Structure and Func,on of Motor Units and Neuromuscular - - PowerPoint PPT Presentation

Structure ¡and ¡Func,on ¡of ¡Motor ¡ Units ¡and ¡Neuromuscular ¡Junc,ons ¡

• Background ¡informa/on ¡– ¡the ¡role ¡of ¡motor ¡units ¡and ¡

neuromuscular ¡junc3ons ¡ ¡

• “The ¡Interscutularis ¡muscle ¡connectome” ¡(Paper ¡1) ¡

¡

• “Iden2ty, ¡developmental ¡restric2on ¡and ¡reac2vity ¡of ¡

extralaminar ¡cells ¡capping ¡mammalian ¡neuromuscular ¡ junc2ons” ¡(Paper ¡3) ¡ ¡

• “Early ¡vulnerability ¡to ¡ischaemia/reperfusion ¡injury ¡in ¡

motor ¡terminals ¡innerva2ng ¡fast ¡muscles ¡of ¡SOD1-­‑G93A ¡ mice” ¡(Paper ¡4) ¡ ¡

• “Morphological ¡characteris2cs ¡of ¡motor ¡neurons ¡do ¡not ¡

determine ¡their ¡rela2ve ¡suscep2bility ¡to ¡degenera2on ¡in ¡a ¡ mouse ¡model ¡of ¡severe ¡SMA” ¡(Paper ¡2) ¡ ¡

• Summary ¡

Background ¡

• Motor ¡units ¡

– Motor ¡neurons ¡are ¡s3mulated ¡by ¡signals ¡from ¡the ¡ cortex ¡to ¡cause ¡muscle ¡contrac3on ¡ – Neuron ¡axon ¡branches ¡into ¡muscle ¡and ¡forms ¡ connec3ons ¡with ¡several ¡individual ¡muscle ¡fibres ¡ – The ¡collec3on ¡of ¡muscle ¡fibres ¡innervated ¡by ¡a ¡ single ¡motor ¡neuron ¡= ¡MOTOR ¡UNIT ¡

• Henneman's ¡size ¡principle ¡

– When ¡a ¡muscle ¡contracts, ¡the ¡motor ¡units ¡ s3mulated ¡to ¡ini3ate ¡contrac3on ¡are ¡recruited ¡in ¡ size ¡order ¡ – Increasing ¡force ¡à à ¡increasing ¡number ¡& ¡size ¡of ¡ motor ¡units ¡ac/vated ¡

• Neuromuscular ¡junc2ons ¡

– Each ¡axon ¡branch ¡of ¡a ¡motor ¡neuron ¡forms ¡a ¡ chemical ¡synapse ¡with ¡a ¡muscle ¡fibre ¡-­‑ ¡NMJ ¡ – NMJs ¡consist ¡of; ¡

• motor ¡neuron ¡nerve ¡terminal ¡
• muscle ¡fibre ¡
• terminal ¡Schwann ¡cell ¡
• kranocyte? ¡

• Importance? ¡

– Forma3on ¡of ¡healthy ¡func3oning ¡NMJs ¡(and ¡ therefore ¡ ¡motor ¡units) ¡is ¡essen3al ¡for ¡muscle ¡ contrac3on ¡ – Degenera3on ¡and ¡failure ¡of ¡NMJs ¡is ¡seen ¡in ¡ numerous ¡neurodegenera3ve ¡diseases ¡ – Thorough ¡understanding ¡of ¡mechanisms ¡ underlying ¡NMJ ¡and ¡motor ¡unit ¡development/ ¡ func3on/ ¡degenera3on ¡à ¡clinical ¡relevance ¡

The ¡Interscutularis ¡ Muscle ¡Connectome ¡

Ju ¡Lu, ¡Juan ¡Carlos ¡Tapia, ¡Olivia ¡L. ¡ White, ¡Jeff ¡W. ¡Lichtman ¡

Introduc3on ¡

• Nervous ¡systems ¡connec3vity ¡fundamental ¡

determinant ¡of ¡func3on ¡-­‑ ¡not ¡readily ¡ accessible ¡

• Connectome ¡= ¡map ¡of ¡neural ¡connec3ons ¡in ¡

the ¡nervous ¡system ¡of ¡an ¡organism ¡ ¡

• Aim: ¡to ¡generate ¡a ¡complete ¡connectome ¡of ¡

the ¡mouse ¡interscutularis ¡muscle ¡circuit ¡

Background ¡

• Only ¡completed ¡connectome ¡= ¡C.elegans ¡

– Valuable ¡resource ¡for ¡the ¡further ¡study ¡of ¡circuits ¡ underlying ¡C.elegans ¡behaviour. ¡ ¡

Background ¡

• Previous ¡work ¡on ¡neuronal ¡connec3vity ¡has ¡

relied ¡on ¡pooling ¡sta3s3cal ¡data ¡from ¡mul3ple ¡ animals ¡

• Many ¡assump3ons ¡therefore ¡oversimplified ¡
• Therefore ¡beZer ¡to ¡obtain ¡complete ¡wiring ¡

diagrams ¡through ¡direct ¡observa3on. ¡Can ¡obtain ¡ informa3on ¡about: ¡

– The ¡number ¡and ¡posi3on ¡of ¡all ¡the ¡postsynap3c ¡ targets ¡ – Branching ¡topology ¡ – Neighbour ¡rela3ons ¡

Methods ¡

• Mouse ¡interscutularis ¡-­‑ ¡small, ¡very ¡thin ¡and ¡is ¡

innervated ¡by ¡rela3vely ¡few ¡neurons. ¡ ¡

• Used ¡YFP-­‑16 ¡mice ¡– ¡express ¡fluorescent ¡

protein ¡in ¡100% ¡of ¡motor ¡neurons. ¡ ¡

• Confocal ¡microscopy ¡and ¡semi-­‑automated ¡3D ¡

reconstruc3on ¡tools ¡

• Obtained ¡complete ¡connectomes ¡of ¡6 ¡

interscutularis ¡muscles ¡in ¡4 ¡mice. ¡ ¡

Methods ¡

Reconstruc3ng ¡Neuromuscular ¡Connectomes ¡

Typical ¡datasets ¡for ¡

• ne ¡muscle ¡= ¡~150 ¡

image ¡stacks, ¡each ¡ stack ¡on ¡average ¡ consis3ng ¡of ¡~ ¡150 ¡ images ¡ All ¡the ¡axons ¡labelled ¡with ¡YFP ¡in ¡the ¡interscutularis ¡muscle ¡were ¡imaged ¡by ¡confocal ¡

• microscopy. ¡A ¡montage ¡of ¡146 ¡overlapping ¡image ¡stacks ¡provided ¡the ¡data ¡set ¡total ¡

(A). ¡Adjacent ¡stacks ¡had ¡10% ¡overlap ¡to ¡guarantee ¡precision ¡of ¡alignment. ¡

Methods ¡

Each ¡XY ¡stack ¡was ¡digitally ¡resampled ¡along ¡ an ¡orthogonal ¡axis ¡so ¡that ¡most ¡axons ¡could ¡ be ¡followed ¡in ¡cross ¡sec3ons. ¡ ¡ ¡ Axons ¡were ¡then ¡colour ¡coordinated ¡and ¡ semi-­‑automa3c ¡tracing ¡sohware ¡was ¡used ¡ to ¡create ¡a ¡3D ¡reconstruc3on. ¡ ¡

Methods ¡

Tes3ng ¡Reconstruc3on ¡Accuracy ¡

Appearance ¡of ¡the ¡ nerve ¡in ¡the ¡KOFP ¡ channel ¡ Reconstruc3on ¡results ¡ for ¡doubly ¡labelled ¡

• axons. ¡Lavender ¡= ¡KOFP

+CFP, ¡Yellow ¡= ¡KOFP ¡+ ¡ YFP ¡ ¡ All ¡three ¡florescent ¡ channels ¡shown ¡for ¡the ¡ volume ¡– ¡results ¡iden3cal ¡ for ¡the ¡doubly ¡labelled ¡

• axons. ¡ ¡

Used ¡triple ¡transgenic ¡mouse: ¡

• All ¡axons ¡expressed ¡KOFP ¡(orange) ¡
• Small ¡subset ¡expressed ¡in ¡addi3on ¡either ¡CFP ¡or ¡YFP ¡

¡ Doubly ¡labelled ¡axons ¡were ¡selected ¡and ¡then ¡reconstructed ¡using ¡KOFP ¡ channel ¡only ¡

Results ¡

• 1. Evidence ¡for ¡the ¡size ¡principle ¡
• 2. Rela3onships ¡between ¡axonal ¡caliber, ¡arbor ¡

length ¡and ¡motor ¡unit ¡size ¡

• 3. Axon ¡variability ¡

A ¡-­‑ ¡Unique ¡branching ¡structures ¡ B ¡-­‑ ¡Nerve ¡fascicula3on ¡paZerns ¡ C ¡-­‑ ¡Variability ¡between ¡L ¡and ¡R ¡connectomes ¡

• 4. Subop3mal ¡wiring ¡length ¡

The ¡Interscutularis ¡Muscle ¡

Connectomes ¡of ¡a ¡L ¡and ¡R ¡pair ¡of ¡interscutularis ¡muscles. ¡Axons ¡colour ¡coded ¡ based ¡on ¡the ¡rank ¡order ¡of ¡their ¡motor ¡unit ¡sizes ¡in ¡each ¡connectome. ¡

1 ¡-­‑ ¡Evidence ¡for ¡the ¡Size ¡Principle ¡

• Range ¡of ¡motor ¡unit ¡sizes ¡

was ¡similar ¡to ¡that ¡found ¡in ¡ twitch ¡tension ¡recordings ¡ from ¡previous ¡data ¡ ¡

• Twitch ¡tension ¡distribu3on ¡

and ¡the ¡motor ¡unit ¡size ¡ distribu3on ¡shared ¡the ¡same ¡ shape ¡ ¡

– motor ¡unit ¡sizes ¡are ¡the ¡ anatomical ¡underpinning ¡of ¡ the ¡observed ¡distribu3on ¡of ¡ twitch ¡tensions. ¡

Motor ¡unit ¡size ¡distribu3on ¡in ¡each ¡muscle ¡was ¡ skewed ¡towards ¡smaller ¡motor ¡units ¡

¡ 1 ¡-­‑ ¡Evidence ¡for ¡the ¡Size ¡Principle ¡ ¡

• Provides ¡anatomical ¡evidence ¡for ¡Henneman’s ¡

size ¡principle: ¡

– slow, ¡low-­‑force, ¡fa2gue-­‑resistant ¡muscle ¡fibres ¡are ¡ ac2vated ¡before ¡the ¡fast, ¡high-­‑force, ¡less ¡fa2gue-­‑ resistant ¡muscle ¡fibres. ¡ ¡ – In ¡order ¡to ¡move ¡a ¡load, ¡motor ¡units ¡are ¡recruited ¡ in ¡order ¡from ¡smallest ¡to ¡largest ¡ ¡

Un/l ¡now ¡this ¡was ¡just ¡a ¡physiological ¡concept ¡

¡ 2 ¡-­‑ ¡Rela3onship ¡Between ¡Axonal ¡Caliber, ¡ Arbor ¡Length ¡and ¡Motor ¡Unit ¡Size ¡

¡

• Found ¡a ¡rela3onship ¡between ¡

axonal ¡caliber, ¡arbor ¡length ¡ and ¡motor ¡unit ¡size. ¡

• C ¡-­‑ ¡Normalized ¡axonal ¡cross-­‑

sec3onal ¡area ¡scaled ¡as ¡the ¡ square ¡root ¡of ¡motor ¡unit ¡ sizes ¡ ¡

• D ¡-­‑ ¡Axonal ¡arbor ¡length ¡scaled ¡

linearly ¡with ¡normalized ¡area ¡ ¡

• E ¡-­‑ ¡Arbor ¡length ¡scaled ¡as ¡the ¡

square ¡root ¡of ¡motor ¡unit ¡size ¡ ¡

¡ 2 ¡-­‑ ¡Rela3onship ¡between ¡axonal ¡caliber, ¡ arbor ¡length ¡and ¡motor ¡unit ¡size ¡

¡ ¡

• Axonal ¡caliber ¡is ¡propor3onal ¡to ¡axoplasmic ¡

transport, ¡therefore ¡it ¡may ¡scale ¡with ¡ downstream ¡metabolic ¡expenditure. ¡ ¡

• The ¡energy ¡expenditure ¡= ¡res3ng ¡and ¡ac3on ¡

poten3als ¡instead ¡of ¡synap3c ¡transmission ¡

– propor3onal ¡to ¡the ¡surface ¡area ¡of ¡the ¡axonal ¡

• membrane. ¡ ¡
• As ¡long ¡as ¡axonal ¡caliber ¡remains ¡rela3vely ¡

constant, ¡the ¡surface ¡area ¡is ¡propor3onal ¡to ¡ arbour ¡length ¡– ¡may ¡explain ¡linear ¡rela3onship ¡ between ¡axonal ¡caliber ¡and ¡arbor ¡length. ¡ ¡

• 3. ¡Axon ¡Variability ¡

¡ A ¡-­‑ ¡Unique ¡branching ¡structures ¡ B ¡-­‑ ¡Nerve ¡fascicula3on ¡paZerns ¡ C ¡-­‑ ¡Variability ¡between ¡L ¡and ¡R ¡connectomes ¡

¡

3A ¡-­‑ ¡Unique ¡Axonal ¡Branching ¡ Structure ¡of ¡Motor ¡Neurons ¡ ¡

• Primary ¡subtrees ¡of ¡

individual ¡axons ¡were ¡ not ¡uniformly ¡ distributed ¡– ¡appeared ¡ to ¡invade ¡non ¡

• verlapping ¡territories ¡
• Primary ¡subtrees ¡

belonging ¡to ¡different ¡ axons ¡tend ¡to ¡have ¡

• verlapping ¡territories ¡

NMJs ¡innervated ¡by ¡one ¡subtree ¡(orange) ¡are ¡marked ¡ by ¡red ¡dots; ¡NMJs ¡innervated ¡by ¡the ¡other ¡subtree ¡ (cyan) ¡are ¡marked ¡by ¡green ¡dots. ¡Lines ¡connec3ng ¡dots ¡ are ¡the ¡minimal-­‑spanning ¡tree ¡(MST) ¡constructed ¡from ¡ the ¡coordinates ¡of ¡NMJs. ¡ ¡ The ¡MST ¡is ¡par33oned ¡into ¡two ¡disjoint ¡subtrees, ¡each ¡ corresponding ¡to ¡one ¡subtree ¡of ¡the ¡original ¡axonal ¡

• arbor. ¡

3A ¡-­‑ ¡Unique ¡Axonal ¡Branching ¡ Structure ¡of ¡Motor ¡Neurons ¡

• This ¡arrangement ¡suggests ¡a ¡developmental ¡

mechanism ¡that ¡prevents ¡mul3ple ¡branches ¡of ¡ the ¡same ¡axon ¡from ¡projec3ng ¡to ¡the ¡same ¡ region ¡(self ¡avoidance?) ¡ ¡

– mul3ple ¡axons ¡innervate ¡the ¡same ¡muscle ¡fiber ¡at ¡ early ¡developmental ¡stages, ¡whereas ¡rarely ¡do ¡ two ¡branches ¡of ¡the ¡same ¡axon ¡innervate ¡a ¡single ¡ muscle ¡fibre. ¡ ¡

3B ¡-­‑ ¡Nerve ¡Fascicula3on ¡PaZerns ¡

• Fascicula3on: ¡the ¡tendency ¡of ¡developing ¡

neurites ¡to ¡grow ¡along ¡exis2ng ¡neurons ¡and ¡ hence ¡form ¡bundles/fascicles ¡

• Rela3onship ¡between ¡branching ¡structures ¡of ¡

individual ¡axons ¡and ¡nerve ¡fascicles ¡was ¡ surprisingly ¡complicated. ¡

• Axons ¡branching ¡behaviour ¡was ¡not ¡strictly ¡

coupled ¡to ¡the ¡fascicula3on ¡paZern ¡of ¡the ¡

• nerve. ¡ ¡

3B ¡-­‑ ¡Nerve ¡Fascicula3on ¡PaZerns ¡

At ¡some ¡nerve ¡branching ¡points ¡ no ¡axons ¡branched, ¡different ¡ axons ¡simply ¡followed ¡one ¡of ¡the ¡ paths ¡ Some ¡axons ¡branched ¡inside ¡a ¡ nerve ¡segment ¡and ¡the ¡resultant ¡ branches ¡travelled ¡in ¡parallel ¡ along ¡the ¡same ¡segment ¡

3B ¡-­‑ ¡Nerve ¡Fascicula3on ¡PaZerns ¡

• Although ¡most ¡fasciculated ¡

nerve ¡segments ¡travel ¡in ¡a ¡ proximal-­‑distal ¡direc3on, ¡ some ¡axonal ¡branches ¡ contained ¡in ¡them ¡did ¡not ¡not ¡ follow ¡the ¡same ¡direc3on. ¡ ¡

• Overall ¡89.4% ¡of ¡the ¡axons ¡

deviated ¡in ¡some ¡way ¡from ¡ being ¡a ¡proper ¡subgraph ¡of ¡ the ¡nerve ¡fascicula/on ¡

• paQern. ¡ ¡
• Seems ¡unlikely ¡that ¡nerve ¡

fascicula/on ¡paQerns ¡in ¡a ¡ muscle ¡are ¡gene/cally ¡

• predetermined. ¡ ¡

Axonal ¡branches ¡traveling ¡in ¡opposite ¡ direc3ons ¡in ¡the ¡same ¡nerve ¡fascicle. ¡ ¡

3C ¡-­‑ ¡Variability ¡between ¡L ¡and ¡R ¡ connectomes ¡

• Compared ¡differences ¡between ¡L ¡and ¡R ¡copies ¡of ¡

the ¡interscutularis ¡muscle. ¡ ¡

– Number ¡of ¡muscle ¡fibers ¡on ¡L ¡and ¡R ¡side ¡= ¡not ¡ significantly ¡different ¡ – Distribu3on ¡of ¡muscle ¡fiber ¡types ¡= ¡not ¡significantly ¡

• different. ¡ ¡

– Number ¡of ¡innerva3ng ¡motor ¡neurons ¡= ¡not ¡ significantly ¡different ¡ – No ¡evidence ¡for ¡common ¡branching ¡paQerns ¡ – Wide ¡range ¡of ¡different ¡topologies ¡between ¡axons ¡of ¡ the ¡same ¡rank ¡

3C ¡-­‑ ¡Variability ¡between ¡L ¡and ¡R ¡ connectomes ¡

Largest ¡motor ¡units ¡ exhibited ¡different ¡ topological ¡structures ¡ Ten ¡motor ¡units ¡with ¡ iden3cal ¡motor ¡unit ¡size ¡for ¡ 6 ¡muscles ¡all ¡had ¡different ¡ topologies ¡

3C ¡-­‑ ¡Variability ¡between ¡L ¡and ¡R ¡ connectomes ¡

¡Used ¡TED ¡(tree-­‑edi3ng ¡distance) ¡to ¡quan3fy ¡ ¡topological ¡differences ¡between ¡axons. ¡

TED ¡differences ¡not ¡significant ¡ between ¡intra-­‑animal ¡L ¡and ¡R ¡ pairs, ¡inter-­‑animal ¡ipsi-­‑lateral ¡and ¡ inter-­‑animal ¡L ¡and ¡R ¡pairs. ¡ ¡

3 ¡-­‑ ¡Axon ¡Variability ¡

• Intra-­‑animal ¡variance ¡surprising ¡as ¡each ¡pair ¡of ¡

neurons ¡has ¡an ¡iden3cal ¡gene3c ¡background. ¡

• Suggests ¡branching ¡paZerns ¡of ¡these ¡neurons ¡is ¡not ¡

predetermined, ¡contrasts ¡strongly ¡with ¡the ¡situa3on ¡in ¡

• invertebrates. ¡ ¡

– C.elegans ¡connectome ¡revealed ¡remarkable ¡stereotypy ¡in ¡ the ¡structure ¡of ¡the ¡neural ¡circuit. ¡ ¡

• In ¡mammals ¡the ¡variability ¡in ¡pre-­‑terminal ¡branching ¡

and ¡NMJs ¡structure ¡suggests ¡that ¡axonal ¡branching ¡in ¡ the ¡mammalian ¡system ¡is ¡fundamentally ¡different ¡from ¡ that ¡found ¡in ¡invertebrates. ¡ ¡

¡ 4 ¡-­‑ ¡Subop3mal ¡Wiring ¡Length ¡ ¡

• Axonal ¡trajectories ¡did ¡not ¡adhere ¡to ¡the ¡

principle ¡of ¡minimiza3on ¡of ¡total ¡wiring ¡length ¡ (which ¡is ¡supported ¡by ¡the ¡full ¡reconstruc3on ¡

• f ¡the ¡C.elegans ¡NS) ¡
• Inspec3on ¡of ¡the ¡connectome ¡showed ¡that ¡

almost ¡every ¡axons ¡total ¡length ¡could ¡be ¡ shortened ¡by ¡following ¡different ¡nerve ¡ fascicles ¡or ¡altering ¡the ¡loca3on ¡of ¡branching ¡

• points. ¡ ¡

4 ¡-­‑ ¡Subop3mal ¡Wiring ¡Length ¡

Wiring ¡of ¡motor ¡axons ¡was ¡ superimposed ¡on ¡the ¡nerve ¡ fascicles ¡of ¡the ¡en3re ¡

• muscle. ¡Axon ¡took ¡a ¡long ¡

detour ¡(yellow ¡arrows) ¡even ¡ though ¡a ¡much ¡shorter ¡path ¡ existed ¡(black ¡arrow). ¡In ¡ addi3on, ¡it ¡did ¡not ¡branch ¡ directly ¡to ¡innervate ¡the ¡ NMJ ¡to ¡the ¡leh, ¡but ¡only ¡did ¡ so ¡aher ¡looping ¡back ¡(white ¡ arrows). ¡ ¡

4 ¡-­‑ ¡Subop3mal ¡Wiring ¡Length ¡

• C.elegans ¡neural ¡wiring ¡approximates ¡the ¡op3mal ¡

solu3on ¡fairly ¡well ¡

• Subop3mality ¡in ¡wiring ¡length ¡does ¡not ¡imply ¡that ¡the ¡
• p3miza3on ¡principle ¡is ¡inapplicable, ¡rather ¡suggests ¡

that ¡factors ¡other ¡than ¡wiring ¡length ¡also ¡play ¡a ¡ significant ¡role ¡

• Invertebrate ¡system ¡= ¡gene3c ¡control ¡
• The ¡mammalian ¡system ¡may ¡rely ¡more ¡strongly ¡on ¡

ac3vity ¡dependent ¡reorganisa3ons ¡for ¡each ¡individual ¡ neural ¡circuit ¡to ¡seZle ¡on ¡a ¡par3cular ¡wiring ¡scheme ¡– ¡ does ¡not ¡guarantee ¡op3mal ¡wiring ¡but ¡only ¡arrives ¡at ¡ a ¡solu/on ¡that ¡is ¡func/onally ¡acceptable. ¡ ¡

Conclusions ¡

• 4 ¡organisa3onal ¡principles ¡of ¡neuromuscular ¡

circuits ¡ ¡

• 1. Evidence ¡for ¡the ¡size ¡principle ¡
• 2. Correla3ons ¡between ¡axonal ¡caliber, ¡arbor ¡

length ¡and ¡motor ¡unit ¡size ¡

• 3. Unique ¡Axonal ¡Branching ¡Structure ¡– ¡even ¡

between ¡L ¡and ¡R ¡muscles ¡from ¡same ¡animal ¡

• 4. Subop3mal ¡Wiring ¡Length ¡

Synap3c ¡Compe33on ¡

This ¡strategy ¡allows ¡a ¡ different ¡instan3a3on ¡to ¡ arise ¡in ¡each ¡case ¡and ¡ explains ¡the ¡intra-­‑ ¡and ¡ inter-­‑animal ¡differences ¡ found ¡in ¡this ¡study ¡

Difficul3es ¡

• Tightly ¡fasciculate ¡branches ¡

– manual ¡interven3on-­‑ ¡reduced ¡the ¡speed ¡of ¡ reconstruc3on ¡ – These ¡technical ¡difficul3es ¡would ¡be ¡even ¡greater ¡if ¡ the ¡same ¡imaging ¡techniques ¡were ¡to ¡be ¡used ¡for ¡the ¡ CNS ¡as ¡the ¡length ¡scale ¡of ¡neural ¡structures ¡is ¡much ¡ smaller ¡and ¡the ¡packing ¡of ¡neurophil ¡is ¡much ¡denser ¡ – Future ¡innerva3ons ¡required ¡to ¡facilitate ¡this ¡fully ¡ automated ¡reconstruc3on, ¡e.g ¡

• Different ¡colours ¡– ¡spectrally ¡separate ¡different ¡neurons ¡
• Super-­‑resolu3on ¡imaging ¡techniques ¡

Strengths ¡and ¡Weaknesses ¡

• ­‑

Only ¡used ¡interscutularis ¡muscle ¡– ¡has ¡certain ¡ features ¡that ¡aren’t ¡present ¡in ¡the ¡rest ¡of ¡the ¡NS ¡ and ¡therefore ¡findings ¡cannot ¡be ¡generalised ¡to ¡the ¡ whole ¡of ¡ ¡the ¡mammalian ¡connectome. ¡ ¡

• ­‑

Very ¡small ¡sample ¡size ¡–only ¡used ¡4 ¡mice ¡ + ¡ ¡ ¡ ¡Tested ¡reconstruc3on ¡accuracy ¡ + ¡ ¡ ¡ ¡Connectome ¡very ¡well ¡characterised ¡ + ¡ ¡ ¡ ¡Overall ¡well ¡wriZen ¡paper ¡

Clinical ¡Relevance ¡

• NIH ¡(na3onal ¡ins3tute ¡of ¡health) ¡Human ¡Connectome ¡

Project ¡

– Researchers ¡hope ¡to ¡understand ¡the ¡normal ¡variability ¡of ¡ human ¡connectomes ¡and ¡how ¡they ¡change ¡and ¡rewrite ¡ themselves ¡as ¡humans ¡learn, ¡mature, ¡and ¡age. ¡ ¡ – will ¡set ¡the ¡stage ¡for ¡future ¡studies ¡of ¡how ¡connectomes ¡ become ¡dysfunc3onal ¡in ¡many ¡neurological ¡and ¡ psychiatric ¡disorders. ¡ – Likely ¡to ¡be ¡very ¡3me ¡consuming. ¡Mapping ¡the ¡C.elegans ¡ connectome ¡took ¡over ¡a ¡decade ¡and ¡that ¡only ¡consists ¡of ¡ 300 ¡neurons ¡joined ¡by ¡7000 ¡connec3ons ¡– ¡the ¡human ¡ brain ¡consists ¡of ¡86 ¡billion ¡neurons ¡and ¡100 ¡trillion ¡ synapses ¡ ¡ ¡

The ¡Human ¡Connectome ¡Project ¡

White ¡MaZer ¡fibres ¡– ¡parietal ¡areas ¡ White ¡maZer ¡fibres ¡– ¡cor3cospinal ¡ tract ¡and ¡temporal ¡lobe ¡ White ¡maZer ¡fibres-­‑arcuate ¡ fasciculus ¡and ¡pons ¡leh ¡

Is ¡it ¡really ¡worth ¡it? ¡

• Some ¡scien3sts ¡believe ¡that ¡the ¡C.elegans ¡connectome ¡has ¡not ¡

provided ¡many ¡useful ¡insights ¡into ¡the ¡worms ¡behaviour ¡

• They ¡argue ¡that ¡mapping ¡the ¡human ¡connectome ¡would ¡be ¡far ¡too ¡

3me ¡consuming ¡and ¡we ¡wouldn’t ¡know ¡how ¡to ¡interpret ¡it ¡

• "When ¡you ¡move ¡onto ¡behaviours ¡that ¡are ¡more ¡complex ¡than ¡a ¡

quick ¡reflex, ¡you're ¡dealing ¡with ¡especially ¡complicated ¡pathways ¡ that ¡are ¡not ¡immediately ¡interpretable ¡because ¡they ¡are ¡not ¡simple ¡ circuits—they ¡are ¡networks," ¡ ¡

– ScoZ ¡Emmons, ¡Albert ¡Einstein ¡College ¡of ¡Medicine ¡

• However, ¡without ¡such ¡maps ¡scien3sts ¡cannot ¡thoroughly ¡

understand ¡how ¡the ¡brain ¡processes ¡informa3on ¡at ¡the ¡level ¡of ¡the ¡

• circuit. ¡

Big ¡Burning ¡Ques3on ¡

How ¡does ¡synap,c ¡compe,,on ¡lead ¡to ¡the ¡wiring ¡ diagram ¡and ¡differences ¡in ¡the ¡diagram ¡within ¡and ¡ between ¡animals? ¡What ¡is ¡the ¡poten,al ¡medical ¡ significance ¡of ¡this? ¡ ¡

• Synap3c ¡compe33on ¡leads ¡to ¡differences ¡in ¡the ¡

wiring ¡diagram ¡as ¡it ¡is ¡ac3vity ¡dependent ¡

• Mapping ¡the ¡human ¡connectome ¡– ¡may ¡lead ¡to ¡

further ¡understanding ¡of ¡how ¡connectomes ¡ become ¡dysfunc3onal ¡and ¡therefore ¡uncover ¡the ¡ exact ¡mechanisms/lead ¡to ¡new ¡treatments ¡for ¡ neurological ¡and ¡psychiatric ¡disorders ¡ ¡ ¡ ¡

Identity, ¡Developmental ¡restriction ¡ and ¡reactivity ¡of ¡extralaminar ¡cells ¡ capping ¡mammalian ¡ neuromuscular ¡junctions. ¡ ¡

KRANOCYTES ¡

Felipe ¡A. ¡Court, ¡Thomas ¡H. ¡Gillingwater, ¡Shona ¡Melrose, ¡Diane ¡L. ¡Sherman, ¡Kay ¡N. ¡Greenshields, ¡A. ¡Jennifer ¡Morton, ¡John ¡B. ¡ Harris, ¡Hugh ¡J. ¡Willison ¡and ¡Richard ¡R. ¡Ribchester. ¡(PDF) ¡

4 ¡Types ¡of ¡cell ¡involved ¡in ¡NMJ ¡ ¡ Skeletal ¡Muscle ¡Fibres ¡ ¡ Motor ¡Neuron ¡terminals ¡ ¡ Perisynaptic ¡Terminal ¡ Schwann ¡cells ¡ ¡ ‘KRANOCYTES’ ¡– ¡NMJ ¡ capping ¡cells. ¡ ¡

¡

Introduction ¡

NMJ: ¡Synapse ¡of ¡axon ¡terminal ¡of ¡motor ¡neuron ¡and ¡motor ¡endplate ¡of ¡the ¡muscle. ¡ Signals ¡are ¡transmitted ¡across ¡the ¡synapse ¡to ¡cause ¡contraction ¡of ¡the ¡muscle. ¡ ¡

To ¡propose ¡a ¡fourth ¡cell ¡type: ¡The ¡NMJ ¡capping ¡cell ¡– ¡ ‘Kranocyte’. ¡ ¡ Determine ¡function ¡of ¡Kranocytes ¡and ¡mechanism ¡of ¡

• action. ¡ ¡ ¡

Understanding ¡organisation ¡of ¡cells ¡in ¡NMJ ¡may ¡have ¡ implications ¡for ¡cellular ¡and ¡molecular ¡targets ¡for ¡ neuromuscular ¡diseases ¡(ALS ¡/ ¡SMA ¡) ¡ ¡ ¡ ¡

• ­‑ Distinct ¡cell ¡type ¡ ¡and ¡Integral ¡cellular ¡component ¡… ¡

Aims ¡of ¡study ¡

Diagram ¡should ¡look ¡more ¡like… ¡

2166 ¡antibody ¡produced ¡from ¡peptide ¡corresponding ¡to ¡ Tspan-­‑2 ¡protein. ¡ ¡Western ¡blotting ¡was ¡used ¡identify ¡the ¡ associated ¡antigen ¡– ¡47kDa. ¡ ¡Similar ¡molecular ¡weight ¡to ¡ tubulin ¡however ¡antibody ¡did ¡not ¡recognise ¡tubulin ¡on ¡ western ¡blots. ¡Remains ¡unidentified. ¡ ¡ Stained ¡cytoskeleton. ¡ ¡A ¡new ¡subpopulation ¡of ¡cells. ¡ ¡Transgenic ¡mice ¡used ¡in ¡exp. ¡: ¡ ¡

C57B1/6 ¡ S100-­‑eGFP ¡transgenic ¡ ¡ R6/2 ¡transgenic ¡ Tenascin-­‑C-­‑null ¡mutant. ¡ ¡

Methods ¡ ¡

A-­‑ ¡Staining ¡with ¡2166 ¡antibody ¡shows ¡NMJ ¡capping ¡cells ¡at ¡NMJs ¡ B-­‑ ¡Capping ¡cells ¡– ¡green. ¡ ¡Motor ¡endplate-­‑ ¡Red ¡(TRITC-­‑α-­‑BTX) ¡ C ¡– ¡capping ¡cells-­‑ ¡green. ¡Motor ¡endplate ¡– ¡blue. ¡Axon ¡– ¡Red ¡ ¡ F ¡– ¡Each ¡NMJ ¡has ¡at ¡least ¡1 ¡capping ¡cell. ¡No ¡more ¡than ¡3. ¡ ¡

Located ¡3 ¡µm ¡away ¡from ¡ muscle ¡fibre ¡surface, ¡ OUTSIDE ¡BASAL ¡LAMINA. ¡ ¡

Laminin ¡= ¡red. ¡ Alexa ¡Fluor ¡647-­‑α-­‑BTX ¡(binds ¡nAChR ¡of ¡post ¡ synaptic ¡membrane) ¡ ¡= ¡blue ¡ ¡ ¡ ¡

Supplementary ¡Figure ¡S2 ¡ ¡

Arrow ¡shows ¡junctional ¡folds ¡in ¡basal ¡lamina ¡– ¡kranocytes ¡sit ¡outside ¡this. ¡ ¡ ¡

Distinct ¡cell ¡type ¡ ¡

• Double ¡immunostaining ¡with ¡2166 ¡and ¡

GFAP ¡or ¡Nestin ¡antibodies ¡showed ¡no ¡ colocalisation ¡ ¡

• NOT ¡TERMINAL ¡SCHWANN ¡CELLS ¡ ¡
• S100-­‑eGFP ¡mice-­‑ ¡ ¡myelinating ¡and ¡terminal ¡

schwann ¡cells ¡endogenously ¡flourescent. ¡ ¡ ¡ Different ¡patterns ¡of ¡flourescence. ¡2166 ¡ cells ¡extend ¡boundaries ¡of ¡schwann ¡cell ¡

• membrane. ¡ ¡
• 2166 ¡cells ¡M-­‑cadherin, ¡N-­‑CAM ¡or ¡desmin ¡
• negative. ¡ ¡Not ¡muscle ¡satellite ¡cells. ¡
• F4/80 ¡negative ¡– ¡not ¡macrophage ¡ ¡
• Perisynaptic ¡fibroblast? ¡

Robertson, ¡J.D. ¡(1956) ¡– ¡Endoneurial ¡cells. ¡“Near ¡ myoneural ¡junctions ¡the ¡endoneurial ¡sheath ¡consists ¡

• f ¡a ¡thin ¡sheet ¡of ¡cells ¡with ¡scattered ¡collagen ¡fibrils ¡

around ¡it ¡forming ¡a ¡complete ¡tube, ¡enveloping ¡small ¡ nerve ¡fibres.” ¡(PDF) ¡ Weiss ¡et ¡al. ¡(1991) ¡– ¡Perisynaptic ¡fibroblasts. ¡“After ¡ skeletal ¡muscle ¡is ¡denervated, ¡fibroblasts ¡near ¡ neuromuscular ¡junctions ¡proliferate ¡more ¡than ¡ fibroblasts ¡distant ¡from ¡synaptic ¡sites, ¡and ¡they ¡ accumulate ¡adhesive ¡molecules ¡such ¡as ¡tenascin.This ¡ response ¡could ¡reflect ¡signals ¡that ¡arise ¡ perisynaptically ¡after ¡denervation, ¡preexisting ¡ differences ¡between ¡perisynaptic ¡and ¡extrasynaptic ¡ fibroblasts, ¡or ¡both.” ¡(PDF) ¡ ¡ Not ¡fibroblasts ¡– ¡2166 ¡+ve ¡cells ¡do ¡not ¡correspond ¡to ¡ Thy-­‑1-­‑positive ¡perisynaptic ¡fibroblasts. ¡ ¡

Perisynaptic ¡fibroblasts ¡ ¡

Robertson ¡(1956) ¡ ¡

Figure ¡4 ¡from ¡Weiss ¡(1991). ¡

2166 ¡– ¡Cytoskeleton ¡ ¡ HM-­‑24 ¡– ¡Strong ¡resemblence ¡to ¡neuregulin ¡staining ¡attributed ¡to ¡terminal ¡schwann ¡cells ¡ (Trinidad ¡et ¡al. ¡2000). ¡Not ¡seen ¡in ¡S100-­‑eGFP ¡schwann ¡cells. ¡ ¡ HM-­‑24= ¡2166? ¡** ¡ rPH ¡– ¡No ¡overlap ¡in ¡staining ¡but ¡strong ¡association. ¡ ¡Stains ¡different ¡cytoskeletal ¡ component…Endoplasmic ¡Reticulum? ¡ ¡ CD34 ¡– ¡ ¡Cell ¡surface ¡marker, ¡therefore ¡stains ¡plasma ¡membrane. ¡Haematopoietic ¡stem ¡cell ¡

• marker. ¡Pluripotency ¡capacity? ¡Regeneration? ¡ ¡

Cholera ¡toxin ¡B ¡(CTB) ¡– ¡Plasma ¡membranes ¡of ¡NMJ ¡capping ¡cells ¡(absent ¡from ¡Schwann ¡ cells). ¡ ¡As ¡it ¡is ¡selective ¡to ¡kranocytes ¡could ¡be ¡important ¡in ¡the ¡discovery ¡of ¡a ¡more ¡ selective ¡way ¡to ¡ablate ¡kranocytes ¡for ¡the ¡formation ¡of ¡a ¡knockout ¡mouse ¡– ¡long ¡term ¡

effects ¡could ¡be ¡studied. ¡ ¡

Immunostaining ¡to ¡reveal ¡distinct ¡cellular ¡ profile ¡

• Fig. ¡2B ¡

2166 ¡+ve ¡cells ¡normally ¡restricted ¡to ¡NMJs. ¡ ¡ Proliferate ¡through ¡perijunctional ¡region ¡ ahead ¡of ¡Schwann ¡cell ¡sprouting. ¡ ¡ Between ¡day ¡5-­‑10, ¡2166 ¡+ve ¡cells ¡(NMJ ¡ capping ¡cells) ¡start ¡to ¡become ¡restricted ¡to ¡

• endplates. ¡ ¡ ¡

By ¡day ¡28 ¡– ¡cells ¡highly ¡restricted. ¡ ¡ ¡

Post ¡natal ¡restriction ¡

Terminal ¡Schwann ¡cells ¡– ¡path ¡finding ¡ role ¡in ¡compensatory ¡sprouting ¡ following ¡nerve ¡injury ¡ 2166+ve ¡cells ¡also ¡spread ¡following ¡ denervation, ¡paralysis ¡or ¡atrophy. ¡ Partially ¡denervated ¡muscle ¡(TS) ¡ ¡ stained ¡with ¡nestin ¡(marker ¡for ¡reactive ¡ terminal ¡schwann ¡cells) ¡1-­‑6 ¡days. ¡3 ¡days ¡ to ¡proliferate. ¡ ¡ 2166 ¡+ve ¡cells ¡show ¡excessive ¡ spreading ¡within ¡24 ¡hours ¡(D-­‑F) ¡ ¡ Association ¡between ¡schwann ¡cells ¡and ¡ 2166 ¡+ve ¡cells ¡at ¡3 ¡days. ¡ ¡Instructive ¡ signal? ¡ ¡

Process ¡of ¡regeneration ¡following ¡ denervation ¡or ¡paralysis. ¡

• Fig. ¡5D-­‑F ¡

Passive ¡role. ¡

Do ¡kranocytes ¡play ¡and ¡instructive ¡or ¡a ¡passive ¡ role ¡in ¡the ¡activation ¡of ¡terminal ¡Schwann ¡cells ¡ and ¡their ¡consequent ¡sprouting? ¡ ¡

• Fig. ¡5G ¡ ¡

Bromodeoxyuridine ¡incorporation ¡indicates ¡the ¡activation, ¡ proliferation ¡and ¡spread ¡of ¡capping ¡cells ¡following ¡denervation. ¡ ¡ BrdU ¡injected ¡into ¡denervated ¡TS ¡muscles ¡of ¡mice ¡– ¡7% ¡showed ¡ incorporation, ¡However ¡>65% ¡were ¡within ¡40µm ¡of ¡NMJ. ¡ ¡

¡ Botulinum ¡toxin ¡type ¡A ¡injected ¡inbetween ¡ intercostal ¡muscles ¡and ¡TS ¡muscle ¡to ¡create ¡ neuromuscular ¡block. ¡ ¡ ¡ A ¡– ¡1 ¡day ¡after ¡paralysis ¡2166+ve ¡cells ¡proliferate ¡ ¡ B ¡– ¡not ¡till ¡6 ¡days ¡after ¡paralysis ¡do ¡schwann ¡cells ¡

• proliferate. ¡ ¡Therefore ¡not ¡trigger ¡– ¡possible ¡

chemical ¡signal ¡to ¡help ¡facilitate ¡reaction. ¡ ¡

Fig ¡8B ¡– ¡ ¡ ¡ 1) ¡Kranocyte ¡sprouting ¡to ¡ reinforce ¡bridges ¡ 2) ¡Schwann ¡cell ¡sprouting ¡ utilises ¡these ¡bridges ¡ ¡ 3) ¡Axonal ¡sprouting ¡and ¡

• regeneration. ¡ ¡

Although ¡NOT ¡A ¡TRIGGER, ¡may ¡lay ¡down ¡a ¡substrate ¡to ¡promote ¡Schwann ¡cell ¡ spread ¡and ¡proliferation ¡– ¡Possibly ¡by ¡secreting ¡molecules ¡that ¡contribute ¡to ¡ the ¡extracellular ¡matrix ¡and ¡provide ¡a ¡pathway ¡. ¡

Capping ¡cells ¡in ¡TS ¡muscles ¡of ¡R6/2 ¡mice ¡studied ¡ (profound ¡muscle ¡atrophy) ¡therefore ¡any ¡difference ¡ due ¡to ¡myogenic/ ¡non ¡neural ¡explanation. ¡(No ¡ abnormality ¡with ¡Schwann ¡cells ¡or ¡nerve ¡terminals). ¡ ¡ PARALYSIS ¡NOT ¡NECESSARY ¡– ¡distribution ¡of ¡2166 ¡ positive ¡cells ¡indistinguishable ¡to ¡that ¡following ¡ paralysis ¡or ¡denervation. ¡ ¡

Is ¡inactivity ¡through ¡paralysis ¡or ¡ denervation ¡necessary ¡for ¡reaction? ¡ ¡

Fig ¡6 ¡(C,D) ¡– ¡atrophy ¡is ¡sufficient ¡for ¡ proliferation ¡and ¡spread. ¡

Tenascin-­‑ ¡C ¡– ¡

early ¡molecular ¡ marker ¡in ¡axonal ¡ sprouting ¡and ¡

• regeneration. ¡

Association ¡with ¡ spread ¡of ¡2166 ¡+ve ¡ cells ¡(A-­‑C) ¡but ¡ tenascin-­‑ ¡C ¡null ¡ mutant ¡mouse ¡ shows ¡not ¡ necessary ¡for ¡ accumulation ¡of ¡ cells ¡to ¡NMJs ¡ during ¡ development ¡(F,G). ¡ ¡

Molecules ¡involved ¡ ¡

• ­‑ 4th ¡Cellular ¡component ¡of ¡the ¡neuromuscular ¡junction. ¡ ¡

¡

• ­‑ Distinct ¡cell ¡type ¡– ¡lying ¡outside ¡basal ¡lamina. ¡ ¡

¡

• ­‑ Compensatory ¡response ¡to ¡denervation, ¡paralysis ¡and ¡atrophy. ¡

Involved ¡in ¡neuromuscular ¡synaptic ¡development, ¡maintenance ¡ and ¡regeneration ¡of ¡damaged ¡axons ¡via ¡sprouting. ¡ ¡ ¡

• ­‑ Proliferation ¡occurs ¡before ¡Schwann ¡cell ¡proliferation ¡and ¡spread ¡

and ¡axonal ¡sprouting, ¡therefore ¡may ¡lay ¡down ¡a ¡substrate ¡to ¡ facilitate ¡axonal ¡sprouting ¡but ¡does ¡not ¡act ¡as ¡a ¡trigger. ¡ ¡ ¡

• ­‑ Cellular ¡and ¡Molecular ¡target ¡for ¡effective ¡treatment ¡of ¡

neuromuscular ¡diseases ¡ ¡

Conclusions ¡

• Fig. ¡4. ¡

Video ¡rendering ¡of ¡NMJ ¡capping ¡cell ¡ ¡

Strengths ¡/ ¡Weaknesses ¡of ¡paper ¡

Strengths ¡ ¡ Weaknesses ¡ ¡

¡ Identified ¡new ¡cellular ¡component. ¡ ¡Allows ¡ researchers ¡to ¡focus ¡more ¡attention ¡onto ¡ this ¡molecule ¡to ¡find ¡the ¡missing ¡

• information. ¡ ¡

¡ Therapeutic ¡target ¡– ¡help ¡with ¡early ¡axonal ¡ injury, ¡synaptic ¡toxicity ¡and ¡other ¡ neurodegenerative ¡diseases ¡– ¡ALS/ ¡SMA ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ Lots ¡more ¡questions ¡to ¡be ¡answered. ¡ Understanding ¡incomplete. ¡ ¡

• Mechanism ¡and ¡function ¡of ¡restriction ¡

to ¡motor ¡endplates ¡ ¡

• Significance ¡of ¡proliferation ¡and ¡spread ¡ ¡

¡ Identity ¡of ¡2166 ¡antigen ¡still ¡unknown. ¡More ¡ stringent ¡fractionation ¡or ¡proteomic ¡analysis ¡

• necessary. ¡ ¡

¡ Not ¡possible ¡to ¡double-­‑stain ¡NMJ ¡capping ¡ cells ¡with ¡2166 ¡and ¡HM-­‑24 ¡because ¡both ¡ raised ¡in ¡rabbits. ¡Same ¡component? ¡ ¡ ¡ Not ¡the ¡perfect ¡treatment ¡in ¡all ¡cases ¡-­‑ ¡ Disturbances ¡in ¡other ¡parts ¡of ¡neuron ¡can ¡ have ¡immediate ¡effects ¡on ¡otherwise ¡ healthy ¡nerve ¡terminals. ¡ ¡ Small ¡volume ¡of ¡tissue ¡they ¡comprise ¡makes ¡ analysis ¡difficult ¡ ¡ ¡ Studied ¡in ¡mice ¡– ¡can ¡this ¡research ¡definitely ¡ be ¡translated ¡into ¡human ¡models? ¡ ¡ ¡ ¡

CTB ¡– ¡Can ¡presently ¡only ¡knock ¡out ¡motor ¡nerve ¡terminals, ¡ schwann ¡cells ¡and ¡kranocytes. ¡ ¡Selective ¡ablation ¡of ¡kranocytes ¡ would ¡be ¡advantegeous ¡to ¡study ¡long ¡term ¡effects ¡of ¡this. ¡ ¡ Further ¡research ¡into ¡pluripotential ¡capacity ¡of ¡neuromuscular ¡ kranocytes ¡– ¡regeneration?. ¡ ¡ Kranocyte ¡fate ¡in ¡various ¡models ¡of ¡disease ¡– ¡ALS ¡ ¡ Harness ¡cell ¡secretions ¡– ¡neuroprotective ¡factors ¡to ¡prevent ¡ neuromuscular ¡disease ¡ ¡ New ¡techniques ¡– ¡brainbow? ¡ ¡ Addition ¡of ¡supportive ¡cells ¡such ¡as ¡schwann ¡cells ¡and ¡ kranocytes ¡to ¡co-­‑cultures ¡may ¡enhance ¡synaptogenesis ¡and ¡ maintain ¡any ¡putative ¡synapses ¡that ¡form. ¡ ¡

Further ¡Research… ¡

Early ¡Vulnerability ¡to ¡Ischemia/ Repurfusion ¡Injury ¡in ¡Motor ¡ Terminals ¡Innterva3ng ¡Fast ¡Muscles ¡

• f ¡SOD1-­‑G93A ¡Mice. ¡ ¡

David ¡G, ¡Nguyen ¡K, ¡Barret ¡EF ¡

Are ¡there ¡early ¡events ¡at ¡the ¡NMJ ¡ that ¡precede ¡motor ¡neuron ¡death ¡in ¡ ALS? ¡

Amytrophic ¡Lateral ¡Sclerosis ¡

• Most ¡common ¡form ¡of ¡Motor ¡

Neurone ¡disease. ¡It ¡affects ¡men ¡ more ¡than ¡women. ¡ ¡

• Cells ¡that ¡innervate ¡muscle ¡cells ¡

directly ¡die ¡first, ¡followed ¡by ¡higher ¡

• rder ¡motor ¡neurons. ¡
• It ¡affects ¡the ¡neurons ¡which ¡

innervate ¡skeletal ¡or ¡‘voluntary’ ¡

• muscle. ¡This ¡can ¡be ¡divided ¡into ¡2 ¡
• types. ¡ ¡
• Most ¡commonly ¡is ¡sporadic ¡with ¡no ¡

known ¡cause. ¡Genes ¡have ¡been ¡ iden3fied ¡in ¡familial ¡ALS, ¡but ¡ mechanism ¡is ¡unknown. ¡

Early ¡vulnerability ¡to ¡ischaemia/reperfusion ¡ injury ¡in ¡motor ¡terminals ¡innerva3ng ¡fast ¡ muscles ¡of ¡SOD1-­‑G93A ¡mice. ¡

• In ¡vivo. ¡
• Common ¡animal ¡model ¡of ¡fALS ¡
• Focus ¡on ¡the ¡NMJ. ¡
• Differen3al ¡suscep3bility ¡amongst ¡muscle ¡types? ¡
• Oxida3ve ¡stress ¡to ¡induce ¡damage. ¡ ¡

What ¡do ¡we ¡want ¡to ¡know? ¡

• Are ¡motor ¡terminals ¡in ¡the ¡mouse ¡model ¡

more ¡vulnerable ¡to ¡I/R ¡injury ¡than ¡in ¡wild ¡ type? ¡

• When ¡does ¡this ¡first ¡become ¡evident? ¡
• Are ¡motor ¡terminals ¡that ¡innervate ¡different ¡

muscle ¡types ¡differen3ally ¡sensi3ve ¡to ¡this ¡ injury? ¡

• Could ¡there ¡be ¡early ¡events ¡at ¡the ¡NMJ ¡that ¡

quicken ¡or ¡trigger ¡disease ¡progression? ¡

Experimental ¡Design ¡

• Transgenic ¡mouse ¡model ¡

was ¡used. ¡

• SOD1 ¡has ¡been ¡implicated ¡

in ¡fALS. ¡

• Wildtype ¡mice ¡and ¡

contralateral ¡unstressed ¡ muscles ¡were ¡used ¡as ¡

• controls. ¡
• I/R ¡injury ¡imposes ¡an ¡
• xida3ve ¡stress. ¡
• Flurorescent ¡labels ¡helped ¡

to ¡iden3fy ¡axons ¡and ¡

• endplates. ¡

Are ¡we ¡really ¡examining ¡the ¡results ¡

• f ¡oxida3ve ¡stress? ¡

¡

What ¡could ¡it ¡possibly ¡teach ¡us? ¡

• It ¡could ¡show ¡us ¡what ¡happens ¡before ¡motor ¡

nerve ¡degenera3on ¡

• It ¡could ¡give ¡us ¡possible ¡medical ¡interven3ons ¡
• r ¡diagnos3c ¡tools ¡
• It ¡could ¡give ¡us ¡insight ¡into ¡the ¡mechanism ¡of ¡

familial ¡ALS ¡which ¡is ¡unknown ¡

• Could ¡clear ¡up ¡the ¡ques3on ¡of ¡whether ¡the ¡

result ¡of ¡the ¡SOD1 ¡muta3on ¡is ¡loss ¡of ¡func3on ¡

• r ¡gain ¡of ¡func3on ¡

What ¡did ¡they ¡find? ¡

Increased ¡sensi/vity ¡to ¡I/R ¡injury ¡was ¡present ¡at ¡an ¡early ¡age ¡ ¡ in ¡fast ¡muscles ¡of ¡SOD1-­‑G93A ¡ ¡mice. ¡ ¡

¡

Motor ¡terminals ¡innerva/ng ¡fast ¡muscle ¡were ¡more ¡vulnerable ¡to ¡ I/R ¡injury ¡than ¡those ¡innerva/ng ¡slow ¡muscle ¡ ¡

¡

Plantaris ¡Muscle ¡

• Magitude ¡of ¡I/R ¡induced ¡injury ¡was ¡similar ¡to ¡

EDL ¡and ¡more ¡than ¡soleus. ¡

• Possibly ¡a ¡general ¡property ¡of ¡fast ¡hindlimb ¡

muscles ¡

• Only ¡2 ¡mice ¡were ¡studied. ¡

Their ¡conclusions ¡

• 1. Varying ¡vulnerability ¡of ¡motor ¡terminals ¡was ¡associated ¡

with ¡the ¡animal ¡model ¡of ¡the ¡disease. ¡

• 2. The ¡increased ¡sensi3vity ¡was ¡present ¡before ¡neuron ¡

degenera3on ¡

• 3. The ¡early ¡vulnerability ¡shown ¡by ¡fast ¡muscle ¡motor ¡

terminals ¡may ¡contribute ¡to ¡early ¡events ¡in ¡motor ¡neuron ¡

• death. ¡
• 4. Fast ¡muscle ¡motor ¡neuron ¡terminals ¡degenerate ¡before ¡

motor ¡terminals ¡that ¡innervate ¡slow ¡ac3ng ¡muscle. ¡

• 5. Fast ¡fa3guable ¡motor ¡neurons ¡might ¡be ¡more ¡vulnerable ¡

as ¡they ¡innervate ¡more ¡muscle ¡types. ¡

• 6. High ¡levels ¡of ¡anaerobic ¡exercise ¡(shown ¡by ¡the ¡I/R ¡stress) ¡

might ¡contribute ¡to ¡rapid ¡disease ¡progression. ¡ ¡

Strengths? ¡Weaknesses? ¡

• Focused ¡on ¡hindlimb. ¡
• SOD1-­‑G93A ¡model ¡
• 2 ¡mice ¡for ¡plantaris ¡muscle ¡study ¡
• Enough ¡of ¡a ¡focus ¡on ¡metabolism? ¡
• Clear. ¡Well ¡presented. ¡
• What ¡does ¡this ¡mean ¡for ¡disease ¡sufferers? ¡ ¡

Further ¡research? ¡What ¡do ¡we ¡know ¡ now? ¡

• ‘We ¡propose ¡that ¡the ¡primary ¡pathogenic ¡event, ¡

determining ¡the ¡survival ¡of ¡the ¡animal, ¡is ¡not ¡ motor ¡neuron ¡death ¡itself, ¡but ¡rather ¡the ¡loss ¡of ¡ motor ¡neuron/muscle ¡contacts’ ¡

• What ¡happens ¡if ¡we ¡protect ¡motor ¡terminals? ¡ ¡
• Local ¡effects? ¡
• NMJ ¡is ¡lost ¡before ¡the ¡motor ¡neuron. ¡
• Role ¡of ¡the ¡synapse? ¡
• Role ¡of ¡lipid ¡metabolism? ¡

¡ ¡

Model ¡of ¡fALS ¡disease ¡progression ¡

‘Morphological ¡Characteris2cs ¡of ¡ Motor ¡Neurones ¡Do ¡Not ¡ Determine ¡Their ¡Rela2ve ¡ Suscep2bility ¡to ¡Degenera2on ¡in ¡ a ¡Mouse ¡Model ¡of ¡Severe ¡Spinal ¡ Muscular ¡Atrophy ¡(SMA)’ ¡

Spinal ¡Muscular ¡Atrophy ¡(SMA) ¡ ¡

• Most ¡common ¡childhood ¡form ¡of ¡Motor ¡

Neuron ¡Disease, ¡incidence ¡of ¡1:6000-­‑1:10000 ¡ live ¡births. ¡

• Leads ¡to ¡muscle ¡atrophy, ¡paralysis ¡and ¡

premature ¡death. ¡

• Caused ¡by ¡gene3c ¡defect ¡in ¡SMN1 ¡gene ¡that ¡

codes ¡Survival ¡Motor ¡Neurone ¡Protein. ¡

Background ¡

• SMA ¡is ¡related ¡to ¡ALS ¡
• Evidence ¡SMA ¡and ¡ALS ¡share ¡biochemical ¡

pathways ¡

• In ¡ALS ¡suggested ¡that ¡morphological ¡neuronal ¡

proper3es ¡influenced ¡suscep3bility ¡to ¡ degenera3on ¡

• Aim-­‑ ¡‘determine ¡whether ¡intrinsic ¡morphological ¡

characteris3cs ¡of ¡motor ¡neurones ¡influenced ¡ their ¡rela3ve ¡vulnerability ¡to ¡SMA’ ¡ ¡

Structure ¡of ¡Study ¡

Experiments ¡

• 1. Muscle ¡loca3on/nerve ¡stump ¡length/fibre ¡type ¡
• 2. Intrinsic ¡morphological ¡characteris3cs ¡(motor ¡unit ¡

size, ¡arbor ¡length, ¡size/form ¡of ¡NMJ, ¡branching ¡ paZern) ¡

• 3. ¡Synap3c ¡Plas3city ¡
• 4. ¡Schwann ¡Cells ¡

¡ Outcome-­‑ ¡’Morphological ¡characteris3cs ¡of ¡motor ¡

neurones ¡are ¡not ¡a ¡major ¡determinant ¡of ¡disease-­‑ suscep3bility ¡in ¡SMA, ¡in ¡contrast ¡ALS’ ¡

¡ ¡

Methods ¡

Mice ¡

• Neonatal ¡Mice ¡Smn-­‑/-­‑;SM2 ¡and ¡22 ¡

week ¡old ¡healthy ¡Thy.1-­‑YFP-­‑H ¡mice. ¡ ¡ Muscles ¡

• 10 ¡dis3nct ¡anatomical ¡muscles, ¡

from ¡cranial, ¡torso ¡and ¡hindlimb ¡

• regions. ¡ ¡
• Characterised ¡as ¡vulnerable ¡or ¡

disease ¡resistant ¡by ¡occupancy ¡ counts ¡

Methods ¡

Part ¡1. ¡Smn-­‑/-­‑;SMN2 ¡severe ¡ mouse ¡model. ¡An3bodies ¡raised ¡ against ¡neurofilaments. ¡ ¡ Part ¡2. ¡Healthy ¡Adult ¡Thy.1-­‑YFP-­‑H ¡

• mice. ¡Reconstruc3on ¡whole ¡

motor ¡units ¡by ¡montaging ¡ fluorescent ¡micrographs ¡in ¡ PhotoShop ¡and ¡analysis ¡using ¡ ImageJ ¡sohware. ¡ ¡ ¡

Methods ¡

¡ Part ¡3. ¡Primary ¡An3bodies ¡against ¡

• neurofilaments. ¡Quan3ta3ve ¡analysis ¡comparing ¡

% ¡of ¡polyinnervated ¡NMJ ¡at ¡P7 ¡and ¡P14. ¡Using ¡ mouse ¡model ¡Smn-­‑/-­‑;SMN2. ¡ ¡ ¡ Part ¡4. ¡Terminal ¡Schwann ¡Cells ¡labelled ¡in ¡wild ¡ type ¡mice ¡using ¡primary ¡an3bodies ¡against ¡S100 ¡

• protein. ¡Qualita3ve ¡and ¡Quan3ta3ve ¡analysis. ¡

¡ ¡

Skeletal ¡Muscle ¡Loca3on ¡

• Posi3on ¡of ¡the ¡

muscle ¡in ¡the ¡body ¡

• Nerve ¡stump ¡length ¡
• Muscle ¡fibre ¡type ¡

Motor ¡Unit ¡Size ¡and ¡Muscle ¡Arbor ¡ Length ¡

NMJ ¡Synapses ¡

Branching ¡PaZern ¡

Synap3c ¡Plas3city ¡ ¡

Schwann ¡Cell ¡Number ¡

Conclusions ¡

• There ¡is ¡no ¡correla3on ¡between ¡the ¡following ¡factors ¡

and ¡suscep3bility ¡to ¡SMA. ¡

• 1. Posi3on ¡of ¡muscle ¡in ¡body, ¡muscle ¡fibre ¡type, ¡nerve ¡stump ¡

length ¡

• 2. Motor ¡Unit ¡size, ¡muscle ¡arbor ¡length, ¡NMJ ¡Synapse, ¡Branching ¡

PaZern ¡

• 3. Synap3c ¡Plas3city ¡
• 4. ¡Schwann ¡cell ¡number ¡
• Morphological ¡characteris3cs ¡of ¡motor ¡neurones ¡

don’t ¡determine ¡their ¡rela3ve ¡suscep3bility ¡to ¡SMA. ¡ ¡

Strengths ¡and ¡Weaknesses ¡

Strengths ¡ Weaknesses ¡

• ­‑Using ¡10 ¡dis3nct ¡muscle ¡groups ¡from ¡

different ¡loca3ons ¡in ¡the ¡mouse. ¡

• ­‑Looking ¡at ¡not ¡only ¡morphological ¡

characteris3cs ¡but ¡also ¡the ¡development ¡ ¡

• ­‑To ¡what ¡extent ¡does ¡the ¡mouse ¡model ¡

replicate ¡the ¡human ¡condi3on? ¡

• ­‑Small ¡Sample ¡size ¡of ¡3 ¡mice ¡
• ­‑Study ¡is ¡based ¡on ¡the ¡assump3on ¡that ¡the ¡

stage ¡of ¡endplate ¡occupancy ¡on ¡day ¡5 ¡ reflects ¡vulnerability ¡of ¡the ¡muscle ¡to ¡SMA ¡

• ­‑Looked ¡at ¡the ¡per ¡cent ¡fully ¡occupied ¡

endplates ¡but ¡didn’t ¡consider ¡about ¡ par3ally ¡occupied ¡or ¡vacant ¡

• ­‑Not ¡all ¡10 ¡muscles ¡groups ¡could ¡be ¡

analysed ¡due ¡to ¡technical ¡issues ¡

• ­‑Healthy ¡young ¡adult ¡miceused, ¡could ¡miss ¡

subtle ¡intrinsic ¡morphologies ¡of ¡motor ¡ neurones ¡specific ¡to ¡SMA ¡mice. ¡ ¡

What ¡cellular/molecular ¡mechanisms ¡ account ¡for ¡the ¡vulnerability ¡of ¡lower ¡ motor ¡neurones ¡in ¡SMA ¡and ¡how ¡does ¡ this ¡differ ¡from ¡ALS? ¡

¡

• Unknown ¡how ¡molecular ¡mechanisms ¡account ¡for ¡

vulnerability ¡in ¡SMA ¡

• SMA ¡and ¡ALS ¡have ¡similar ¡biochemical ¡pathways ¡

involving ¡

• Cellular ¡mechanisms ¡involving ¡SMN, ¡FUS, ¡TDP-­‑43 ¡and ¡

Gems ¡could ¡be ¡involved ¡in ¡ALS ¡and ¡SMA ¡

• Possibly ¡a ¡mul3-­‑system ¡disorder ¡

Recommenda3ons ¡for ¡Further ¡Work ¡

Intrinsic ¡

• Interac3ons ¡and ¡differences ¡at ¡a ¡molecular ¡level ¡
• Motor ¡unit ¡size ¡plays ¡role ¡in ¡ALS, ¡why ¡not ¡SMA? ¡
• The ¡effect ¡of ¡the ¡splicing ¡efficiency ¡of ¡exon ¡7 ¡lower ¡in ¡MN ¡than ¡spinal ¡

cord? ¡ Extrinsic ¡

• Is ¡there ¡deficiencies ¡in ¡central ¡inputs ¡onto ¡motor ¡neurones ¡from ¡spinal ¡

cord? ¡

• Idea ¡of ¡a ¡mul3-­‑system ¡disorder ¡
• Is ¡there ¡selec3ve ¡vulnerability ¡in ¡other ¡cells ¡types ¡or ¡3ssues ¡in ¡SMA? ¡
• Why ¡is ¡it ¡motor ¡neurones ¡that ¡are ¡the ¡most ¡effected ¡cell ¡type? ¡

Future ¡

• ¡Use ¡Stem ¡Cell ¡Technology ¡make ¡motor ¡neurones ¡in ¡a ¡dish ¡to ¡avoid ¡

problems ¡of ¡mouse ¡model ¡

Summary ¡

• Comple3on ¡of ¡an ¡en3re ¡muscle ¡connectome ¡reveals ¡some ¡key ¡
• rganisa3onal ¡principles ¡underpinning ¡development ¡of ¡

neuromuscular ¡circuits ¡– ¡poten3al ¡for ¡an ¡en/re ¡human ¡ connectome ¡

• Basic ¡cellular ¡structure ¡of ¡a ¡NMJ ¡has ¡been ¡updated ¡to ¡include ¡a ¡

4th ¡cell ¡type ¡(kranocyte), ¡poten3ally ¡involved ¡in ¡facilita/on ¡of ¡ neuroregenera/on ¡

• Research ¡into ¡animal ¡models ¡of ¡ALS ¡suggests ¡varying ¡

vulnerability ¡of ¡motor ¡neurons ¡to ¡degenera3on ¡(fast ¡twitch ¡ muscles ¡= ¡more ¡vulnerable). ¡ ¡Raises ¡possibility ¡that ¡disease ¡ mechanism ¡is ¡localised ¡at ¡nerve ¡terminal/NMJ ¡

• In ¡SMA ¡(believed ¡to ¡be ¡related ¡to ¡ALS), ¡morphological ¡

characteris3cs ¡do ¡not ¡appear ¡to ¡affect ¡vulnerability ¡of ¡motor ¡ neurons ¡to ¡disease. ¡ ¡Might ¡suggest ¡that ¡intrinsic ¡molecular ¡ proper/es ¡are ¡involved ¡