1 1 Our team Menno, Yifan, Mark, Marcel, Isabelle - - PowerPoint PPT Presentation

1 ¡ 1 ¡

2 ¡ 2 ¡

Menno, ¡Yifan, ¡Mark, ¡Marcel, ¡Isabelle ¡ ¡ Lizah, ¡Stephanie, ¡E;ychia, ¡Lakshmeesh, ¡Sietske ¡ ¡

Our ¡team

3 ¡ 3 ¡

Our ¡project: ¡Snifferomyces

What? ¡

• ­‑ ¡ ¡Transfer ¡olfactory ¡capabiliHes ¡from ¡mammalian ¡

species ¡to ¡a ¡unicellular ¡chassis ¡ Why? ¡

• ­‑ VersaHlity ¡
• ­‑ High ¡sensiHvity ¡
• ­‑ Possible ¡outputs ¡

How? ¡

• ­‑ By ¡making ¡a ¡standard ¡for ¡receptor ¡expression ¡

4 ¡ 4 ¡

Georgies ¡F. ¡Mgode ¡et ¡al. ¡J. ¡Clin. ¡Microbiol. ¡(2012) ¡274-­‑280 ¡ Tuberculosis ¡bacteria ¡picture: ¡Wikipedia ¡ Rat ¡picture: ¡McCormack, ¡Gerald ¡(2007) ¡Cook ¡Islands ¡Biodiversity ¡Database ¡ 1: ¡WHO ¡factsheet ¡no. ¡104 ¡

Case ¡Study: ¡Tuberculosis ¡DiagnosHcs ¡ The ¡Need: ¡

• ­‑ Over ¡95% ¡of ¡TB ¡related ¡deaths ¡
• ccur ¡in ¡low-­‑and ¡middle ¡income ¡

countries.1 ¡

• ­‑ Fast ¡and ¡accurate ¡TB ¡diagnosis ¡is ¡

relaHvely ¡expensive. ¡ An ¡alterna.ve ¡cheap ¡and ¡accurate ¡ diagnosis ¡is ¡needed! ¡

5 ¡ 5 ¡

Pheromone cascade:Versele et. al. EMBO Rep. (2001) vol. 2 no. 7 pp 574-579

Yeast ¡can ¡serve ¡as ¡chassis ¡

A ¡similar ¡GPCR ¡system ¡in ¡ Saccharomyces ¡cerevisiae ¡

6 ¡ 6 ¡

Your ¡Favorite ¡Receptor ¡

Transcrip.on ¡response: ¡GFP ¡

Pheromone ¡Receptor ¡

AdaptaHons ¡of ¡the ¡GPCR ¡cascade ¡

Δfar1 ¡

Pheromone cascade: Versele et. al. EMBO Rep. (2001) vol. 2 no. 7 pp 574-579

Pheromone ¡sensing ¡ ¡ ¡ Olfactory ¡sensing ¡

7 ¡ 7 ¡

Supercomputing Adapted ¡Niacin ¡receptor ¡ from ¡Zhang ¡server ¡ Molecular ¡Dynamics ¡ ¡ Executed ¡by ¡YASARA ¡ Alignment ¡ ¡ Between ¡human ¡and ¡ ¡ I7-­‑Rat ¡receptor ¡ N ¡terminus ¡and ¡first ¡ helix: ¡ Membrane ¡targeHng ¡ sequence ¡ Ac.ve ¡region: ¡ ¡ Binding ¡niche ¡to ¡ligand ¡ C ¡terminus: ¡ ¡ Increase ¡affinity ¡with ¡ subunits ¡

Receptor: ¡Venkat ¡Radhika ¡et ¡al. ¡Nature ¡chem. ¡Biol. ¡V.3 ¡No. ¡6 ¡p. ¡325-­‑330 ¡

• J. ¡Zhang: ¡Zhang ¡et ¡all ¡GPCR-­‑ITASSER ¡(2011) ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Chimeric ¡design ¡

8 ¡ 8 ¡

Receptor ¡ + ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Reporter ¡ = ¡ ¡Snifferomyces ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Wetlab ¡Results

Methyl ¡NicoHnate ¡ Niacin ¡ Tuberculosis ¡bacterium ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡TargeHng ¡tuberculosis

9 ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Design ¡of ¡the ¡Receptor

• Rat ¡I7 ¡N-­‑ ¡and ¡C-­‑terminal ¡ends ¡
• FLAG ¡tag ¡
• RestricHon ¡sites ¡

10 ¡ 10 ¡

Transformant ¡ ¡ Reference ¡ ¡

Receptor ¡is ¡in ¡the ¡membrane

Brighhield ¡ Fluorescence ¡ Distance ¡(pixels) ¡ Fluorescence ¡(AU) ¡

C O R R E C T M E M B R A N E L O C A L I Z A T I O N !

11 ¡ 11 ¡

Transformed ¡cells ¡respond

• Flow ¡cytometry ¡experiment ¡performed ¡
• DNA ¡stained ¡with ¡fluorescent ¡dye ¡

Transformant ¡ Niacin ¡induced ¡

Count ¡

Reference ¡ ¡ Niacin ¡induced ¡ Transformant ¡ Uninduced ¡

Fluorescence ¡

R E S P O N S E T O N I A C I N !

12 ¡

Design ¡of ¡the ¡reporter

• FUS1 ¡promoter ¡induced ¡by ¡the ¡cascade ¡
• EGFP ¡reporter ¡as ¡indicator ¡of ¡the ¡pathway ¡

13 ¡

Response ¡of ¡the ¡reporter

• InducHon ¡with ¡alpha ¡pheromone ¡
• Fluorescence ¡measurements ¡
• Consistent ¡with ¡Flow ¡Cytometry ¡data ¡

R E P O R T E R W O R K S A S E X P E C T E D !

14 ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Snifferomyces

• Snifferomyces ¡= ¡receptor ¡+ ¡reporter ¡
• Integrated ¡in ¡one ¡single ¡BioBrick ¡

15 ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Snifferomyces

Niacin ¡ ¡ No ¡ligand ¡ Alpha ¡pheromone ¡

• N=400 ¡
• Intensity ¡of ¡250 ¡saturated: ¡pixel ¡saturaHon ¡

S N I F F E R O M Y C E S R E S P O N D S T O N I A C I N !

Modeling Results

Receptor Pathway Sniffer-O-Meter

Rat-I7 Niacin Receptor Niacin

Molecular Dynamics

Rat-I7 Niacin Receptor Methyl nicotinate

Molecular Dynamics

Rat-I7 Niacin Receptor Re-engineered (R251K) Methyl nicotinate

Molecular Dynamics

Rat-I7 Niacin Receptor Re-engineered (R251K) Methyl nicotinate

Molecular Dynamics

I M P R O V E D B I N D I N G E N E R G Y !

21 ¡ 21 ¡

• Does ¡the ¡FUS1-­‑EGFP ¡reporter ¡give ¡a ¡

quanHtaHve ¡response ¡to ¡the ¡input? ¡

• How ¡long ¡does ¡it ¡take ¡before ¡you ¡can ¡see ¡a ¡

response? ¡ QuesHons

22 ¡ 22 ¡

Pathway ¡Model

• Literature ¡study1,2 ¡

– Complex ¡(too ¡many ¡ parameters) ¡

• Model ¡simplificaHon ¡ ¡

– 17 ¡species, ¡21 ¡parameters ¡

• SensiHvity ¡analysis ¡based ¡

parameter ¡esHmaHon ¡

• NegaHve ¡eigenvalues ¡ ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡stable ¡and ¡realizable ¡system ¡ ¡ ¡

1: ¡T. ¡Yi ¡et ¡al. ¡PNAS(2003) ¡vol. ¡100 ¡no. ¡19 ¡ ¡ 2: ¡Kofahl ¡et ¡al. ¡Yeast ¡(2004) ¡vol ¡21. ¡831-­‑850 ¡

23 ¡ 23 ¡

Model ¡predicHons

Predicted ¡ Measured ¡

24 ¡ 24 ¡

Answers

• Does ¡the ¡FUS1-­‑EGFP ¡reporter ¡give ¡a ¡quanHtaHve ¡response ¡to ¡

the ¡input? ¡ – Yes ¡

• How ¡long ¡does ¡it ¡take ¡before ¡you ¡can ¡see ¡a ¡response ¡? ¡

– IniHal ¡response ¡~ ¡20 ¡min ¡ – Peak ¡response ¡~ ¡2.5 ¡hrs ¡

25 ¡ 25 ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Ethics-­‑based ¡design ¡approach ¡

• Who ¡is ¡this ¡tool ¡for? ¡Can ¡they ¡afford ¡it? ¡
• Does ¡the ¡tool ¡need ¡to ¡be ¡operated ¡by ¡trained ¡

professionals? ¡

• Work ¡jointly ¡with ¡stakeholders ¡to ¡achieve ¡our ¡

end ¡result. ¡

26 ¡ 26 ¡

‘’We ¡use ¡a ¡chemical ¡nose ¡that ¡has ¡a ¡lot ¡of ¡false ¡posiHves, ¡how ¡is ¡ this ¡in ¡your ¡device?’’ ¡

Royal Marechaussee

27 ¡ 27 ¡

• Biological ¡funcHons ¡are ¡

inherently ¡stochasHc ¡

• Analysis ¡for ¡false ¡posiHves ¡

and ¡false ¡negaHves ¡

SensiHvity ¡& ¡Specificity

28 ¡ 28 ¡

SensiHvity ¡& ¡Specificity

29 ¡ 29 ¡

InformaHon ¡Processing ¡Capacity ¡

Automatic image acquisition Automatic image processing

[1] Cheong et al.,Science, 334 (6054): 354-358 (2011) [2] Colman-Lerner et al,Nature 437, 699-706 (2005)

B I O B I T O F . 8 !

30 ¡ 30 ¡

Sniffer-­‑O-­‑Meter ¡

• Contained ¡environment ¡
• RelaHvely ¡cheap: ¡under ¡5 ¡euros ¡

30 ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Medium ¡ TagGFP2 ¡E.coli ¡ “Much more research is needed before we can use this in the medical field, but the beginning

• f this project will probably lead up to a new

detection method” Dr. Rene Lutter, Academical Centre University of Amsterdam

S N I F F E R

• O
• M

E T E R C A N D E T E C T G F P S I G N A L !

31 ¡

Achievements

32 ¡ 32 ¡

Achievements ¡Wetlab

Receptor ¡

• Membrane ¡targeHng ¡
• Response ¡to ¡niacin ¡

Reporter ¡

• QuanHtaHve ¡response ¡to ¡input ¡

Snifferomyces ¡

• GFP ¡output ¡in ¡response ¡to ¡niacin ¡
• Build ¡your ¡own ¡receptor ¡protocol ¡

33 ¡ 33 ¡

Achievements ¡Modeling

By ¡using ¡a ¡broad ¡spectrum ¡of ¡techniques ¡(PDE, ¡ODE, ¡SDE, ¡ ¡MD, ¡ informaHon ¡theory), ¡we ¡have ¡developed ¡models ¡spanning: ¡

• The ¡molecular ¡level ¡(structural ¡model, ¡MD) ¡

– Improved ¡binding ¡affinity ¡for ¡methyl ¡nicoHnate ¡

• The ¡cellular ¡level ¡(ODE, ¡SDE) ¡

– Pathway ¡model ¡reproduced ¡and ¡elucidated ¡lab ¡results ¡ – StochasHc ¡model ¡developed ¡for ¡specificity ¡and ¡sensiHvity ¡analysis ¡

• The ¡populaHon ¡level ¡(PDE, ¡informaHon ¡theory) ¡

– CalculaHons ¡have ¡shown ¡need ¡for ¡populaHon ¡ ¡ – Proof-­‑of-­‑concept ¡has ¡led ¡to ¡devising ¡the ¡Sniffer-­‑O-­‑Meter

¡ ¡ ¡ ¡ ¡

33 ¡

34 ¡ 34 ¡

Advisors: ¡ ¡

• Dr. ¡Anne ¡Meyer ¡
• Ing. ¡Esengül ¡Yildirim ¡
• Dr. ¡Ir. ¡Alessandro ¡Abate ¡ ¡
• Dr. ¡Emrah ¡Nikerel ¡
• Dr. ¡Aljoscha ¡Wahl ¡
• MSc. ¡Ilya ¡Tkachev ¡
• MSc. ¡Calin ¡Plesa ¡
• MSc. ¡Daniel ¡Solis ¡

Acknowledgements

And all the contributors, many thanks!

35 ¡ 35 ¡

Do ¡it ¡Yourself ¡!!!! ¡

36 ¡ 36 ¡

QuesHons ¡

37 ¡ 37 ¡

Flow ¡cytometry ¡data ¡reporter ¡

38 ¡ 38 ¡

CreaHng ¡awareness

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Reporter ¡raw ¡data ¡

40 ¡ 40 ¡

Vector ¡isolaHon ¡a;er ¡transformaHon ¡

41 ¡ 41 ¡

Knock-­‑out ¡alpha ¡subunit ¡

42 ¡ 42 ¡

Flow ¡cytometry ¡I7-­‑odr10 ¡receptor ¡

43 ¡ 43 ¡

Niacin ¡pathway ¡

Belenky ¡et ¡al. ¡PLoS ¡One ¡(2011) ¡6 ¡e ¡19710 ¡

44 ¡ 44 ¡

InterKingdom ¡communicaHon ¡

Δa91 ¡knockout ¡in ¡Yeast ¡ required ¡

45 ¡ 45 ¡

Flow ¡cytometry ¡Banana ¡receptor ¡

Human Niacin Receptor Niacin

Molecular Dynamics

47 ¡ 47 ¡

48 ¡ 48 ¡

See ¡the ¡wiki ¡