Metagenomics using Next Genera2on Sequencing technology - - PowerPoint PPT Presentation

CARGE FLI

• 10. OIE Seminar, Berlin 07th June 2013

Metagenomics ¡using ¡Next ¡Genera2on ¡Sequencing ¡ technology ¡ ¡

Mar2n ¡Beer, ¡Bernd ¡Hoffmann, ¡Ma=hias ¡Scheuch, ¡Dirk ¡Höper ¡

¡ ¡

Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

Preview ¡

¡Introduc2on ¡– ¡pathogen ¡detec2on ¡ ¡The ¡metagenomic ¡approach ¡ ¡Challenges ¡of ¡metagenomics ¡ ¡From ¡sample ¡prepara2on ¡to ¡NGS ¡to ¡data ¡analysis ¡ ¡Summary ¡and ¡conclusions ¡ ¡

BTV, SBV and Usutu outbreak as „indicator“

African Horse sickness

West Nile Virus Rift Valley Fever

EHDV ASFV CCHFV ??????

Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

How ¡to ¡detect ¡the ¡unexpected ¡

• r ¡unknown? ¡

The basic definition of metagenomics is the analysis of genomic DNA from a whole community.

Gilbert JA, Dupont CL (2011). Ann Rev Mar Sci 3: 347-71. 10.1146/annurev-marine-120709-142811

What ¡is ¡Metagenomics ¡(1)? ¡

Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

What ¡is ¡Metagenomics ¡(2)? ¡ Metagenomics ¡is ¡the ¡applica0on ¡of ¡modern ¡genomics ¡ techniques ¡to ¡the ¡study ¡of ¡communi0es ¡of ¡microbial ¡

• rganisms ¡directly ¡in ¡their ¡natural ¡environments, ¡

bypassing ¡the ¡need ¡for ¡isola2on ¡and ¡lab ¡cul2va2on ¡of ¡ individual ¡species. ¡ ¡

Chen ¡K, ¡Pachter ¡L ¡(2005). ¡PLoS ¡Comput ¡Biol ¡1(2): ¡e24. ¡doi:10.1371/journal.pcbi.0010024 ¡

Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

Why ¡Do ¡Metagenomic ¡Pathogen ¡Detec2on ¡(1)? ¡

Because every causative agent of infectious disease relies on nucleic acids (NAs) both for its genome and gene expression (only known exception so far are transmissible spongiform encephalopathies) AND Modern shotgun sequencing methods detect all NAs in a given sample with ± equal probability

Why ¡Do ¡Metagenomic ¡Pathogen ¡Detec2on ¡(2)? ¡ Suppose ¡the ¡following ¡

• We ¡have ¡animals ¡suffering ¡from ¡an ¡unknown ¡disease ¡
• Standard ¡targeted ¡diagnos0cs ¡do ¡not ¡reveal ¡the ¡

causa0ve ¡agent ¡

• We ¡expect ¡as ¡the ¡causa2ve ¡agent ¡a ¡pathogen ¡

containing ¡nucleic ¡acids ¡ → ¡it ¡is ¡straighQorward ¡to ¡comprehensively ¡sequence ¡ total ¡NAs ¡from ¡these ¡animals ¡to ¡detect ¡the ¡pathogen ¡

Why ¡Do ¡Metagenomic ¡Pathogen ¡Detec2on ¡(3)? ¡

Because ¡it ¡works! ¡

Metagenomics ¡Workflow ¡

Sample ¡! ¡ NGS ¡method ¡! ¡ Data ¡analysis! ¡

Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

For example: Roche Genome Sequencer Gs flex (up to 500 Mio. bp per run)

Next generation sequencing (NGS)

• Read: short fragments (80 to 500 bp)
• Contig: larger sequence pieces assembled from reads

Key ¡Issues ¡for ¡Diagnos2c ¡Metagenomics ¡

• Pathogen ¡detec0on ¡in ¡a ¡metagenomic ¡dataset ¡is ¡

finding ¡the ¡needle ¡in ¡a ¡haystack ¡

Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

Zoom ¡1000 ¡X ¡

Key ¡Issues ¡for ¡Diagnos2c ¡Metagenomics ¡

Example ¡

• CaZle ¡genome: ¡2.97 ¡Gbp ¡
• pCV2 ¡genome: ¡1768 ¡b ¡

¡ → ¡mass ¡ra0o ¡pCV2:CaZle ¡= ¡1:1,679,864 ¡

¡

Key ¡Issues ¡for ¡Diagnos2c ¡Metagenomics ¡

Sensi0vity ¡is ¡determined ¡by ¡

• the ¡ra0o ¡of ¡the ¡genome ¡sizes ¡(or ¡in ¡the ¡RNA ¡case ¡

genome/total ¡RNA) ¡and ¡

• the ¡copy ¡numbers ¡of ¡the ¡genomes ¡(RNA ¡molecules) ¡
• 1. ¡Sensi2vity ¡can ¡easily ¡be ¡scaled ¡up ¡by ¡simply ¡producing ¡

more ¡sequences ¡to ¡yield ¡at ¡least ¡one ¡pathogen ¡read ¡

• 2. ¡Choosing ¡the ¡appropriate ¡sample ¡material, ¡i.e. ¡material ¡

with ¡high ¡loads ¡of ¡pathogen ¡(and ¡minimum ¡host ¡genome) ¡ is ¡crucial ¡ ¡

Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

Key ¡Issues ¡for ¡Diagnos2c ¡Metagenomics ¡

• Huge ¡datasets ¡are ¡generated, ¡resul2ng ¡in ¡complex ¡

and ¡2me ¡consuming ¡data ¡analysis ¡

• Classifica0on ¡of ¡the ¡sequences ¡relies ¡on ¡finding ¡

similari0es ¡to ¡known ¡pathogens ¡

• Limited ¡read ¡length ¡(with ¡some ¡instruments) ¡

impedes ¡data ¡analysis ¡

• How ¡to ¡deal ¡with ¡unclassifiable ¡sequences: ¡are ¡they ¡

random ¡ar0ficial ¡or ¡natural ¡but ¡unknown ¡sequences? ¡ These ¡sequences ¡require ¡intense ¡manual ¡evalua2on ¡

Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

Sample ¡Choice ¡– ¡Sample ¡Prepara2on ¡

Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

Sample ¡Choice ¡

• ­‑ Body ¡fluid/0ssue ¡material? ¡
• ­‑ Preferably ¡the ¡matrix ¡with ¡the ¡lowest ¡quan2ty ¡of ¡host ¡

nucleic ¡acids ¡(NA) ¡

• ­‑ The ¡highest ¡possible ¡quan0ty ¡of ¡pathogen ¡NA ¡
• ­‑ DNA ¡or ¡RNA? ¡
• ­‑ RNA ¡is ¡to ¡be ¡preferred ¡over ¡DNA ¡because ¡all ¡replica0ng ¡

viruses ¡generate ¡RNA ¡but ¡only ¡a ¡few ¡generate ¡DNA ¡

Ins%tute ¡of ¡Diagnos%c ¡Virology ¡

Sample ¡Choice ¡ Example ¡1 ¡

• ­‑ Fish ¡are ¡dying ¡for ¡unknown ¡reason ¡
• ­‑ Sample ¡from ¡metabolically ¡highly ¡ac0ve ¡gill ¡0ssue ¡
• ­‑ DNA ¡virus ¡expected ¡
• ­‑ Sequencing ¡library ¡from ¡RNA ¡
• ­‑ 229,000 ¡sequencing ¡reads ¡
• ­‑ 2 ¡reads ¡RNA ¡virus ¡(0.00087%) ¡

Example ¡2 ¡

• ­‑ sequencing ¡RNA ¡isolated ¡from ¡serum ¡from ¡BVDV ¡

persistently ¡infected ¡caZle ¡

• ­‑ 5% ¡viral ¡reads ¡

Sample ¡Choice ¡

Sample ¡Choice ¡ Example ¡3 ¡

• ­‑ Schmallenberg ¡virus ¡samples ¡RNA ¡from ¡serum ¡
• ­‑ 7/27,000 ¡(0.026%) ¡reads ¡orthobunyavirus ¡
• ­‑ Library ¡only ¡sufficient ¡to ¡yield ¡a ¡total ¡of ¡approx. ¡

85,000 ¡reads ¡

Sample ¡Prepara2on ¡

Sample ¡Prepara2on ¡

• ­‑ Usually ¡high ¡background ¡of ¡host ¡nucleic ¡acids ¡
• ­‑ Different ¡nuclease ¡diges0on ¡dependent ¡techniques ¡

for ¡the ¡deple0on ¡of ¡these: ¡

• ­‑ DNase ¡SISPA ¡
• ­‑ Vidisca ¡
• ­‑ Kits ¡for ¡sample ¡normaliza2on ¡

¡

• ­‑ BUT: ¡nuclease ¡digest ¡means ¡risk ¡of ¡irreversible ¡

informa0on ¡loss ¡

Sequencing ¡

Sequencing ¡

• ­‑ Various ¡technologies ¡available ¡
• ­‑ Read ¡length ¡is ¡a ¡cri2cal ¡determinant ¡
• ­‑ Sanger ¡with ¡too ¡low ¡throughput ¡
• ­‑ Some ¡plaQorms ¡with ¡high ¡throughput ¡require ¡long ¡

sequencing ¡0me ¡ ¡ For ¡diagnos0cs ¡2me ¡necessary ¡0ll ¡comple0on ¡may ¡be ¡ an ¡issue ¡ ¡

Sequencing: ¡Impact ¡of ¡Read ¡Length ¡ Success ¡of ¡read ¡classifica0on ¡depending ¡on ¡read ¡length ¡ (GCReoV-­‑Daten ¡Histogramm) ¡

Sequencing: ¡Impact ¡of ¡Read ¡Length ¡ What ¡if ¡… ¡the ¡Schmallenberg-­‑virus ¡sequencing ¡reads ¡ had ¡been ¡shorter? ¡

Long ¡reads ¡ Short ¡Reads ¡ Mean ¡length ¡ 315 ¡ 96 ¡ Total ¡No. ¡reads ¡ 27420 ¡ 27420 ¡

• No. ¡classified ¡reads ¡

26128 ¡ 25310 ¡

• No. ¡Orthobunyavirus ¡hits ¡

7 ¡ 1 ¡ Similarity ¡with ¡subject ¡sequence ¡ 68.37 ¡% ¡-­‑ ¡95.60 ¡% ¡ 98.68 ¡ ¡% ¡

• No. ¡unclassified ¡reads ¡

1292 ¡ 2110 ¡

Data ¡Analysis ¡

Data ¡Analysis ¡ ¡ A ¡known ¡virus/bacterium ¡with ¡a ¡sufficiently ¡similar ¡ genome ¡or ¡amino ¡acid ¡sequence ¡is ¡necessary ¡ ¡ The ¡more ¡sequences ¡are ¡available ¡for ¡diverse ¡viruses/ ¡

• rganisms, ¡the ¡higher ¡the ¡chance ¡gets ¡to ¡iden0fy ¡a ¡

novel/unexpected ¡pathogen ¡by ¡sequence ¡comparison ¡

Data ¡Analysis ¡ ¡

• ­‑ A ¡bigger ¡database ¡causes ¡longer ¡computa0on ¡to ¡find ¡

the ¡most ¡similar ¡sequence ¡

• ­‑ Too ¡small ¡databases ¡produce ¡significant ¡hits ¡that ¡are ¡

not ¡meaningful! ¡

• ­‑ The ¡stringency ¡of ¡the ¡search ¡algorithm ¡is ¡crucial ¡

Metagenomic analysis

Beyond ¡detec2on: ¡fulfillment ¡of ¡Koch’s ¡postulates ¡

• ­‑ Discussion ¡is ¡necessary ¡about ¡the ¡

possibility ¡and ¡necessity ¡to ¡fulfill ¡ Koch’s ¡postulates ¡

• ­‑ Failure ¡to ¡fulfill ¡these ¡might ¡

result ¡in ¡false ¡diagnosis ¡

• ­‑ In ¡animal ¡diagnos0cs ¡fulfillment ¡

can ¡be ¡possible ¡and ¡desirable ¡ (see ¡SBV) ¡

Beyond ¡detec2on: ¡fulfillment ¡of ¡Koch’s ¡postulates ¡

Mokili ¡-­‑ ¡Koch’s ¡postulates ¡

• The ¡diseased ¡host ¡metagenome ¡in ¡a ¡sample ¡is ¡

significantly ¡different ¡from ¡a ¡control ¡sample ¡

• Inocula0on ¡of ¡the ¡clinical ¡sample ¡in ¡a ¡healthy ¡subject ¡

should ¡result ¡in ¡the ¡same ¡disease ¡state ¡

• Differen0al ¡metagenomics ¡traits ¡iden0fied ¡in ¡step ¡1 ¡have ¡

to ¡be ¡recognized, ¡only ¡arer ¡infec0on, ¡in ¡the ¡ metagenome ¡of ¡the ¡inoculated ¡subject ¡

• Inocula0on ¡of ¡a ¡sample ¡of ¡the ¡diseased ¡subject ¡from ¡step ¡

2 ¡must ¡induce ¡disease ¡in ¡a ¡newly ¡infected ¡subject ¡

• J. ¡L. ¡Mokili, ¡F. ¡Rohwer, ¡B. ¡E. ¡Du0lh, ¡Curr. ¡Opin. ¡Virol. ¡2, ¡63 ¡(2012) ¡

A new Orthobunyavirus - SBV

Beyond ¡detec2on: ¡fulfillment ¡of ¡Koch’s ¡postulates ¡

Conclusions ¡

• Metagenomics ¡is ¡a ¡universal ¡powerful ¡tool ¡for ¡

discovery ¡of ¡unexpected/unknown ¡pathogens ¡

• The ¡key ¡to ¡success ¡is ¡a ¡high ¡rela0ve ¡abundance ¡of ¡

the ¡pathogen ¡compared ¡to ¡the ¡host ¡nucleic ¡acid ¡in ¡ a ¡given ¡sample ¡

• In ¡order ¡to ¡reduce ¡the ¡cost ¡and ¡to ¡circumvent ¡the ¡

boZleneck ¡of ¡data ¡analysis, ¡protocols ¡for ¡

• p0mized ¡sample ¡prepara0on ¡are ¡necessary ¡
• Op0mized ¡data ¡analysis ¡and ¡databases ¡are ¡crucial ¡ ¡

Acknowledgements ¡ All ¡colleagues ¡from ¡the ¡FLI ¡contribu0ng ¡to ¡this ¡work ¡ All ¡colleagues ¡from ¡na0onal ¡and ¡interna0onal ¡ ins0tutes ¡sending ¡in ¡samples ¡