Colorado State University iGEM 2013 Adriana Collings, Ryan - - PowerPoint PPT Presentation

Colorado State University iGEM 2013

Adriana Collings, Ryan Henderson, Lindsey Nevin, Colin Sempeck, and Guy Stewart

Saturday, October 5, 2013 iGEM 2013 North American Regional Jamboree University of Toronto Toronto, Ontario, Canada

Projects

Projects

• Bio-Desalination

― Idea: Create an organism capable of removing the salt from seawater, making it potable

• Self-Inflating Bike Tire

― Idea: Use an organism in a unique way, for a creative, user friendly product

• Gluten-Free Beer (continuation/perfection)

― Idea: Continue the work of last year’s team’s project and perfect the concept

Bio-Desalination

Why ¡Desalina,on? ¡

• In ¡2002 ¡the ¡world ¡had ¡12,500 ¡desalina4on ¡plants1 ¡
• These ¡plants ¡were ¡able ¡to ¡produce ¡14 ¡million ¡cubic1 ¡

meters/day ¡(3.69 ¡x10^6 ¡gallons/day) ¡of ¡freshwater. ¡

• This ¡amount ¡of ¡freshwater ¡accounts ¡for ¡only ¡1% ¡of ¡

the ¡world's ¡consump4on. ¡

• It ¡is ¡the ¡energy ¡cost ¡of ¡desalina4on ¡that ¡prevents ¡

the ¡process ¡from ¡being ¡used ¡more ¡oKen. ¡ ¡

• Sodium ¡is ¡the ¡main ¡form ¡of ¡salt ¡in ¡seawater ¡and ¡is ¡
• ur ¡main ¡concern. ¡

Introduc,on ¡

• Using ¡yeast ¡(Saccharomyces ¡cerevisiae), ¡we ¡

theorize ¡a ¡mechanism ¡to ¡sequester ¡salt ¡from ¡ salt ¡water. ¡ ¡

• We ¡hope ¡to ¡modify ¡yeast’s ¡transporter ¡

systems ¡to ¡direct ¡the ¡uptake ¡of ¡salt ¡to ¡the ¡ yeast ¡vacuole. ¡

Approach ¡

NHA1 ¡

• Transmembrane, ¡high ¡

affinity ¡Na+/H+ ¡ an4porter ¡

• Wild ¡type, ¡located ¡in ¡

plasma ¡membrane ¡

• Goal: ¡Insert ¡vacuolar ¡

membrane ¡targe4ng ¡ sequence ¡onto ¡gene ¡ to ¡relocate ¡it ¡

NHX1 ¡

• Transmembrane, ¡low ¡

affinity ¡Na+/H+ ¡ an4porter ¡

• Wild ¡type, ¡located ¡in ¡

endosomal ¡ membranes ¡

• Goal: ¡Overexpress ¡to ¡

increase ¡capacity ¡to ¡ pump ¡ions ¡into ¡ vacuole(s) ¡

ENA1/2/5 ¡ ¡

• Transmembrane, ¡high ¡

affinity ¡Na+-­‑ATPase ¡

• Wild ¡type, ¡located ¡in ¡

plasma ¡membrane ¡

• Goal: ¡Create ¡dele4on ¡

strain, ¡to ¡hinder ¡the ¡ ability ¡to ¡remove ¡ions ¡ from ¡within ¡the ¡cell ¡ ¡

ChR2/ChEF ¡

• Channelrhodopsin ¡protein. ¡

Transmembrane ¡light ¡ac4vated ¡ ion ¡channel. ¡

• Endogenous ¡to ¡unicellular ¡algae; ¡

used ¡for ¡phototaxis ¡

• Goal: ¡Engineer ¡protein ¡into ¡yeast ¡

plasma ¡membrane ¡to ¡allow ¡salt ¡ ion ¡intake ¡to ¡be ¡controlled ¡by ¡ specific ¡light ¡wavelength. ¡

Results/Future ¡Work ¡

• Failure ¡of ¡gBlock ¡gibson ¡assembly ¡
• Using ¡PCR ¡to ¡place ¡proteins ¡in ¡biobrick ¡format ¡

Self-­‑Infla,ng ¡Bicycle ¡Tire ¡

Introduc,on ¡

• Gene ¡of ¡interest: ¡ADH2 ¡(Alcohol ¡

Dehydrogenase ¡II) ¡

• What ¡does ¡it ¡do? ¡ ¡

─ ADH2 ¡is ¡a ¡gene ¡in ¡yeast ¡that ¡causes ¡the ¡yeast ¡to ¡ consume ¡ethanol ¡as ¡its ¡main ¡carbon ¡source ¡in ¡ the ¡absence ¡of ¡glucose. ¡ ─ ADH1 ¡and ¡ADH3-­‑5 ¡all ¡help ¡to ¡break ¡down ¡ acetaldehyde ¡into ¡ethanol. ¡

Theory ¡

Pressure ¡Measurements ¡

• 26” Bicycle Tire - measured pressure using a Fluke

Multimeter and a pressure transducer attached to the de-cored stem of the tire tube.

Future ¡Work ¡

• Op4miza4on ¡of ¡data ¡collec4on ¡methods ¡
• Visible ¡indicator ¡of ¡depleted ¡glucose ¡

− UAS2-­‑RFP ¡plasmid ¡transforma4on ¡ ¡

Genetically Modified Yeast Breaks Down Gluten in Beer

• 1 in 105 people in the United States
• Autoimmune disorder
• Affects the digestive system
• Severe reaction when exposed to gluten,

a protein found in wheat, rye, and barley.

• Antigenicity of gluten due to proline and glutamine rich

peptides

Celiac ¡Disease ¡

Celiac ¡Disease ¡

• Yeast ¡enter ¡Fermenter ¡
• pH ¡5.2-­‑5.5 ¡

¡1. ¡Lag ¡phase ¡ ¡2. ¡Growth ¡phase ¡ ¡3. ¡Fermenta4on ¡phase ¡ ¡4. ¡Sedimenta4on ¡phase ¡

Gluten ¡and ¡Beer ¡

• Aspergillus ¡niger-­‑prolyl ¡endoprotease(AN-­‑PEP) ¡

– Cleaves ¡aKer ¡proline ¡residues ¡ – Stable ¡at ¡low ¡pH ¡ – Used ¡in ¡Brewers ¡Clarex ¡ – Protected ¡by ¡patent ¡

• KumaMax ¡ ¡

– 2011 ¡UW ¡iGEM ¡team ¡

– pH ¡4 ¡ – Cleaved ¡PQPQLP ¡pep4de ¡ – Codon ¡bias ¡(bacterial ¡to ¡yeast) ¡ – SpeK ¡

Enzymes ¡

• A. niger

labmed.ucsf.edu Kumamolisin-As

http://2011.igem.org/Team:Washington

• Ma4ng ¡Factor ¡alpha ¡(MF-­‑α) ¡

– Tag’s ¡sequence ¡was ¡placed ¡directly ¡upstream ¡of ¡SpeK. ¡ – The ¡DNA ¡synthesized ¡by ¡IDT, ¡but ¡we ¡were ¡also ¡able ¡to ¡ extract ¡it ¡from ¡the ¡yeast ¡genome ¡by ¡PCR. ¡

Secre,on ¡

Summary ¡of ¡the ¡System ¡

• Expression vectors

– pCM189: ¡centromeric ¡yeast ¡plasmid, ¡low ¡copy ¡number, ¡ tet-­‑off ¡promoter ¡ – pCM190: ¡episomal ¡yeast ¡plasmid, ¡high ¡copy ¡number, ¡tet-­‑

• ff ¡promoter ¡

– Integra4ve ¡plasmid ¡constructed ¡by ¡adding ¡the ¡resistance ¡ gene ¡for ¡gene4cin ¡to ¡pCM189/MF-­‑alpha/SpeK. ¡

Assembly ¡of ¡the ¡System ¡

• Equinox ¡Donated ¡Wort ¡
• Yeast ¡carrying ¡pCM189+MF-α+SpeK
• Tet-­‑off ¡promoter ¡
• Test ¡batches ¡of ¡beer ¡

– Lab ¡strain ¡(tet) ¡ – Lab ¡strain ¡(no ¡tet) ¡ – Industrial ¡strain ¡(tet) ¡ – Industrial ¡strain ¡(no ¡tet) ¡ – Unaltered ¡wort ¡

• ELISA ¡

Results ¡

pct-1.com

Results ¡

Wort LS (tet) LS (no tet) IS (tet) IS (no tet)

20 40 60 80 100 120 140 1 2 3 4 5 Gliadin (ng/ml) Sample

Concentration of Gliadin in Wort

LS=lab strain, IS=industrial strain

• ELISA ¡ ¡demonstrated ¡that ¡the ¡engineered ¡yeast ¡were ¡capable ¡
• f ¡breaking ¡down ¡gluten ¡during ¡fermenta4on ¡ ¡
• Further ¡work: ¡ ¡

– op4miza4on ¡of ¡the ¡enzyme ¡ ¡ – Inser4on ¡of ¡integra4ve ¡plasmid ¡into ¡brewing ¡yeast ¡ ¡

Proof ¡of ¡Concept ¡

New Belgium Brewery

Op,mized ¡Enzyme ¡

http://2011.igem.org/Team:Washington

• Results ¡
• Prepared ¡malt ¡wort ¡with ¡a ¡specific ¡gravity ¡of ¡1050 ¡
• Beer ¡was ¡brewed ¡in ¡12 ¡different ¡fermenta4on ¡vessels ¡

– 3 ¡contained ¡wort ¡inoculated ¡with ¡industrial ¡brewing ¡ yeast ¡strain ¡WLP007 ¡ – 3 ¡contained ¡wort ¡inoculated ¡with ¡pCSU4 ¡integrated ¡ into ¡WLP007 ¡ – 3 ¡contained ¡wort ¡inoculated ¡with ¡pCSU6 ¡integrated ¡ into ¡WLP007 ¡ – 3 ¡of ¡contained ¡inoculated ¡with ¡pCSU6 ¡integrated ¡into ¡ WLP007 ¡in ¡the ¡presence ¡of ¡Doxycycline ¡ – Unaltered ¡wort ¡control ¡– ¡Uninoculated ¡malt ¡extract ¡

Results ¡ ¡

• Though ¡4me ¡did ¡not ¡permit, ¡our ¡next ¡step ¡is ¡to ¡

quan4fy ¡the ¡gluten ¡content ¡within ¡the ¡hydrolyzed ¡wort ¡ samples ¡using ¡a ¡2nd ¡Genera4on ¡Compe44ve ¡Gliadin ¡

• ELISA. ¡Depending ¡on ¡the ¡op4mized ¡yeast’s ¡ability ¡to ¡

degrade ¡enough ¡gluten ¡to ¡be ¡labeled ¡“Gluten ¡Free”, ¡ future ¡work ¡would ¡include: ¡

– Auaching ¡high ¡expression ¡promoters ¡to ¡the ¡protease ¡ – Integra4ng ¡mul4ple ¡copies ¡of ¡the ¡plasmid ¡into ¡WLP007 ¡ – Integra4ng ¡plasmids ¡into ¡mul4ple ¡industrial ¡brewing ¡yeast ¡ strains ¡to ¡determine ¡op4mal ¡yeast ¡strain ¡

Future ¡work ¡

• Saccharomyces ¡cerevisiae ¡and ¡E.coli ¡K-­‑12 ¡were ¡the ¡organisms ¡used, ¡which ¡

are ¡exempt ¡Host-­‑Vector ¡Systems ¡as ¡per ¡EXEMPTIONS ¡UNDER ¡SECTION ¡III-­‑ F-­‑6 ¡of ¡the ¡NIH ¡Guidelines. ¡ ¡

• BS ¡L-­‑1 ¡safety ¡prac4ces ¡were ¡enforced ¡to ¡ensure ¡proper ¡safety ¡and ¡
• containment. ¡ ¡
• Inspec4on ¡and ¡approval ¡of ¡the ¡laboratory ¡by ¡ ¡

¡University ¡Director ¡of ¡Biosafety, ¡Dr. ¡Bob ¡Ellis. ¡

• Alcohol ¡consumed ¡only ¡by ¡members ¡at ¡least ¡21 ¡yrs ¡
• Consump4on ¡restricted ¡to ¡taste-­‑tes4ng ¡

Safety ¡

Acknowledgements ¡

We ¡thank ¡CSU ¡faculty ¡members ¡Dr. ¡Patrick ¡ Shipman, ¡Dr. ¡Lucas ¡Argueso, ¡Dr. ¡San4ago ¡Di ¡ Pietro, ¡Dr. ¡Mauricio ¡Antunes, ¡Philip ¡Fox, ¡Dr. ¡ Laurie ¡Stargell ¡and ¡Tim ¡Gonzalez ¡for ¡all ¡their ¡ aid ¡this ¡summer. ¡

Sponsors ¡

References ¡

1Perlman, ¡Howard. ¡"Saline ¡Water: ¡Desalina4on." ¡Desalina4on: ¡Drink ¡a ¡Cup ¡of ¡Seawater? ¡U.S. ¡Geological ¡

Survey, ¡19 ¡Aug. ¡2013. ¡Web. ¡12 ¡Sept. ¡2013. ¡