An iGEM-Compliant Shu3le Vector for Clostridial Chassis - PowerPoint PPT Presentation

An ¡iGEM-­‑Compliant ¡Shu3le ¡Vector ¡for ¡ Clostridial ¡Chassis ¡Organisms ¡ The ¡Oklahoma ¡iGEM ¡Team ¡ Jeremiah ¡Miller, ¡Erin ¡Weese, ¡Zachariah ¡Herron, ¡Samuel ¡Jones, ¡JusDn ¡Montgomery ¡

Petroleum vs Biofuels • Disadvantages ¡of ¡crude ¡oil ¡ • Reliance ¡on ¡Foreign ¡Sources ¡ • TransportaDon ¡costs ¡ ¡ • Environmental ¡impact ¡ • Advantages ¡of ¡alternaDve ¡biofuels ¡ • Local ¡ • Renewable ¡ • Less ¡emissions ¡ • Self ¡reliance ¡ • Stabilize ¡and ¡possibly ¡decrease ¡gasoline/energy ¡prices ¡ h3p://www.eia.gov/dnav/pet/hist/LeafHandler.ashx?n=PET&s=F000000__3&f=A ¡

High Cost of Petroleum • Financing ¡Fuels ¡ • Crude ¡oil: ¡ ̴ ¡$100/barrel ¡ • U.S. ¡spends ¡ ̴ ¡$300 ¡billion ¡on ¡the ¡import ¡of ¡foreign ¡fuels. ¡ ¡ • Department ¡of ¡Defense ¡ • Goal ¡is ¡to ¡produce ¡25% ¡of ¡all ¡resources ¡by ¡2025 ¡ • Currently ¡at ¡6% ¡ h3p://www.pewenvironment.org/news-­‑room/compilaDons/biofuels-­‑innovaDon-­‑strengthens-­‑our-­‑energy-­‑security-­‑85899390903 ¡

Biofuel Development • First ¡GeneraDon ¡ ¡ • FermentaDon ¡of ¡sugar, ¡starch, ¡or ¡oil ¡from ¡corn, ¡grain, ¡sugar ¡cane, ¡etc. ¡ • Competes ¡with ¡the ¡food ¡supply ¡ • Second ¡GeneraDon ¡ • produced ¡from ¡sustainable ¡feedstock ¡ • Feedstock ¡availability ¡ • GHG ¡Emmisions ¡ • Doesn’t ¡compete ¡with ¡food ¡ ¡ • Third ¡GeneraDon ¡ • Algal ¡biodiesel ¡producDon ¡ ¡ h3p://www.animalfronDers.org/content/3/2/6.full ¡

C. ¡acetobutylicum ¡ History ¡ • Originally ¡discovered ¡circa ¡1912 ¡ -­‑ World ¡War ¡I: ¡explosives ¡ -­‑ “Weizmann ¡organism” ¡ • Solvent ¡producDon ¡in ¡1936 ¡ • Weakened ¡interest ¡in ¡the ¡‘50s ¡ • Interest ¡has ¡been ¡renewed ¡in ¡the ¡past ¡twenty ¡years ¡ EPA, ¡Feb. ¡1997, ¡Clostridium ¡acetobutylicum ¡Final ¡Risk ¡Assessment. ¡[Online] ¡

Hideaki Shinto, et al. Journal of Biotechnology, Volume 131, Issue 1, 1 August 2007, Pages 45-56 ¡

Benefits of using Clostridia • Many ¡ Clostridia ¡are ¡capable ¡of ¡degrading ¡complex ¡cellulosic ¡substrates ¡via ¡ cellulosome, ¡making ¡them ¡a3racDve ¡for ¡generaDon ¡II ¡biofuel ¡producDon. ¡ • Some ¡ Clostridia ¡ are ¡also ¡capable ¡of ¡converDng ¡crude ¡glycol, ¡a ¡byproduct ¡of ¡ biodiesel ¡producDon, ¡into ¡biofuels, ¡improving ¡generaDon ¡III ¡biofuel ¡efficiency. 1 ¡ • ProducDon ¡of ¡H 2 ¡in ¡addiDon ¡to ¡solvents. ¡ • Papoutsakis ¡group ¡has ¡produced ¡strains ¡of ¡ C. ¡acetobutylicum ¡ that ¡produce ¡17.6g/ L ¡butanol, ¡8.2 ¡g/L ¡acetone, ¡and ¡2.2 ¡g/L ¡ethanol ¡(28 ¡g/L ¡total ¡solvents). 2 ¡ • Blaschek ¡group ¡has ¡produced ¡strains ¡of ¡ C. ¡beijerinckii ¡that ¡produce ¡up ¡to ¡33 ¡g/L ¡ total ¡sovents. 3 ¡ 1. ¡Taconi, ¡K. ¡A., ¡Venkataramanan, ¡K. ¡P., ¡and ¡Johnson, ¡D. ¡T. ¡Growth ¡and ¡solvent ¡producDon ¡by ¡ Clostridium ¡pasteurianum ¡ ATCC ¡6013 ¡uDlizing ¡biodiesel-­‑derived ¡crude ¡glycerol ¡as ¡the ¡sole ¡carbon ¡source. ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡2009. ¡Environmental ¡Progress ¡& ¡Sustainable ¡Energy. ¡ 28: ¡100-­‑110. ¡ 2. ¡Harris, ¡L. ¡M., ¡Blank, ¡L., ¡Desai, ¡R. ¡P., ¡Welker, ¡N. ¡E., ¡and ¡Papoutsakis, ¡E. ¡T. ¡FermentaDon ¡characterizaDon ¡and ¡flux ¡analysis ¡of ¡recombinant ¡strains ¡of ¡ Clostridium ¡acetobutylicum ¡ with ¡an ¡inacDvated ¡ solR ¡gene. ¡2001. ¡Journal ¡of ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Industrial ¡Microbiology ¡& ¡Biotechnology. ¡ 27: ¡ 322-­‑328. ¡ 3. ¡Qureshi, ¡N., ¡and ¡Blaschek, ¡H. ¡P. ¡ProducDon ¡of ¡acetone ¡butanol ¡and ¡ethanol ¡by ¡a ¡hyper-­‑producing ¡mutant ¡strain ¡of ¡ Clostridium ¡beijerinckii ¡BA101 ¡and ¡recovery ¡by ¡pervaporaDon. ¡1999. ¡Biotechnology ¡Progress ¡ 15: ¡ 594-­‑602. ¡

Manipulating Clostridia Manipulating Clostridia • Difficult ¡geneDc ¡accessibility 1 ¡ 3 • Hampered ¡successful ¡engineering ¡for ¡a ¡ long ¡Dme ¡ • Gram ¡PosiDve ¡ • Inefficient ¡transformaDon ¡ • DifficulDes ¡extracDng ¡DNA ¡ • Lack ¡of ¡methods ¡for ¡efficiently ¡ knocking ¡out ¡specific ¡genes 2 ¡ • Complex ¡metabolic ¡pathways ¡ ¡ • Several ¡branching ¡points 1 ¡ • Makes ¡it ¡difficult ¡to ¡direct ¡carbon ¡flow ¡ • Acidogenesis ¡to ¡Solventagenesis ¡ ¡ • Metabolic ¡changes ¡associated ¡with ¡ 1.Lutke-­‑Eversloh ¡and ¡Bahl ¡2011 ¡ switch 3 ¡ 2. ¡Jia ¡et ¡al. ¡2011 ¡ 3.Amador-­‑Noguez ¡et ¡al. ¡2011 ¡

Restriction system in C. acetobutylicum • ¡ ¡ Cac 824I ¡restricDon ¡endonuclease. ¡ • ¡ ¡Purpose ¡of ¡the ¡restricDon ¡enzyme. ¡ http://aem.asm.org/content/59/4/1077.full.pdf

Pass through E. coli DH5 α with pAN1 – φ methylating gene • The ¡ Bacillus ¡sub8lis ¡ Phage ¡Φ ¡T3 ¡1 ¡Methyltransferase ¡gene. ¡ • Passing ¡the ¡shu3le ¡vector ¡through ¡E.coli ¡ DH5α ¡ ¡which ¡contains ¡the ¡pAN1 ¡ plasmid ¡with ¡the ¡Methyltransferase ¡gene. ¡ http://aem.asm.org/content/59/4/1077.full.pdf

An iGEM-Compliant Shuttle Vector • Build ¡on ¡previous ¡work. ¡ pIKM1 ¡ • Take ¡advantage ¡of ¡the ¡ iGEM ¡standards ¡to ¡improve ¡ ease ¡of ¡manipulaDon. ¡ • Goal: ¡Build ¡a ¡shu3le ¡vector ¡ that ¡anyone ¡can ¡modify, ¡ submit ¡this ¡to ¡the ¡Registry ¡ as ¡a ¡new ¡backbone. ¡

What ¡did ¡we ¡need? ¡ Origin ¡of ¡ReplicaDon ¡ • E. ¡coli ¡ -­‑Already ¡exists ¡in ¡the ¡iGEM ¡backbones ¡ -­‑Gram ¡NegaDve ¡ • C. ¡acetobutylicum ¡ -­‑Different ¡from ¡ E. ¡coli ¡ -­‑Gram ¡PosiDve ¡

Promoters • Necessary ¡for ¡transcripDon ¡of ¡vector ¡ genes ¡ ¡ • Need ¡promoters ¡funcDonal ¡in ¡ Clostridia ¡ • E. ¡coli ¡ genes ¡poorly ¡expressed ¡in ¡ C. ¡ acetobutylicum 1 ¡ • None ¡in ¡registry ¡ • Found ¡in ¡literature ¡ • All ¡genes ¡used ¡in ¡metabolic ¡processes ¡ • Thiolase ¡(thl) 2 ¡ • Phosphotransbutyrylase ¡(ptb) 3 ¡ • Acetoacetate ¡decarboxylase ¡(adc) 4 ¡ • Ordered ¡in ¡gBlock ¡format ¡ • Short ¡sequences ¡ • Save ¡Dme ¡making ¡primers ¡ 1.Tummala ¡et ¡al. ¡1999 ¡ • With ¡and ¡without ¡RBS ¡ 2.SDm-­‑Herndon ¡et ¡al. ¡1995 ¡ 3.Walter ¡et ¡al. ¡1993 ¡ 4.Gerischer ¡and ¡Durre ¡1991 ¡

Procedures • Clostridial ¡Promoters ¡ • Ordered ¡in ¡gBlock ¡format ¡ • Cohesive ¡end ¡cloning ¡trial ¡1 ¡ • FAIL ¡ • No ¡colonies ¡on ¡plates ¡ • Cohesive ¡end ¡cloning ¡trial ¡2 ¡ • Modified ¡protocol ¡ • Colonies ¡formed ¡ • ExtracDon ¡yielded ¡DNA ¡that ¡wasn’t ¡ concentrated ¡enough ¡for ¡sequencing ¡ • Used ¡richer ¡medium ¡to ¡grow ¡cultures ¡ before ¡DNA ¡extracDon ¡ • DNA ¡concentrated ¡enough ¡ • Only ¡ ptb -­‑RBS ¡sequence ¡confirmed ¡ • Bacillus ¡ • Isolated ¡plasmids ¡with ¡promoters ¡from ¡ registry ¡for ¡future ¡use ¡

Growing Anaerobic cultures • Clostridia ¡bacteria ¡are ¡obligate ¡ anaerobes ¡ • Methods ¡ ¡ • Making ¡of ¡anaerobic ¡enriched ¡medium ¡ • Work ¡must ¡be ¡performed ¡in ¡glovebag ¡ • ReconsDtuted ¡lyophilized ¡cells ¡under ¡ anaerobic ¡condiDons ¡ • Grew ¡up ¡culture ¡using ¡spores ¡

Clos Ori • 691 ¡bp ¡region ¡(part ¡only) ¡ • Cloned ¡from ¡pIKM1 ¡ Includes ¡external ¡sequence ¡ 800bp ¡ elements ¡ 700bp ¡ 600bp ¡ Will ¡move ¡forward ¡to ¡ 500bp ¡ determine ¡minimal ¡ sequence ¡

Clos Ori + Pptb- • 821 ¡bp ¡fragment ¡ • Two ¡possible ¡successful ¡ ¡ 3A ¡Assemblies ¡ (awaiDng ¡sequencing ¡results) ¡ 1500bp ¡ 1000bp ¡ 750bp ¡ 500bp ¡

mlsR • 735 ¡bp ¡(part ¡only) ¡ • Cloned ¡from ¡pIKM1 ¡ 1000bp ¡ 750bp ¡ 500bp ¡

3A Assembly • IniDal ¡errors ¡ • Success ¡in ¡combining ¡ the ¡Clostridium ¡Origin ¡ with ¡the ¡Promoter ¡P ptb-­‑ ¡ http://2010.igem.org/3A_Assembly

The First Shuttle Vector