SLIDE 1 RP/RT-PCR Externe-Primer: 1RES: GAA GAA ATG ATG ACA GCA TGT CAG GG (1822-1844) 2RES: TAA TTT ATC TAC TTG TTC ATT TCC TCC AAT (4173-4199) Produkt: 2383 bp One Step RT-PCR (QIAamp One step RT-PCR kit; Qiagen, Hilden) 50 µl final. Vol. Interne Primer: 3RES: ATG GYT CTT GAT AAA TTT GAT ATG TCC (3559-3582) 4RES: AGA CAG GCT AAT TTT TTA GGG A (2077-2095)
p6-2(fw): GGC TGT TGG AAA TGT GGA AAG GA (2023-2045) Produkt: 1505 bp oder 1559 bp Nested PCR (HotStarTaq kit; Qiagen, Hilden), TaqCycle sequencing Sequenzierungs-Primer: Primer A: GAG CCA ACA GCC CCA CC (2149-2165) Primer B: CAA TGG CCA TTG ACA GAA G (2616-2634) Primer C: GGA TCA CCA GCA ATA TTC CA (3012-3031) Primer D: GGA ACT GTA TCC TTT AG/AC TTC CC (2232-2254) Primer F: TGG GCC ATC CAT TCC TGG CTT (2586-2606) Primer G: CAT CCC TGT GGA AGC ACA TT (2988-3004) Primer H: TCT GCT ATT AAG TCT TTT GAT (2512-2529) p6-2(fw): GGC TGT TGG AAA TGT GGA AAG GA (2023-2045) BigDye TaqCycle sequencing kit v1.1, ABI
SLIDE 2
Bedingungen Thermocycler One Stepp RT-PCR (QIAamp One step RT-PCR kit; Qiagen, Hilden) 50°C 30 min 95°C 15 min 95°C 30 sec 65°C 45 sec 72°C 3 min 95°C 30 sec 60°C 45 sec 72°C 3 min 95°C 30 sec (45x) 55°C 45 sec 72°C 3 min 72°C 10 min 4°C ∞ Nested PCR (HotStarTaq kit; Qiagen, Hilden) 93°C 12min 95°C 30 sec 65°C 45 sec 72°C 3 min 95°C 30 sec 60°C 45 sec 72°C 3 min 95°C 30 sec (45x) 55°C 45 sec 72°C 3 min 72°C 10 min 4°C ∞ TaqCycle sequencing (BigDye TaqCycle sequencing kit v1.1, ABI) 96°C 10 sec (36x) 50°C 10 sec 60°C 4 min 4°C ∞
SLIDE 3
gp41-PCR Externe Primer: 5out41: AGT GGT GCA GAG AGA AAA AAG AGC A (7736-7760) 3out41: GCT GTT GAT CCT TTA GGT ATC TTT C (7998-7974) One Stepp RT-PCR (QIAamp One step RT-PCR kit; Qiagen, Hilden) 50 µl final. Vol. Interne Primer: 5in41: GGA GCA GCA GGA AGC ACT AT (7794-7813) 3in41: AGG ACT CTT GCC TGG AGC TG (7966-7947) Nested PCR (HotStarTaq kit; Qiagen, Hilden), TaqCycle sequencing Bedingungen Thermocycler (hier Biometra T3, Heizdeckel: 100°C; 2°C/s) One Stepp RT-PCR (QIAamp One step RT-PCR kit; Qiagen, Hilden) 50°C 30 min 95°C 15 min 95°C 30 sec (36x) 65°C 45 sec 72°C 2 min 4°C ∞ Nested PCR (HotStarTaq kit; Qiagen, Hilden) 95°C 15 min 95°C 30 sec (36x) 60°C 45 sec 72°C 2 min 4°C ∞ TaqCycle sequencing (BigDye TaqCycle sequencing kit v1.1, ABI) 96°C 20 min 96°C 10 sec (30x) 52°C 10 sec 60°C 3 min 4°C ∞
SLIDE 4
Integrase-PCR INT Primer: 5´-INT: ATT GGA GGA AAT GAA CAA GT (4173-4192) 3p31: ATCCTGTCTACYTGCCACACAA (5066-5087) Produkt 914 bp One Stepp RT-PCR (QIAamp One step RT-PCR kit; Qiagen, Hilden) 50 µl final. Vol. Bedingungen Thermocycler One Stepp RT-PCR (QIAamp One step RT-PCR kit; Qiagen, Hilden) 50°C 30 min 95°C 15 min 95°C 30 sec (2x) 65°C 45 sec (-5°C) 72°C 3 min 95°C 30 sec (45x) 55°C 45 sec 72°C 3 min 72°C 10 min 4°C ∞ TaqCycle sequencing (BigDye TaqCycle sequencing kit v1.1, ABI) 96°C 10 sec (36x) 50°C 10 sec 60°C 4 min 4°C ∞
SLIDE 5 V3- PCR Externe Primer: 5957F: TTA GGC ATC TCC TAT GGC AGG AAG AAG 7785R: AGT GCT TCC TGC TGC TCC YAA GAA CCC
- Produkt 1,8 kb
- One Stepp RT-PCR (QIAamp One step RT-PCR kit; Qiagen, Hilden)
50 µl final. Vol. Interne Primer (gp120): 6558F: TGG GAT CAA AGC CTA AAG CCA TGT G 7785R: AGT GCT TCC TGC TGC TCC YAA GAA CCC
Interne Primer (V3): V3-1m(6957F): GTA CAA TGT ACA CAT GGA AT V3-2m(7371R): AAA ATT CCC CTC CAC AAT TA
- Produkt 414 bp
- Nested PCR (HotStarTaq kit; Qiagen, Hilden), TaqCycle sequencing
Sequenzierprimer: 6955FQ cagtacaatgYacacatgg 6955RQ ccatgtgtRcattgtactg Bedingungen Thermocycler One Step RT-PCR (QIAamp One step RT-PCR kit; Qiagen, Hilden) 50°C 30 min 95°C 15 min 95°C 30 sec (4x) 69°C 45 sec (-2.00 dT(°C)) 72°C 3 min 95°C 30 sec (44x) 65°C 45 sec 72°C 3 min 72°C 10 min 4°C ∞
SLIDE 6 Nested PCR (HotStarTaq kit; Qiagen, Hilden) GP120: 95°C 15 min 95°C 30 sec (4x) 69°C 45 sec (-2.00 dT(°C)) 72°C 3 min 95°C 30 sec (44x) 63°C 45 sec 72°C 3 min 72°C 10 min 4°C ∞
V3: 95°C 15 min 95°C 30 sec (4x) 65°C 45 sec (-3.00 dT(°C)) 72°C 2 min 95°C 30 sec (44x) 50°C 45 sec 72°C 2 min 72°C 10 min 4°C ∞ TaqCycle sequencing (BigDye TaqCycle sequencing kit v1.1, ABI) 96°C 20 min 96°C 10 sec 52°C 10 sec 60°C 3 min Scheife an 2, 29x 4°C ∞ Sequenzierprimer: 6955FQ cagtacaatgYacacatgg 6955RQ ccatgtgtRcattgtactg
SLIDE 7 Protokoll zur HBV-Resistenztestung
Stand Dezember 2002 Primer für PCR und Sequenzierung: Die Primer wurden der Publikation“Identification and Characterization of Mutations in Hepatitis B Virus Resistant to Lamivudine“ (M.I. Allen et al, Hepatology Vol. 27, No. 6, 1998) entnommen. Die insgesamt drei Primerpaare umgeben jeweils die YMDD-Region der HBV-Polymerase, die “forward“ Primer des zweiten und des dritten Paares sind identisch: Primer Sequenz Fragmentgröße P1F GGA TGT GTC TGC GGC GTT T Paar 1 P1R ACC CCA TCT TTT TGT TTT GTT AGG 463 bp P2/3F AGA CTC GTG GTG GAC TTC TCT Paar 2 P2R CAA AAG AAA ATT GGT AAC AGC GGT A 542 bp P2/3F AGA CTC GTG GTG GAC TTC TCT Paar 3 P3R ATG AGC TTT GCT CCA GAC C 1057 bp Für die PCR und die Sequenzierungsreaktion werden die gleichen Primer verwendet. Im Zuge des ersten Tests wurde festgestellt, daß mit dem ersten Primerpaar die besten Ergebnisse erzielt werden können, es wird daher auch für die weiteren Tests
- eingesetzt. Mit dem dritten Primerpaar konnte kein PCR-Produkt nachgewiesen werden
(evtl andere Subtypen). Aufreinigung der viralen DNA: Die virale DNA wird aus Serum mittels des QIAamp DNA Blood Mini Kits (aus “Development and assessment of a novel real-time PCR assay for quantitation of HBV DNA“, D. Paraskevis et al, Journal of Virological Methods 103, 2002) aus 200 µl Serum
- gewonnen. Die Aufarbeitung erfolgt nach Angaben des Angaben des Herstellers.
PCR- und Sequenzierungsreaktion: Ansatz für eine Reaktion HotStarTaq (QIAGEN): H2O Q-Solution 10x Puffer dNTPs Primer [10 µM] Hot-Start DNA 66.5 µl 10 µl 10 µl 2 µl je 0.5 µl 0.5 µl 10 µl Cyclereinstellungen PCR (T3 Biometra Trioblock)
SLIDE 8
93°C, 12min 95°C, 30 sec 65°C, 45 sec 72°C, 3 min 95°C, 30 sec 60°C, 45 sec 72°C, 3 min 95°C, 30 sec (45x) 55°C, 45 sec 72°C, 3 min 72°C, 10 min 4°C ∞ Ansatz Sequenzreation: H2O Primer [3 µM] BigDye v2.0 Terminations Mix (ABI) DNA 1 µl 1 µl 4 µl 10 µl Cyclereinstellungen PCR (T3 Biometra Trioblock) 36x 96°C, 10 sec 50°C, 10 sec 60°C, 4 min 4°C ∞ Die Auftrennung der Extensionsprodukte erfolgt mit der kurzen Kapillare, Injektionszeit 15 sec. bei 13, 5 kV für 40 min.
