RP/RT-PCR Externe-Primer: 1RES: GAA GAA ATG ATG ACA GCA TGT CAG GG (1822-1844) 2RES: TAA TTT ATC TAC TTG TTC ATT TCC TCC AAT (4173-4199) � Produkt: 2383 bp One Step RT-PCR (QIAamp One step RT-PCR kit; Qiagen, Hilden) 50 µl final. Vol. Interne Primer: 3RES: ATG GYT CTT GAT AAA TTT GAT ATG TCC (3559-3582) 4RES: AGA CAG GCT AAT TTT TTA GGG A (2077-2095) oder: p6-2(fw): GGC TGT TGG AAA TGT GGA AAG GA (2023-2045) � Produkt: 1505 bp oder 1559 bp Nested PCR (HotStarTaq kit; Qiagen, Hilden), TaqCycle sequencing Sequenzierungs-Primer: Primer A: GAG CCA ACA GCC CCA CC (2149-2165) Primer B: CAA TGG CCA TTG ACA GAA G (2616-2634) Primer C: GGA TCA CCA GCA ATA TTC CA (3012-3031) Primer D: GGA ACT GTA TCC TTT A G/A C TTC CC (2232-2254) Primer F: TGG GCC ATC CAT TCC TGG CTT (2586-2606) Primer G: CAT CCC TGT GGA AGC ACA TT (2988-3004) Primer H: TCT GCT ATT AAG TCT TTT GAT (2512-2529) p6-2(fw): GGC TGT TGG AAA TGT GGA AAG GA (2023-2045) BigDye TaqCycle sequencing kit v1.1, ABI
Bedingungen Thermocycler One Stepp RT-PCR (QIAamp One step RT-PCR kit; Qiagen, Hilden) 50°C 30 min 95°C 15 min 95°C 30 sec 65°C 45 sec 72°C 3 min 95°C 30 sec 60°C 45 sec 72°C 3 min 95°C 30 sec (45x) 55°C 45 sec 72°C 3 min 72°C 10 min ∞ 4°C Nested PCR (HotStarTaq kit; Qiagen, Hilden) 93°C 12min 95°C 30 sec 65°C 45 sec 72°C 3 min 95°C 30 sec 60°C 45 sec 72°C 3 min 95°C 30 sec (45x) 55°C 45 sec 72°C 3 min 72°C 10 min ∞ 4°C TaqCycle sequencing (BigDye TaqCycle sequencing kit v1.1, ABI) 96°C 10 sec (36x) 50°C 10 sec 60°C 4 min ∞ 4°C
gp41-PCR Externe Primer: 5out41: AGT GGT GCA GAG AGA AAA AAG AGC A (7736-7760) 3out41: GCT GTT GAT CCT TTA GGT ATC TTT C (7998-7974) One Stepp RT-PCR (QIAamp One step RT-PCR kit; Qiagen, Hilden) 50 µl final. Vol. Interne Primer: 5in41: GGA GCA GCA GGA AGC ACT AT (7794-7813) 3in41: AGG ACT CTT GCC TGG AGC TG (7966-7947) Nested PCR (HotStarTaq kit; Qiagen, Hilden), TaqCycle sequencing Bedingungen Thermocycler (hier Biometra T3, Heizdeckel: 100°C; 2°C/s) One Stepp RT-PCR (QIAamp One step RT-PCR kit; Qiagen, Hilden) 50°C 30 min 95°C 15 min 95°C 30 sec (36x) 65°C 45 sec 72°C 2 min ∞ 4°C Nested PCR (HotStarTaq kit; Qiagen, Hilden) 95°C 15 min 95°C 30 sec (36x) 60°C 45 sec 72°C 2 min ∞ 4°C TaqCycle sequencing (BigDye TaqCycle sequencing kit v1.1, ABI) 96°C 20 min 96°C 10 sec (30x) 52°C 10 sec 60°C 3 min ∞ 4°C
Integrase-PCR INT Primer: 5´-INT: ATT GGA GGA AAT GAA CAA GT (4173-4192) 3p31: ATCCTGTCTACYTGCCACACAA (5066-5087) � Produkt 914 bp One Stepp RT-PCR (QIAamp One step RT-PCR kit; Qiagen, Hilden) 50 µl final. Vol. Bedingungen Thermocycler One Stepp RT-PCR (QIAamp One step RT-PCR kit; Qiagen, Hilden) 50°C 30 min 95°C 15 min 95°C 30 sec (2x) 65°C 45 sec (-5°C) 72°C 3 min 95°C 30 sec (45x) 55°C 45 sec 72°C 3 min 72°C 10 min ∞ 4°C TaqCycle sequencing (BigDye TaqCycle sequencing kit v1.1, ABI) 96°C 10 sec (36x) 50°C 10 sec 60°C 4 min ∞ 4°C
V3- PCR Externe Primer: 5957F: TTA GGC ATC TCC TAT GGC AGG AAG AAG 7785R: AGT GCT TCC TGC TGC TCC YAA GAA CCC � Produkt 1,8 kb � One Stepp RT-PCR (QIAamp One step RT-PCR kit; Qiagen, Hilden) 50 µl final. Vol. Interne Primer (gp120): 6558F: TGG GAT CAA AGC CTA AAG CCA TGT G 7785R: AGT GCT TCC TGC TGC TCC YAA GAA CCC � Produkt 1,2 kb Interne Primer (V3): V3-1m(6957F): GTA CAA TGT ACA CAT GGA AT V3-2m(7371R): AAA ATT CCC CTC CAC AAT TA � Produkt 414 bp � Nested PCR (HotStarTaq kit; Qiagen, Hilden), TaqCycle sequencing Sequenzierprimer: 6955FQ cagtacaatgYacacatgg 6955RQ ccatgtgtRcattgtactg Bedingungen Thermocycler One Step RT-PCR (QIAamp One step RT-PCR kit; Qiagen, Hilden) 50°C 30 min 95°C 15 min 95°C 30 sec (4x) 69°C 45 sec (-2.00 dT(°C)) 72°C 3 min 95°C 30 sec (44x) 65°C 45 sec 72°C 3 min 72°C 10 min 4°C ∞
Nested PCR (HotStarTaq kit; Qiagen, Hilden) GP120: 95°C 15 min 95°C 30 sec (4x) 69°C 45 sec (-2.00 dT(°C)) 72°C 3 min 95°C 30 sec (44x) 63°C 45 sec 72°C 3 min 72°C 10 min 4°C ∞ oder: V3: 95°C 15 min 95°C 30 sec (4x) 65°C 45 sec (-3.00 dT(°C)) 72°C 2 min 95°C 30 sec (44x) 50°C 45 sec 72°C 2 min 72°C 10 min 4°C ∞ TaqCycle sequencing (BigDye TaqCycle sequencing kit v1.1, ABI) 96°C 20 min 96°C 10 sec 52°C 10 sec 60°C 3 min Scheife an 2, 29x ∞ 4°C Sequenzierprimer: 6955FQ cagtacaatgYacacatgg 6955RQ ccatgtgtRcattgtactg
Protokoll zur HBV-Resistenztestung Stand Dezember 2002 Primer für PCR und Sequenzierung: Die Primer wurden der Publikation“ Identification and Characterization of Mutations in Hepatitis B Virus Resistant to Lamivudine“ (M.I. Allen et al, Hepatology Vol. 27, No. 6, 1998) entnommen. Die insgesamt drei Primerpaare umgeben jeweils die YMDD-Region der HBV-Polymerase, die “ forward“ Primer des zweiten und des dritten Paares sind identisch: Primer Sequenz Fragmentgröße P1F GGA TGT GTC TGC GGC GTT T Paar 1 463 bp P1R ACC CCA TCT TTT TGT TTT GTT AGG P2/3F AGA CTC GTG GTG GAC TTC TCT Paar 2 542 bp P2R CAA AAG AAA ATT GGT AAC AGC GGT A P2/3F AGA CTC GTG GTG GAC TTC TCT Paar 3 1057 bp P3R ATG AGC TTT GCT CCA GAC C Für die PCR und die Sequenzierungsreaktion werden die gleichen Primer verwendet. Im Zuge des ersten Tests wurde festgestellt, daß mit dem ersten Primerpaar die besten Ergebnisse erzielt werden können , es wird daher auch für die weiteren Tests eingesetzt. Mit dem dritten Primerpaar konnte kein PCR-Produkt nachgewiesen werden (evtl andere Subtypen). Aufreinigung der viralen DNA: Die virale DNA wird aus Serum mittels des QIAamp DNA Blood Mini Kits (aus “ Development and assessment of a novel real-time PCR assay for quantitation of HBV DNA“ , D. Paraskevis et al, Journal of Virological Methods 103, 2002) aus 200 µl Serum gewonnen. Die Aufarbeitung erfolgt nach Angaben des Angaben des Herstellers. PCR- und Sequenzierungsreaktion: Ansatz für eine Reaktion HotStar Taq (QIAGEN): H 2 O Q-Solution 10x Puffer dNTPs Primer Hot-Start DNA [10 µM] 66.5 µl 10 µl 10 µl 2 µl je 0.5 µl 0.5 µl 10 µl Cyclereinstellungen PCR (T3 Biometra Trioblock)
93°C, 12min 95°C, 30 sec 65°C, 45 sec 72°C, 3 min 95°C, 30 sec 60°C, 45 sec 72°C, 3 min 95°C, 30 sec (45x) 55°C, 45 sec 72°C, 3 min 72°C, 10 min 4°C ∞ Ansatz Sequenzreation: H 2 O Primer BigDye v2.0 DNA [3 µM] Terminations Mix (ABI) 1 µl 1 µl 4 µl 10 µl Cyclereinstellungen PCR (T3 Biometra Trioblock) 36x 96°C, 10 sec 50°C, 10 sec 60°C, 4 min 4°C ∞ Die Auftrennung der Extensionsprodukte erfolgt mit der kurzen Kapillare, Injektionszeit 15 sec. bei 13, 5 kV für 40 min.
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