Lectures 20, 21: Single-cell Sequencing and Assembly - PowerPoint PPT Presentation

Lectures ¡20, ¡21: ¡Single-­‑cell ¡ Sequencing ¡and ¡Assembly ¡ Spring ¡2017 ¡ April ¡20,25, ¡2017 ¡ 1

SINGLE-CELL SEQUENCING AND ASSEMBLY 2

Single-cell Sequencing — Motivation: ◦ Vast majority of environmental bacteria are unculturable outside of their natural habitat. ◦ Cell culture may distort genomic information, e.g. cancerous cells. Metagenomics: — ◦ Superimposed sequencing of mixed cells of different species in one pool. Single-cell genomics : sequencing of one DNA molecule from — one cell. 3

Single Cell Genome Sequencing Start with a single copy of genome. Amplify (copy only) the genome using multiple displacement amplification (MDA) technique. F.B. Dean ,et al., PNAS (2002) 99(8): 5261-6 Fragment the amplified DNA and sequence reads at both ends. 4

Multiple Displacement Amplification Video https://www.youtube.com/watch?v=CaFq9cnfTZI 5

Sequencing Coverage Normal multicell vs. single cell Green regions are blackout Number of reads: ~28 million, read length: 100 bp, genome size: 4.6 Mbp, coverage: ~600x H. Chitsaz, et al. , Nature Biotech 29(10): 915 – 921, Oct 2011 6

Distribution of Coverage A cutoff threshold will eliminate about 25% of valid data in the single cell case, whereas it eliminates noise in the normal multicell case. H. Chitsaz, et al., Nature Biotech 29(10): 915 – 921, Oct 2011 7

Rescuing Low Coverage Contigs A quick example We remove the lowest coverage contig, in blue. 8

Rescuing Low Coverage Contigs After error removal Merged Contig. Coverage = 9 9

Velvet vs. Velvet-SC Velvet assembly algorithm Our assembly algorithm 1: Build a roadmap rdmap from R by indexing all k -mers. (a) EULER-SR error correction 2: Build a de Bruijn pregraph pg from rdmap. 3: Clip tips of pg. 4: Build a graph from pg by threading R . (b) Velvet-SC assembly algorithm 5: Condense graph by merging 1-in 1-out vertices. 1-7: Same as Velvet assembly algorithm. 6: Clip tips of graph . 8: for i =2 to cutoff do 7: Correct graph by the Tour Bus algorithm. i 9: Remove vertices with average coverage < cutoff 8: Remove vertices with average coverage < 10: Clip tips of graph . 9: Clip tips of graph . 11: Correct graph by the Tour Bus algorithm. 10: Correct graph by the Tour Bus algorithm. 12: Resolve repeats using read pairing. 11: Resolve repeats using read pairing. 13: Condense graph by merging 1-in1-out vertices. 12: Condense graph by merging 1-in 1-out vertices. 14: end for 13: Return vertices of graph as contigs. 15: Return vertices of graph as contigs. Daniel Zerbino and Ewan Birney, Genome Hamidreza Chitsaz, et al. , Nature Biotech Research 18: 821-829, 2008 29(10): 915 – 921, Oct 2011 10

E. coli Assembly Results Assembler # NG50 Known Complete contigs (bp) genes genes EULER-SR 1344 26662 4324 3178 Edena 1592 3919 2425 SOAPdenovo 1240 18468 3021 Velvet 428 22648 3055 E+V-SC 501 32051 3753 NG50 = the contig length at which longer contigs represent half of the total genome length. H. Chitsaz, et al., Nature Biotech 29(10): 915 – 921, Oct 2011 11

New Genome Deltaproteobacteria single cell assembly results Assembler # of N50 (bp) contigs Velvet 1856 11531 E+V-SC 823 30293 N50 = the contig length at which longer contigs represent half of the total assembly length. 12

October 2011 13

Single-cell Assemblers — E+Velvet-SC ◦ H. Chitsaz, et al., Nature Biotech 29(10): 915 – 921, Oct 2011. — SPAdes ◦ Anton Bankevich, et al., Journal of Computational Biology 19(5): 455 – 477, 2012. — IDBA-UD ◦ Y. Peng, et al., Bioinformatics 28(11): 1420 – 8, 2012. 14

Coverage Bias Not Sequence Specific 15

Combining Multiple MDAs — Combining DNA from multiple identical single cells, before or after amplification, reduces non-uniformity. — In practice, combining MDA from 6-12 identical cells gives very high quality assemblies. — It is hard to pick identical cells before sequencing. Chicken and egg problem. 16

Synergistic Co-assembly — Our solution: co-assembly ◦ N. Movahedi, et al., IEEE BiBM 2012. ◦ M. Embree, et al., The ISME J. 2013. ◦ N. Movahedi, et al., BMC Genomics, under review. — Another application of co-assembly: variation detection ◦ Iqbal, Z., et al. De novo assembly and genotyping of variants using colored de Bruijn graphs , Nat Genetics, 44, 226 – 232, 2012. 17

SYNERGISTIC CO- ASSEMBLY 18

HyDA Single Cell Co-Assembler — Isolate a number of single cells that are likely to be of the same species. But don’t worry, if they are not, our algorithm will tell you in the end. — Amplify and sequence each of them individually . — Assign a unique color to each read dataset. — Build a colored de Bruijn graph from the colored datasets. Iqbal, et al., Nature Genetics 44: 226–232, 2012. J. Simpson, Genome Informatics 2011. — Iteratively remove errors, condense, and finally output contigs. 19

Small Toy Example Shred reads into k-mers (k = 3) Green Read Red Read G G A C T A A A G A C C A A A T G G A G A C G A C A C C A C T C C A C T A C A A T A A A A A A A A A A T GGA GAC ACT CTA TAA AAA GAC ACC CCA CAA AAA AAT (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ P. Pevzner, J Biomol Struct Dyn (1989) 7:63–73 R. Idury, M. Waterman , J Comput Biol (1995) 2:291–306 20

Small Toy Example Merge vertices labeled by identical k-mers Green Read: GGA GAC ACT CTA TAA AAA (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ Red Read: GAC ACC CCA CAA AAA AAT (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ Resulting Graph: GGA GAC ACT CTA TAA AAA AAT (1x) ‏ (1x) (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ ACC CCA CAA (1x) ‏ (1x) ‏ (1x) ‏ 21

Co-assembly — Condensation is done solely based on graph structure, ignoring colorings. — Maximum colored coverage is used to determine erroneous sequences. 22

Relationships between Co-assembled Sequences Exclusive portion: Exclusivity ratio: Assembly size: 23

Alkane-Degrading Bacterial Community — An alkane-degrading community enriched from sediment from a hydrocarbon-contaminated ditch in Bremen, Germany. — Consists of 3 species: Anaerolinea (2 cells), Smithella (6 cells), and Syntrophus (2 cells), that have sophisticated metabolic interactions. They cannot be cultured. — Finished reference genome for a member of Anaerolinea and a member of Syntrophus is available . In collaboration with Karsten Zengler and Mallory Embree at UCSD. M. Embree, et al., The ISME J., 2013 N. Movahedi, et al. , BMC Genomics , under review 24

Co-assembly Results QUAST results, comparison with the state-of-the-art HyDA ¡ SPAdes ¡ Total (bp) ¡ N50 ¡ Total (bp) ¡ N50 ¡ 1,265,548 ¡ 3,782 ¡ 869,586 ¡ 3,128 ¡ K05 ¡ Syntrophus ¡ 465,091 ¡ 1,928 ¡ 390,923 ¡ 4,234 ¡ C04 ¡ 1,590,259 ¡ 6,977 ¡ 1,415,399 ¡ 10,475 ¡ MEL13 ¡ 1,945,701 ¡ 5,952 ¡ 1,960,722 ¡ 11,372 ¡ MEK03 ¡ 1,569,709 ¡ 5,887 ¡ 1,514,813 ¡ 8,861 ¡ MEB10 ¡ Smithella ¡ 840,236 ¡ 7,295 ¡ 653,866 ¡ 3,834 ¡ K19 ¡ 720,188 ¡ 5,239 ¡ 618,500 ¡ 9,332 ¡ K04 ¡ 1,323,536 ¡ 6,088 ¡ 982,263 ¡ 5,366 ¡ F16 ¡ 1,352,341 ¡ 8,201 ¡ 1,698,195 ¡ 5,944 ¡ F02 ¡ Anaerolinea ¡ 260,386 ¡ 850 ¡ 169,413 ¡ 1,187 ¡ A17 ¡ 25

Co-assembly Results RAST functional elements ¡ HyDA ¡ SPAdes ¡ subsystem ¡ subsystem ¡ ¡ Coding Coding sequence ¡ sequence ¡ 212 ¡ 8 ¡ 146 ¡ 9 ¡ A17 ¡ Anaerolinea ¡ 1,283 ¡ 122 ¡ 1,653 ¡ 153 ¡ F02 ¡ 1,197 ¡ 117 ¡ 899 ¡ 91 ¡ F16 ¡ 659 ¡ 89 ¡ 559 ¡ 75 ¡ K04 ¡ 757 ¡ 82 ¡ 581 ¡ 54 ¡ K19 ¡ 1,491 ¡ 151 ¡ 1,504 ¡ 156 ¡ Smithella ¡ MEB10 ¡ 1,856 ¡ 180 ¡ 1,955 ¡ 200 ¡ MEK03 ¡ 1,535 ¡ 165 ¡ 1,435 ¡ 154 ¡ MEL13 ¡ 416 ¡ 48 ¡ 375 ¡ 49 ¡ C04 ¡ Syntrophus ¡ 1,216 ¡ 121 ¡ 873 ¡ 68 ¡ K05 ¡ 26

Co-assembly Results Exclusivity ratios (%) ¡ Anaerolinea ¡ Smithella ¡ Syntrophus ¡ A17 ¡ F02 ¡ F16 ¡ K04 ¡ K19 ¡ MEB10 ¡ MEK03 ¡ MEL13 ¡ C04 ¡ K05 ¡ Ana. ¡ 0 ¡ 24 ¡ 87 ¡ 95 ¡ 96 ¡ 80 ¡ 82 ¡ 86 ¡ 22 ¡ 19 ¡ A17 ¡ 77 ¡ 0 ¡ 96 ¡ 98 ¡ 99 ¡ 95 ¡ 95 ¡ 96 ¡ 74 ¡ 73 ¡ F02 ¡ Smi. ¡ 96 ¡ 96 ¡ 0 ¡ 73 ¡ 73 ¡ 37 ¡ 22 ¡ 38 ¡ 96 ¡ 55 ¡ F16 ¡ 97 ¡ 97 ¡ 49 ¡ 0 ¡ 67 ¡ 42 ¡ 25 ¡ 45 ¡ 97 ¡ 57 ¡ K04 ¡ 98 ¡ 98 ¡ 54 ¡ 68 ¡ 0 ¡ 35 ¡ 32 ¡ 32 ¡ 98 ¡ 58 ¡ K19 ¡ 96 ¡ 96 ¡ 48 ¡ 74 ¡ 69 ¡ 0 ¡ 24 ¡ 39 ¡ 95 ¡ 56 ¡ MEB10 ¡ 97 ¡ 97 ¡ 49 ¡ 73 ¡ 74 ¡ 38 ¡ 0 ¡ 37 ¡ 96 ¡ 61 ¡ MEK03 ¡ 97 ¡ 97 ¡ 50 ¡ 76 ¡ 68 ¡ 39 ¡ 22 ¡ 0 ¡ 97 ¡ 59 ¡ MEL13 ¡ Syn. ¡ 44 ¡ 39 ¡ 89 ¡ 96 ¡ 97 ¡ 85 ¡ 86 ¡ 90 ¡ 0 ¡ 64 ¡ C04 ¡ 77 ¡ 75 ¡ 54 ¡ 76 ¡ 75 ¡ 45 ¡ 41 ¡ 49 ¡ 73 ¡ 0 ¡ K05 ¡ 27

HyDA Outline Index all distinct k-mers, storing their multiplicities and 1. connections, in a hash table. Each hash node is a self-balancing tree. Construct the condensed de Bruijn graph. 2. Iteratively remove low coverage vertices and recondense. 3. Under development and future work: resolve repeats using long 4. reads and mate pairs. 28