An iGEM-Compliant Shu3le Vector for Clostridial Chassis - - PowerPoint PPT Presentation

An ¡iGEM-­‑Compliant ¡Shu3le ¡Vector ¡for ¡ Clostridial ¡Chassis ¡Organisms ¡

The ¡Oklahoma ¡iGEM ¡Team ¡

Jeremiah ¡Miller, ¡Erin ¡Weese, ¡Zachariah ¡Herron, ¡Samuel ¡Jones, ¡JusDn ¡Montgomery ¡

• Disadvantages ¡of ¡crude ¡oil ¡
• Reliance ¡on ¡Foreign ¡Sources ¡
• TransportaDon ¡costs ¡ ¡
• Environmental ¡impact ¡
• Advantages ¡of ¡alternaDve ¡biofuels ¡
• Local ¡
• Renewable ¡
• Less ¡emissions ¡
• Self ¡reliance ¡
• Stabilize ¡and ¡possibly ¡decrease ¡gasoline/energy ¡prices ¡

h3p://www.eia.gov/dnav/pet/hist/LeafHandler.ashx?n=PET&s=F000000__3&f=A ¡

Petroleum vs Biofuels

• Financing ¡Fuels ¡
• Crude ¡oil: ¡̴ ¡$100/barrel ¡
• U.S. ¡spends ¡̴ ¡$300 ¡billion ¡on ¡the ¡import ¡of ¡foreign ¡fuels. ¡ ¡
• Department ¡of ¡Defense ¡
• Goal ¡is ¡to ¡produce ¡25% ¡of ¡all ¡resources ¡by ¡2025 ¡
• Currently ¡at ¡6% ¡

h3p://www.pewenvironment.org/news-­‑room/compilaDons/biofuels-­‑innovaDon-­‑strengthens-­‑our-­‑energy-­‑security-­‑85899390903 ¡

High Cost of Petroleum

Biofuel Development

• First ¡GeneraDon ¡ ¡
• FermentaDon ¡of ¡sugar, ¡starch, ¡or ¡oil ¡from ¡corn, ¡grain, ¡sugar ¡cane, ¡etc. ¡
• Competes ¡with ¡the ¡food ¡supply ¡
• Second ¡GeneraDon ¡
• produced ¡from ¡sustainable ¡feedstock ¡
• Feedstock ¡availability ¡
• GHG ¡Emmisions ¡
• Doesn’t ¡compete ¡with ¡food ¡ ¡
• Third ¡GeneraDon ¡
• Algal ¡biodiesel ¡producDon ¡ ¡

h3p://www.animalfronDers.org/content/3/2/6.full ¡

• C. ¡acetobutylicum ¡

History ¡

• Originally ¡discovered ¡circa ¡1912 ¡
• ­‑ World ¡War ¡I: ¡explosives ¡
• ­‑ “Weizmann ¡organism” ¡
• Solvent ¡producDon ¡in ¡1936 ¡
• Weakened ¡interest ¡in ¡the ¡‘50s ¡
• Interest ¡has ¡been ¡renewed ¡in ¡the ¡past ¡twenty ¡years ¡

EPA, ¡Feb. ¡1997, ¡Clostridium ¡acetobutylicum ¡Final ¡Risk ¡Assessment. ¡[Online] ¡

Hideaki Shinto, et al. Journal of Biotechnology, Volume 131, Issue 1, 1 August 2007, Pages 45-56 ¡

Benefits of using Clostridia

• Many ¡Clostridia ¡are ¡capable ¡of ¡degrading ¡complex ¡cellulosic ¡substrates ¡via ¡

cellulosome, ¡making ¡them ¡a3racDve ¡for ¡generaDon ¡II ¡biofuel ¡producDon. ¡

• Some ¡Clostridia ¡are ¡also ¡capable ¡of ¡converDng ¡crude ¡glycol, ¡a ¡byproduct ¡of ¡

biodiesel ¡producDon, ¡into ¡biofuels, ¡improving ¡generaDon ¡III ¡biofuel ¡efficiency.1 ¡

• ProducDon ¡of ¡H2 ¡in ¡addiDon ¡to ¡solvents. ¡
• Papoutsakis ¡group ¡has ¡produced ¡strains ¡of ¡C. ¡acetobutylicum ¡that ¡produce ¡17.6g/

L ¡butanol, ¡8.2 ¡g/L ¡acetone, ¡and ¡2.2 ¡g/L ¡ethanol ¡(28 ¡g/L ¡total ¡solvents).2 ¡

• Blaschek ¡group ¡has ¡produced ¡strains ¡of ¡C. ¡beijerinckii ¡that ¡produce ¡up ¡to ¡33 ¡g/L ¡

total ¡sovents.3 ¡

• 1. ¡Taconi, ¡K. ¡A., ¡Venkataramanan, ¡K. ¡P., ¡and ¡Johnson, ¡D. ¡T. ¡Growth ¡and ¡solvent ¡producDon ¡by ¡Clostridium ¡pasteurianum ¡ATCC ¡6013 ¡uDlizing ¡biodiesel-­‑derived ¡crude ¡glycerol ¡as ¡the ¡sole ¡carbon ¡source. ¡ ¡

¡ ¡ ¡ ¡2009. ¡Environmental ¡Progress ¡& ¡Sustainable ¡Energy. ¡28: ¡100-­‑110. ¡

• 2. ¡Harris, ¡L. ¡M., ¡Blank, ¡L., ¡Desai, ¡R. ¡P., ¡Welker, ¡N. ¡E., ¡and ¡Papoutsakis, ¡E. ¡T. ¡FermentaDon ¡characterizaDon ¡and ¡flux ¡analysis ¡of ¡recombinant ¡strains ¡of ¡Clostridium ¡acetobutylicum ¡with ¡an ¡inacDvated ¡solR ¡gene. ¡2001. ¡Journal ¡of ¡ ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡Industrial ¡Microbiology ¡& ¡Biotechnology. ¡27: ¡322-­‑328. ¡

• 3. ¡Qureshi, ¡N., ¡and ¡Blaschek, ¡H. ¡P. ¡ProducDon ¡of ¡acetone ¡butanol ¡and ¡ethanol ¡by ¡a ¡hyper-­‑producing ¡mutant ¡strain ¡of ¡Clostridium ¡beijerinckii ¡BA101 ¡and ¡recovery ¡by ¡pervaporaDon. ¡1999. ¡Biotechnology ¡Progress ¡15: ¡594-­‑602. ¡

Manipulating Clostridia

• Difficult ¡geneDc ¡accessibility1 ¡
• Hampered ¡successful ¡engineering ¡for ¡a ¡

long ¡Dme ¡

• Gram ¡PosiDve ¡
• Inefficient ¡transformaDon ¡
• DifficulDes ¡extracDng ¡DNA ¡
• Lack ¡of ¡methods ¡for ¡efficiently ¡

knocking ¡out ¡specific ¡genes2 ¡

• Complex ¡metabolic ¡pathways ¡ ¡
• Several ¡branching ¡points1 ¡
• Makes ¡it ¡difficult ¡to ¡direct ¡carbon ¡flow ¡
• Acidogenesis ¡to ¡Solventagenesis ¡ ¡
• Metabolic ¡changes ¡associated ¡with ¡

switch3 ¡

Manipulating Clostridia

1.Lutke-­‑Eversloh ¡and ¡Bahl ¡2011 ¡

• 2. ¡Jia ¡et ¡al. ¡2011 ¡

3.Amador-­‑Noguez ¡et ¡al. ¡2011 ¡ 3

Restriction system in C. acetobutylicum

• ¡ ¡Cac824I ¡restricDon ¡endonuclease. ¡
• ¡ ¡Purpose ¡of ¡the ¡restricDon ¡enzyme. ¡

http://aem.asm.org/content/59/4/1077.full.pdf

Pass through E. coli DH5α with pAN1 – φ methylating gene

• The ¡Bacillus ¡sub8lis ¡Phage ¡Φ ¡T3 ¡1 ¡Methyltransferase ¡gene. ¡
• Passing ¡the ¡shu3le ¡vector ¡through ¡E.coli ¡DH5α ¡ ¡which ¡contains ¡the ¡pAN1 ¡

plasmid ¡with ¡the ¡Methyltransferase ¡gene. ¡

http://aem.asm.org/content/59/4/1077.full.pdf

An iGEM-Compliant Shuttle Vector

• Build ¡on ¡previous ¡work. ¡

pIKM1 ¡

• Take ¡advantage ¡of ¡the ¡

iGEM ¡standards ¡to ¡improve ¡ ease ¡of ¡manipulaDon. ¡

• Goal: ¡Build ¡a ¡shu3le ¡vector ¡

that ¡anyone ¡can ¡modify, ¡ submit ¡this ¡to ¡the ¡Registry ¡ as ¡a ¡new ¡backbone. ¡

What ¡did ¡we ¡need? ¡

Origin ¡of ¡ReplicaDon ¡

• E. ¡coli ¡
• ­‑Already ¡exists ¡in ¡the ¡iGEM ¡backbones ¡
• ­‑Gram ¡NegaDve ¡
• C. ¡acetobutylicum ¡
• ­‑Different ¡from ¡E. ¡coli ¡
• ­‑Gram ¡PosiDve ¡

Promoters

• Necessary ¡for ¡transcripDon ¡of ¡vector ¡

genes ¡ ¡

• Need ¡promoters ¡funcDonal ¡in ¡Clostridia ¡
• E. ¡coli ¡genes ¡poorly ¡expressed ¡in ¡C. ¡

acetobutylicum1 ¡

• None ¡in ¡registry ¡
• Found ¡in ¡literature ¡
• All ¡genes ¡used ¡in ¡metabolic ¡processes ¡
• Thiolase ¡(thl)2 ¡
• Phosphotransbutyrylase ¡(ptb)3 ¡
• Acetoacetate ¡decarboxylase ¡(adc)4 ¡
• Ordered ¡in ¡gBlock ¡format ¡
• Short ¡sequences ¡
• Save ¡Dme ¡making ¡primers ¡
• With ¡and ¡without ¡RBS ¡

1.Tummala ¡et ¡al. ¡1999 ¡ 2.SDm-­‑Herndon ¡et ¡al. ¡1995 ¡ 3.Walter ¡et ¡al. ¡1993 ¡ 4.Gerischer ¡and ¡Durre ¡1991 ¡

Procedures

• Clostridial ¡Promoters ¡
• Ordered ¡in ¡gBlock ¡format ¡
• Cohesive ¡end ¡cloning ¡trial ¡1 ¡
• FAIL ¡
• No ¡colonies ¡on ¡plates ¡
• Cohesive ¡end ¡cloning ¡trial ¡2 ¡
• Modified ¡protocol ¡
• Colonies ¡formed ¡
• ExtracDon ¡yielded ¡DNA ¡that ¡wasn’t ¡

concentrated ¡enough ¡for ¡sequencing ¡

• Used ¡richer ¡medium ¡to ¡grow ¡cultures ¡

before ¡DNA ¡extracDon ¡

• DNA ¡concentrated ¡enough ¡
• Only ¡ptb-­‑RBS ¡sequence ¡confirmed ¡
• Bacillus ¡
• Isolated ¡plasmids ¡with ¡promoters ¡from ¡

registry ¡for ¡future ¡use ¡

Growing Anaerobic cultures

• Clostridia ¡bacteria ¡are ¡obligate ¡

anaerobes ¡

• Methods ¡ ¡
• Making ¡of ¡anaerobic ¡enriched ¡medium ¡
• Work ¡must ¡be ¡performed ¡in ¡glovebag ¡
• ReconsDtuted ¡lyophilized ¡cells ¡under ¡

anaerobic ¡condiDons ¡

• Grew ¡up ¡culture ¡using ¡spores ¡

Clos Ori

• 691 ¡bp ¡region ¡(part ¡only) ¡
• Cloned ¡from ¡pIKM1 ¡

Includes ¡external ¡sequence ¡ elements ¡ Will ¡move ¡forward ¡to ¡ determine ¡minimal ¡ sequence ¡

800bp ¡ 700bp ¡ 600bp ¡ 500bp ¡

Clos Ori + Pptb-

• 821 ¡bp ¡fragment ¡
• Two ¡possible ¡successful ¡ ¡

3A ¡Assemblies ¡ (awaiDng ¡sequencing ¡results) ¡

1500bp ¡ 1000bp ¡ 750bp ¡ 500bp ¡

mlsR

• 735 ¡bp ¡(part ¡only) ¡
• Cloned ¡from ¡pIKM1 ¡

1000bp ¡ 750bp ¡ 500bp ¡

3A Assembly

• IniDal ¡errors ¡
• Success ¡in ¡combining ¡

the ¡Clostridium ¡Origin ¡ with ¡the ¡Promoter ¡Pptb-­‑ ¡

http://2010.igem.org/3A_Assembly

The First Shuttle Vector

The Desired Final Plasmid

• ¡ ¡Isobutanol ¡and ¡

¡3-­‑methylpentanol ¡

• ¡ ¡Future ¡3A ¡assemblies ¡

Future Directions

• Promoters ¡
• More ¡
• From ¡different ¡consDtuDvely ¡expressed ¡

genes ¡not ¡involved ¡in ¡metabolic ¡ processes ¡

• Compare ¡expression ¡
• Clostridial ¡
• ¡Bacillus ¡sub8lis ¡ ¡
• Obtained ¡from ¡distribuDons ¡
• Inducible ¡promoter-­‑repressor ¡

system ¡

• Gene ¡expression ¡reporter ¡system ¡
• Ordered ¡an ¡anaerobic ¡reporter ¡from ¡

the ¡Registry, ¡not ¡yet ¡shipped. ¡

1 ¡ 1.Tummala ¡et ¡al. ¡1999 ¡

Future ¡DirecDons ¡

• Remove ¡the ¡external ¡cloning ¡sites ¡and ¡move ¡them ¡in ¡a ¡

polylinker ¡to ¡the ¡middle ¡of ¡the ¡vector. ¡ ¡

• Submit ¡a ¡new ¡backbone ¡to ¡the ¡Registry. ¡
• Do ¡anaerobes ¡really ¡do ¡it ¡be3er? ¡
• Extend ¡Chain ¡Length ¡(BktB ¡+ ¡Ter) ¡

¡-­‑increases ¡stability ¡ ¡-­‑decreases ¡volaDlity ¡ ¡-­‑increases ¡energy ¡density ¡

• Branching ¡(KIVD ¡+ ¡Adh6) ¡

Thank ¡You! ¡ QuesDons? ¡