¡of ¡bacteria ¡ in ¡any ¡form ¡ Overcoming ¡ Ignorance ¡ ¡

Community Outreach!

Northwestern ¡University ¡ ¡ Center ¡For ¡Talent ¡Development ¡ Synthetic ¡Biology ¡ ¡ Background ¡ ¡ Presentation ¡of ¡Research ¡ ¡

Interaction and Project Ideas!

Brainstorming ¡Synthetic ¡ ¡ Biology ¡Project ¡Ideas! ¡ Safety ¡Implications! ¡

Acknowledgements

Faculty ¡Advisors: ¡ ¡ Mike ¡Jewett, ¡Ph. ¡D. ¡Chemical ¡Engineering, ¡Stanford ¡Uni. ¡ Josh ¡Leonard, ¡Ph.D. ¡Chemical ¡Engineering, ¡Univ. ¡of ¡California, ¡Berkeley ¡ John ¡Mordacq, ¡Ph.D. ¡Molecular ¡Biology, ¡Northwestern ¡Univ. ¡ Keith ¡E.J. ¡Tyo, ¡Ph.D., ¡M.S., ¡MIT ¡ Teaching ¡Assistant: ¡ ¡ Jessica ¡Perez, ¡Ph.D. ¡candidate ¡in ¡Chemical ¡Engineering ¡at ¡Northwestern ¡

• Univ. ¡

Special ¡Thanks ¡To: ¡ ¡ Lukas ¡Streich, ¡Research ¡Technologist, ¡Program ¡in ¡Biological ¡Sciences, ¡ Northwestern ¡Univ. ¡ Andrew ¡Scarpelli, ¡Interdepartmental ¡Biosciences ¡Graduate ¡Program, ¡ Northwestern ¡Univ. ¡

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Appendix

M9 Media

• Clear ¡solution ¡minimizes ¡media ¡interference ¡

in ¡fluorescence ¡assay ¡

• Contain ¡phosphate ¡compounds ¡

○ Good ¡buffer ¡from ¡pH ¡6-­‑8 ¡

• Is ¡this ¡enough ¡buffering ¡capacity ¡to ¡

counteract ¡accumulation ¡of ¡metabolism ¡by-­‑ products ¡from ¡normal ¡cell ¡growth? ¡ ¡ ¡

Buffering capacity of media

• Objective: ¡Determine ¡whether ¡more ¡buffer ¡is ¡

needed ¡to ¡keep ¡pH ¡constant ¡as ¡cells ¡grow ¡

• Method: ¡ ¡

○ Change ¡pH ¡of ¡media ¡with ¡concentrated ¡HCl ¡and ¡

NaOH ¡

○ Grew ¡in ¡overnight ¡tubes ¡ ○ Test ¡pH ¡before ¡and ¡after ¡

Buffering capacity of media

Buffering capacity of media

Buffering capacity of media

• Cells ¡grow ¡better ¡near ¡physiological ¡pH ¡(7.4) ¡
• More ¡buffers ¡are ¡needed ¡to ¡stabilize ¡pH ¡of ¡

media ¡because ¡with ¡just ¡M9 ¡buffering ¡ capacity, ¡pH ¡altered ¡by ¡at ¡least ¡1 ¡point ¡after ¡

• vernight ¡growth ¡

Data Analysis Method for Assays

• Optical ¡densities ¡curves ¡are ¡omitted, ¡and ¡

instead ¡fluorescence ¡normalized/OD ¡

○ Exponential ¡growth ¡occurs ¡between ¡t ¡= ¡2 ¡hr ¡and ¡

t ¡= ¡8 ¡hr. ¡We ¡will ¡only ¡consider ¡this ¡time ¡period ¡

○ Cells ¡under ¡condition ¡pH ¡= ¡3.5 ¡and ¡4.5 ¡did ¡not ¡

grow ¡significantly ¡for ¡us ¡to ¡accurately ¡get ¡ fluorescence ¡data ¡

Characterization of single promoter

• Asr ¡promoter ¡displayed ¡strong ¡preference ¡for ¡

pH ¡5.5 ¡than ¡other ¡pH ¡ranges ¡

• GadA ¡promoter ¡showed ¡no ¡preference ¡for ¡pH ¡ ¡

○ Normalized ¡fluorescence ¡is ¡very ¡similar ¡for ¡pH ¡

range ¡from ¡5.5-­‑7.5 ¡

○ Fluorescence ¡level ¡is ¡very ¡low ¡

• Lpp ¡promoter ¡showed ¡no ¡signs ¡of ¡pH ¡

preference ¡ ¡

• We ¡have ¡reconfirmed ¡Asr ¡promoter’s ¡strong ¡pH ¡

dependence ¡ ¡

• All ¡three ¡dual ¡states ¡show ¡difference ¡in ¡fluorescence ¡

level ¡between ¡pH ¡5.5 ¡and ¡6.5 ¡

○ Asr ¡promoter ¡must ¡be ¡activated ¡

• All ¡three ¡dual ¡states ¡show ¡higher ¡level ¡of ¡

fluorescence ¡than ¡with ¡the ¡Asr ¡promoter ¡alone ¡

○ Lpp ¡promoter ¡must ¡be ¡activated ¡

• Construct ¡displays ¡dual ¡state ¡characteristic ¡

Characterization of dual state

Modeling

Objective

• Develop ¡a ¡model ¡that ¡reflects ¡the ¡pH ¡

dependency ¡of ¡Asr ¡promoter ¡

• Determine ¡relative ¡order ¡of ¡magnitude ¡

difference ¡between ¡within ¡the ¡mechanism ¡

○ Inform ¡our ¡interpretation ¡of ¡the ¡dual ¡state ¡

construct ¡by ¡ ¡

Modeling pH promoter

• Simplified ¡

regulation ¡elements ¡ ¡

• Simplistic ¡view ¡

allows ¡for ¡direct ¡ comparison ¡ between ¡promoters ¡

• The ¡rate ¡of ¡

polymerase ¡binding ¡ to ¡promoter ¡to ¡form ¡ a ¡polymerase-­‑ promoter ¡complex ¡is ¡ made ¡a ¡function ¡of ¡ pH ¡

• Decided ¡to ¡use ¡a ¡bell ¡

curve ¡ ¡

Modeling pH promoter

Modeling pH promoter