Metagenomics using Next Genera2on Sequencing technology - PowerPoint PPT Presentation

10. OIE Seminar, Berlin 07 th June 2013 Metagenomics ¡using ¡Next ¡Genera2on ¡Sequencing ¡ technology ¡ ¡ Mar2n ¡Beer, ¡Bernd ¡Hoffmann, ¡Ma=hias ¡Scheuch, ¡Dirk ¡Höper ¡ ¡ ¡ C ARGE FLI

Preview ¡ � ¡ Introduc2on ¡– ¡pathogen ¡detec2on ¡ � ¡The ¡metagenomic ¡approach ¡ � ¡Challenges ¡of ¡metagenomics ¡ � ¡From ¡sample ¡prepara2on ¡to ¡NGS ¡to ¡data ¡analysis ¡ � ¡Summary ¡and ¡conclusions ¡ ¡ Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

BTV, SBV and Usutu outbreak as „indicator “ West Nile Virus How ¡to ¡detect ¡the ¡unexpected ¡ or ¡unknown? ¡ EHDV ASFV CCHFV African Horse sickness Rift Valley Fever ?????? Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

What ¡is ¡Metagenomics ¡(1)? ¡ The basic definition of metagenomics is the analysis of genomic DNA from a whole community. Gilbert JA, Dupont CL (2011). Ann Rev Mar Sci 3: 347-71. 10.1146/annurev-marine-120709-142811 Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

What ¡is ¡Metagenomics ¡(2)? ¡ Metagenomics ¡is ¡the ¡applica0on ¡of ¡ modern ¡genomics ¡ techniques ¡ to ¡the ¡study ¡of ¡communi0es ¡of ¡microbial ¡ organisms ¡directly ¡in ¡their ¡natural ¡environments, ¡ bypassing ¡the ¡need ¡for ¡isola2on ¡and ¡lab ¡cul2va2on ¡ of ¡ individual ¡species. ¡ ¡ Chen ¡K, ¡Pachter ¡L ¡(2005). ¡PLoS ¡Comput ¡Biol ¡1(2): ¡e24. ¡doi:10.1371/journal.pcbi.0010024 ¡ Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

Why ¡Do ¡Metagenomic ¡Pathogen ¡Detec2on ¡(1)? ¡ Because every causative agent of infectious disease relies on nucleic acids (NAs) both for its genome and gene expression (only known exception so far are transmissible spongiform encephalopathies) AND Modern shotgun sequencing methods detect all NAs in a given sample with ± equal probability

Why ¡Do ¡Metagenomic ¡Pathogen ¡Detec2on ¡(2)? ¡ Suppose ¡the ¡following ¡ • We ¡have ¡animals ¡suffering ¡from ¡an ¡unknown ¡disease ¡ • Standard ¡targeted ¡diagnos0cs ¡do ¡not ¡reveal ¡the ¡ causa0ve ¡agent ¡ • We ¡expect ¡as ¡the ¡causa2ve ¡agent ¡a ¡pathogen ¡ containing ¡nucleic ¡acids ¡ → ¡it ¡is ¡straighQorward ¡to ¡comprehensively ¡sequence ¡ total ¡NAs ¡from ¡these ¡animals ¡to ¡detect ¡the ¡pathogen ¡

Why ¡Do ¡Metagenomic ¡Pathogen ¡Detec2on ¡(3)? ¡ Because ¡it ¡works! ¡

Metagenomics ¡Workflow ¡ Sample ¡! ¡ NGS ¡method ¡! ¡ Data ¡analysis! ¡ Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

Next generation sequencing (NGS) For example: Roche Genome Sequencer Gs flex (up to 500 Mio. bp per run) - Read: short fragments (80 to 500 bp) - Contig: larger sequence pieces assembled from reads

Key ¡Issues ¡for ¡Diagnos2c ¡Metagenomics ¡ • Pathogen ¡detec0on ¡in ¡a ¡metagenomic ¡dataset ¡is ¡ finding ¡the ¡needle ¡in ¡a ¡haystack ¡ Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

Key ¡Issues ¡for ¡Diagnos2c ¡Metagenomics ¡ Example ¡ • CaZle ¡genome: ¡2.97 ¡Gbp ¡ • pCV2 ¡genome: ¡1768 ¡b ¡ ¡ → ¡mass ¡ra0o ¡pCV2:CaZle ¡= ¡1:1,679,864 ¡ ¡ Zoom ¡1000 ¡X ¡

Key ¡Issues ¡for ¡Diagnos2c ¡Metagenomics ¡ Sensi0vity ¡is ¡determined ¡by ¡ • the ¡ra0o ¡of ¡the ¡genome ¡sizes ¡(or ¡in ¡the ¡RNA ¡case ¡ genome/total ¡RNA) ¡and ¡ • the ¡copy ¡numbers ¡of ¡the ¡genomes ¡(RNA ¡molecules) ¡ 1. ¡Sensi2vity ¡can ¡easily ¡be ¡scaled ¡up ¡by ¡simply ¡producing ¡ more ¡sequences ¡to ¡yield ¡at ¡least ¡one ¡pathogen ¡read ¡ 2. ¡Choosing ¡the ¡appropriate ¡sample ¡material, ¡i.e. ¡material ¡ with ¡high ¡loads ¡of ¡pathogen ¡(and ¡minimum ¡host ¡genome) ¡ is ¡crucial ¡ ¡ Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

Key ¡Issues ¡for ¡Diagnos2c ¡Metagenomics ¡ • Huge ¡datasets ¡are ¡generated, ¡resul2ng ¡in ¡complex ¡ and ¡2me ¡consuming ¡data ¡analysis ¡ • Classifica0on ¡of ¡the ¡sequences ¡relies ¡on ¡finding ¡ similari0es ¡to ¡known ¡pathogens ¡ • Limited ¡read ¡length ¡(with ¡some ¡instruments) ¡ impedes ¡data ¡analysis ¡ • How ¡to ¡deal ¡with ¡unclassifiable ¡sequences: ¡are ¡they ¡ random ¡ar0ficial ¡or ¡natural ¡but ¡unknown ¡sequences? ¡ These ¡sequences ¡require ¡intense ¡manual ¡evalua2on ¡ Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

Sample ¡Choice ¡– ¡Sample ¡Prepara2on ¡ Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

Sample ¡Choice ¡ -­‑ Body ¡fluid/0ssue ¡material? ¡ -­‑ Preferably ¡the ¡matrix ¡with ¡the ¡ lowest ¡quan2ty ¡of ¡host ¡ nucleic ¡acids ¡(NA) ¡ -­‑ The ¡highest ¡possible ¡quan0ty ¡of ¡pathogen ¡NA ¡ -­‑ DNA ¡or ¡ RNA ? ¡ -­‑ RNA ¡is ¡to ¡be ¡preferred ¡over ¡DNA ¡because ¡all ¡replica0ng ¡ viruses ¡generate ¡RNA ¡but ¡only ¡a ¡few ¡generate ¡DNA ¡ Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

Sample ¡Choice ¡ Example ¡1 ¡ -­‑ Fish ¡are ¡dying ¡for ¡unknown ¡reason ¡ -­‑ Sample ¡from ¡metabolically ¡highly ¡ac0ve ¡gill ¡0ssue ¡ -­‑ DNA ¡virus ¡expected ¡ -­‑ Sequencing ¡library ¡from ¡RNA ¡ -­‑ 229,000 ¡sequencing ¡reads ¡ -­‑ 2 ¡reads ¡RNA ¡virus ¡( 0.00087% ) ¡

Sample ¡Choice ¡ Example ¡2 ¡ -­‑ sequencing ¡RNA ¡isolated ¡from ¡serum ¡from ¡BVDV ¡ persistently ¡infected ¡caZle ¡ -­‑ 5% ¡viral ¡reads ¡

Sample ¡Choice ¡ Example ¡3 ¡ -­‑ Schmallenberg ¡virus ¡samples ¡RNA ¡from ¡serum ¡ -­‑ 7/27,000 ¡( 0.026% ) ¡reads ¡orthobunyavirus ¡ -­‑ Library ¡only ¡sufficient ¡to ¡yield ¡a ¡total ¡of ¡approx. ¡ 85,000 ¡reads ¡

Sample ¡Prepara2on ¡

Sample ¡Prepara2on ¡ -­‑ Usually ¡high ¡background ¡of ¡host ¡nucleic ¡acids ¡ -­‑ Different ¡nuclease ¡diges0on ¡dependent ¡techniques ¡ for ¡the ¡deple0on ¡of ¡these: ¡ -­‑ DNase ¡SISPA ¡ -­‑ Vidisca ¡ -­‑ Kits ¡for ¡sample ¡normaliza2on ¡ ¡ -­‑ BUT: ¡nuclease ¡digest ¡means ¡risk ¡of ¡irreversible ¡ informa0on ¡loss ¡

Sequencing ¡

Sequencing ¡ -­‑ Various ¡technologies ¡available ¡ -­‑ Read ¡length ¡is ¡a ¡cri2cal ¡determinant ¡ -­‑ Sanger ¡with ¡too ¡low ¡throughput ¡ -­‑ Some ¡plaQorms ¡with ¡high ¡throughput ¡require ¡long ¡ sequencing ¡0me ¡ ¡ For ¡diagnos0cs ¡ 2me ¡necessary ¡0ll ¡comple0on ¡may ¡be ¡ an ¡issue ¡ ¡

Sequencing: ¡Impact ¡of ¡Read ¡Length ¡ Success ¡of ¡read ¡classifica0on ¡depending ¡on ¡read ¡length ¡ (GCReoV-­‑Daten ¡Histogramm) ¡

Sequencing: ¡Impact ¡of ¡Read ¡Length ¡ What ¡if ¡… ¡the ¡Schmallenberg-­‑virus ¡sequencing ¡reads ¡ had ¡been ¡shorter? ¡ Long ¡reads ¡ Short ¡Reads ¡ Mean ¡length ¡ 315 ¡ 96 ¡ Total ¡No. ¡reads ¡ 27420 ¡ 27420 ¡ No. ¡classified ¡reads ¡ 26128 ¡ 25310 ¡ No. ¡Orthobunyavirus ¡hits ¡ 7 ¡ 1 ¡ Similarity ¡with ¡subject ¡sequence ¡ 68.37 ¡% ¡-­‑ ¡95.60 ¡% ¡ 98.68 ¡ ¡% ¡ No. ¡unclassified ¡reads ¡ 1292 ¡ 2110 ¡

Data ¡Analysis ¡

Data ¡Analysis ¡ ¡ A ¡known ¡virus/bacterium ¡with ¡a ¡ sufficiently ¡similar ¡ genome ¡or ¡amino ¡acid ¡sequence ¡is ¡necessary ¡ ¡ The ¡more ¡sequences ¡are ¡available ¡for ¡diverse ¡viruses/ ¡ organisms, ¡the ¡higher ¡the ¡chance ¡gets ¡to ¡iden0fy ¡a ¡ novel/unexpected ¡pathogen ¡by ¡sequence ¡comparison ¡

Data ¡Analysis ¡ ¡ -­‑ A ¡bigger ¡database ¡causes ¡longer ¡computa0on ¡to ¡find ¡ the ¡most ¡similar ¡sequence ¡ -­‑ Too ¡small ¡databases ¡produce ¡significant ¡hits ¡that ¡are ¡ not ¡meaningful! ¡ -­‑ The ¡stringency ¡of ¡the ¡search ¡algorithm ¡is ¡crucial ¡

Metagenomic analysis