New substrates for electron cryo-microscopy Lori Passmore 2014 - - PowerPoint PPT Presentation

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new substrates for electron cryo microscopy
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New substrates for electron cryo-microscopy Lori Passmore 2014 - - PowerPoint PPT Presentation

Oct 05, 2023 280 likes •448 views

New substrates for electron cryo-microscopy Lori Passmore 2014 NRAMM Workshop on Advanced Topics in EM Structure Determination Tradi&onal substrates for cryo-EM electron microscope grid 80 m amorphous carbon membrane 1 m

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SLIDE 1

New substrates for electron cryo-microscopy

Lori Passmore 2014 NRAMM Workshop on Advanced Topics in EM Structure Determination

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SLIDE 2

Tradi&onal ¡substrates ¡for ¡cryo-­‑EM

Quantifoil, C-flat Cryomesh

metal grid bar amorphous carbon membrane ice embedded protein particles electron microscope grid 80 μm 1 μm

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SLIDE 3

metal grid bar amorphous carbon membrane ice embedded protein particles electron microscope grid 80 μm 1 μm continuous

  • am. carbon film

Tradi&onal ¡substrates ¡for ¡cryo-­‑EM

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SLIDE 4

Plasma ¡chamber

Plasma ¡created ¡by ¡ionisa1on ¡of ¡a ¡gas ¡under ¡low ¡vacuum ¡ E.g. ¡in ¡air ¡(glow ¡discharge), ¡oxygen, ¡argon, ¡hydrogen ¡

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SLIDE 5
  • Proteins ¡interact ¡with ¡surfaces ¡present ¡during ¡the ¡

blo@ng ¡process ➡ Denatura1on ¡of ¡proteins, ¡preferen1al ¡orienta1ons

  • Electron ¡radia1on ¡induces ¡mo1on ¡of ¡the ¡par1cles ¡and ¡

substrates ➡ Image ¡blurring

  • Addi1onal ¡layer ¡of ¡carbon ¡reduces ¡signal ¡to ¡noise ¡per ¡

par1cle ¡ ➡ alignment ¡more ¡difficult

  • Overall ¡lack ¡of ¡reproducibility ¡from ¡grid ¡to ¡grid

Tradi&onal ¡substrates ¡for ¡cryo-­‑EM

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SLIDE 6

gold grid bar amorphous carbon membrane ice embedded protein particles electron microscope grid 80 μm 1 μm graphene

Graphene ¡substrates ¡for ¡cryo-­‑EM

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SLIDE 7

10 Å

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SLIDE 8

70S Ribosomes

  • n graphene as

synthesised 1.2 μm hole

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SLIDE 9

So how do we make graphene more hydrophilic so we can use it for cryoEM?

Partial hydrogenation: Russo and Passmore (2014) Nature Methods Graphene oxide: Pantelic, Stahlberg et al (2010) JSB, (2011) JSB, (2011) Nano Lett Aromatic functionalisation: Pantelic et al (2014) Appl Phys Lett Amorphous carbon: Sader, Rosenthal et al (2013) JSB

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SLIDE 10

95 90 85 80 75 70 65 Contact angle (degrees) 160 140 120 100 80 60 40 20 Hydrogen plasma exposure time (sec)

Hydrogen plasma H H+ H2+ e– C–C–C–C–C–C–C–C Graphene 21 eV bond H C

Russo & Passmore (2014) Nature Methods

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SLIDE 11

no ¡graphene graphene ¡+ 10 ¡s ¡hydrogen graphene ¡+ 20 ¡s ¡ ¡hydrogen graphene ¡+ 40 ¡s ¡ ¡hydrogen

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SLIDE 12

Human 20S proteasome

  • n graphene

no graphene

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  • n graphene

no graphene Apoferritin

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SLIDE 14

20 thousand particles 5.2 Å without motion correction, 5.0 Å with

0.143 0.5 1 10 6.1 5.1 5.2 5.0 3.6 2.7

1/Resolution (Å)

amorphous carbon: before motion correction after correction graphene: before motion correction after correction

b 80S

FSC

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SLIDE 15

Amorphous carbon 0.18 Å/e–/Å2 0.47 Å/e–/A2 6 5 4 3 2 1 ) Å ( t n e m e c a l p s i d S M R 15 12 9 6 3 Fluence (e–/Å2) 600 300 Exposure time (ms) 900

Ribosome speed plots

amorphous carbon

  • n quantifoil

Unsupported ice 0.14 Å/e–/Å2 0.50 Å/e–/Å2 15 12 9 6 3 900 600 300 Exposure time (ms) 15 900 Fluence (e–/Å2)

quantifoil

15 Graphene 0.092 Å/e–/Å2 0.41 Å/e–/Å2 15 12 9 6 3 900 600 300 Exposure time (ms) Fluence (e–/Å2)

graphene

  • n quantifoil
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SLIDE 16
  • Graphene is an excellent support material for cryo-

EM, particularly as an alternative to thin amorphous carbon

  • We can modify and control the surface properties
  • f graphene with low-energy plasmas
  • Using graphene instead of amorphous carbon

reduces noise and radiation induced motion Russo & Passmore (2014) Nature Methods