Blue Valley CAPS Research Graham Wehmeyer, Jonathan - - PowerPoint PPT Presentation

Blue ¡Valley ¡CAPS ¡Research ¡

Graham ¡Wehmeyer, ¡Jonathan ¡ Hermanson, ¡Tim ¡Schaefer, ¡and ¡Ryan ¡ Mclean ¡

Tim ¡Schaefer ¡

• Hoping ¡to ¡aBend ¡Johns ¡Hopkins ¡to ¡study ¡girls ¡
• Greater ¡Kansas ¡City ¡Area ¡Brainbee ¡Champion ¡
• ¡Also ¡Applying ¡for ¡dream ¡school: ¡WestPoint ¡

Graham ¡Wehmeyer ¡

• Majoring ¡in ¡Microbiology ¡at ¡University ¡of ¡

Kansas ¡

• Internship ¡at ¡Dr. ¡Susan ¡Egan’s ¡lab ¡at ¡KU ¡

Jono ¡Hermanson ¡

• Majoring ¡in ¡Biological ¡Chemistry ¡at ¡Tulane ¡

University ¡ ¡

• Just ¡call ¡me ¡James ¡Bond ¡

Ryan ¡McLean ¡

• Majoring ¡in ¡Pharmacy ¡at ¡the ¡University ¡of ¡

Kansas ¡

• Mr. ¡Clean ¡

AusPn ¡RoQnghaus, ¡Brandon ¡ Whitcomb ¡

• AusPn ¡is ¡going ¡to ¡the ¡University ¡of ¡Wisconsin ¡
• Brandon ¡is ¡going ¡to ¡Witchita ¡State ¡University ¡

Contents ¡

• The ¡Problem ¡
• The ¡SoluPon: ¡Arom-­‑O’-­‑Clock ¡
• Lab ¡Work ¡and ¡Results ¡
• Outreach ¡and ¡Awareness ¡

THE ¡PROBLEM ¡

¡Sleep ¡DeprivaPon ¡

• Insomnia ¡
• Trouble ¡falling ¡asleep ¡

Aromocology ¡

FighPng ¡The ¡Insomnia ¡Dragon ¡

Day/Night ¡Scents ¡

Night ¡Mode ¡

Day ¡Mode ¡

Banana ¡Plasmid ¡

• OmpC ¡ Promoter ¡ (BBa_R0082) ¡ – ¡ acPvates ¡

transcripPon ¡when ¡high ¡amounts ¡of ¡OmpR-­‑P ¡

• Banana ¡Odor ¡Generator ¡(ATF1) ¡(BBa_J45199) ¡
• ­‑ ¡The ¡banana ¡smell ¡generator ¡contains ¡an ¡RBS, ¡

the ¡ coding ¡ region ¡ for ¡ the ¡ yeast ¡ alcohol ¡ acetyltransferase ¡(ATF1) ¡,and ¡two ¡terminators. ¡ ATF1 ¡catalyzes ¡producPon ¡of ¡isoamyl ¡acetate, ¡ which ¡ has ¡ a ¡ banana ¡ smell, ¡ from ¡ isoamyl ¡

• alcohol. ¡

Mint ¡Plasmid ¡

• OmpF ¡ Promoter ¡ (BBa_K116500) ¡ -­‑ ¡ A ¡ promoter ¡ for ¡ the ¡ mint ¡ gene ¡ sequence. ¡ It ¡ is ¡

acPvated ¡in ¡the ¡day ¡when ¡low ¡amounts ¡of ¡OmpR-­‑P ¡are ¡present. ¡

• Ribosome ¡Binding ¡Site ¡(RBS) ¡(BBa_B0030) ¡-­‑ ¡A ¡ribosome ¡binding ¡site ¡that ¡will ¡be ¡

aBached ¡to ¡the ¡mint ¡odor ¡generator. ¡

• Mint ¡ Odor ¡ Generator ¡ (BSMT1) ¡ (BBa_J45004)-­‑ ¡ Contains ¡ the ¡ coding ¡ sequence ¡ for ¡

SAM ¡ benzoic ¡ acid/salicylic ¡ acid ¡ carboxyl ¡ methyltransferase ¡ I ¡ (BSMT1). ¡ This ¡ gene ¡ was ¡isolated ¡from ¡petunia ¡and ¡snapdragon ¡plants. ¡BSMT1 ¡catalyzes ¡the ¡conversion ¡

• f ¡benzoic ¡acid ¡to ¡methyl ¡benzoate, ¡which ¡has ¡a ¡floral ¡smell, ¡and ¡salicylic ¡acid ¡to ¡

methyl ¡salicylate, ¡which ¡has ¡a ¡wintergreen ¡smell. ¡

• Terminator ¡1 ¡(BBa_B0010)-­‑ ¡the ¡first ¡of ¡the ¡two ¡terminators ¡we ¡are ¡aBaching ¡to ¡the ¡

mint ¡odor ¡gene, ¡ends ¡transcripPon. ¡

• Terminator ¡2 ¡(BBa_B0012)-­‑ ¡the ¡last ¡of ¡the ¡terminators ¡we ¡are ¡aBaching ¡to ¡the ¡mint ¡

gene, ¡ends ¡transcripPon. ¡

• Light ¡Sensor ¡Protein ¡Complex ¡or ¡Cph8 ¡(BBa_I15010) ¡-­‑ ¡contains ¡coding ¡region ¡for ¡

the ¡light ¡sensor ¡Cph1 ¡and ¡the ¡enzyme ¡EnvZ. ¡This ¡part ¡was ¡taken ¡from ¡a ¡UT ¡previous ¡ iGEM ¡ project. ¡ ¡ If ¡ a ¡ photon ¡ hits ¡ the ¡ light ¡ sensor ¡ Cph1 ¡ it ¡ will ¡ then ¡ inhibit ¡ EnvZ, ¡ stopping ¡phosphorylaPon ¡of ¡OmpR. ¡

LAB ¡WORK ¡AND ¡RESULTS ¡

TransformaPon ¡

We ¡used ¡New ¡England ¡Biolab's ¡High ¡Efficiency ¡TrasformaPon ¡protocol ¡to ¡transform ¡the ¡ OmpC ¡promoter, ¡the ¡banana ¡odor ¡generator, ¡and ¡the ¡mint ¡odor ¡generator. ¡

• 1. ¡Thaw ¡a ¡tube ¡of ¡NEB ¡5-­‑alpha ¡Competent ¡E. ¡coli ¡cells ¡on ¡ice ¡unPl ¡the ¡last ¡ice ¡crystals ¡
• disappear. ¡Mix ¡gently ¡and ¡carefully ¡pipeBe ¡50 ¡µl ¡of ¡cells ¡into ¡a ¡transformaPon ¡tube ¡on ¡
• ice. ¡
• 2. ¡Add ¡1-­‑5 ¡µl ¡containing ¡1 ¡pg-­‑100 ¡ng ¡of ¡plasmid ¡DNA ¡to ¡the ¡cell ¡mixture. ¡Carefully ¡flick ¡

the ¡tube ¡4-­‑5 ¡Pmes ¡to ¡mix ¡cells ¡and ¡DNA. ¡Do ¡not ¡vortex. ¡

• 3. ¡Place ¡the ¡mixture ¡on ¡ice ¡for ¡30 ¡minutes. ¡Do ¡not ¡mix. ¡
• 4. ¡Heat ¡shock ¡at ¡exactly ¡42°C ¡for ¡exactly ¡30 ¡seconds. ¡Do ¡not ¡mix. ¡
• 5. ¡Place ¡on ¡ice ¡for ¡5 ¡minutes. ¡Do ¡not ¡mix. ¡
• 6. ¡PipeBe ¡950 ¡µl ¡of ¡room ¡temperature ¡SOC ¡into ¡the ¡mixture. ¡
• 7. ¡Place ¡at ¡37°C ¡for ¡60 ¡minutes. ¡Shake ¡vigorously ¡(250 ¡rpm) ¡or ¡rotate. ¡
• 8. ¡Warm ¡selecPon ¡plates ¡to ¡37°C. ¡
• 9. ¡Mix ¡the ¡cells ¡thoroughly ¡by ¡flicking ¡the ¡tube ¡and ¡inverPng, ¡then ¡perform ¡several ¡10-­‑

fold ¡serial ¡diluPons ¡in ¡SOC. ¡

• 10. ¡Spread ¡50-­‑100 ¡µl ¡of ¡each ¡diluPon ¡onto ¡a ¡selecPon ¡plate ¡and ¡incubate ¡overnight ¡at ¡

37°C. ¡AlternaPvely, ¡incubate ¡at ¡30°C ¡for ¡24-­‑36 ¡hours ¡or ¡25°C ¡for ¡48 ¡hours. ¡

OmpC ¡Promoter ¡

Banana ¡Odor ¡Generator ¡

Mint ¡Odor ¡Generator ¡

Plasmid ¡PurificaPon ¡

We ¡used ¡the ¡Aurum ¡Plasmid ¡Mini ¡Kit, ¡with ¡the ¡spin ¡method, ¡for ¡plasmid ¡isolaPon ¡and ¡purificaPon. ¡

• 1. ¡Transfer ¡up ¡to ¡12 ¡OD•ml ¡of ¡plasmid-­‑containing ¡bacterial ¡host ¡to ¡a ¡1.5–2.0 ¡ml ¡capped ¡microcentrifuge ¡tube ¡

(not ¡provided). ¡Pellet ¡the ¡cells ¡by ¡centrifugaPon ¡for ¡1 ¡min. ¡Remove ¡all ¡supernatant ¡by ¡decanPng ¡or ¡pipeQng. ¡

• 2. ¡Add ¡250 ¡μl ¡of ¡resuspension ¡soluPon ¡and ¡vortex ¡or ¡pipet ¡up ¡and ¡down ¡unPl ¡the ¡cell ¡pellet ¡is ¡completely ¡
• resuspended. ¡
• 3. ¡Add ¡250 ¡μl ¡of ¡lysis ¡soluPon ¡and ¡mix ¡by ¡inverPng ¡the ¡capped ¡tube ¡briskly ¡6–8 ¡Pmes. ¡DO ¡NOT ¡VORTEX ¡OR ¡
• SHAKE. ¡The ¡soluPon ¡should ¡become ¡viscous ¡and ¡slightly ¡clear. ¡Note: ¡The ¡neutralizaPon ¡soluPon ¡should ¡be ¡

added ¡within ¡5 ¡min ¡aser ¡lysis. ¡

• 4. ¡Add ¡350 ¡μl ¡of ¡neutralizaPon ¡soluPon ¡and ¡mix ¡by ¡inverPng ¡the ¡capped ¡tube ¡briskly ¡6–8 ¡Pmes. ¡DO ¡NOT ¡

VORTEX ¡OR ¡SHAKE. ¡A ¡visible ¡precipitate ¡should ¡form. ¡

• 5. ¡Centrifuge ¡the ¡neutralized ¡lysate ¡for ¡5 ¡min. ¡A ¡compact ¡white ¡debris ¡pellet ¡will ¡form ¡along ¡the ¡side ¡or ¡at ¡the ¡

boBom ¡of ¡the ¡tube. ¡The ¡supernatant ¡or ¡cleared ¡lysate ¡contains ¡the ¡plasmid ¡DNA. ¡

• 6. ¡While ¡centrifuging ¡the ¡lysate, ¡insert ¡a ¡plasmid ¡mini ¡column ¡into ¡a ¡2 ¡ml ¡capless ¡wash ¡tube ¡(provided). ¡
• 7. ¡By ¡decanPng ¡or ¡pipeQng, ¡transfer ¡the ¡cleared ¡lysate ¡from ¡step ¡5 ¡to ¡the ¡plasmid ¡mini ¡column. ¡Centrifuge ¡for ¡1 ¡
• min. ¡
• 8. ¡The ¡wash ¡soluPon ¡is ¡supplied ¡as ¡a ¡5x ¡concentrate. ¡Add ¡4 ¡volumes ¡(100 ¡ml) ¡of ¡95–100% ¡ethanol ¡or ¡reagent-­‑

grade ¡(denatured) ¡ethanol ¡before ¡iniPal ¡use. ¡

• 9. ¡Remove ¡the ¡plasmid ¡mini ¡column ¡from ¡the ¡wash ¡tube. ¡Discard ¡the ¡filtrate ¡from ¡the ¡tube, ¡and ¡replace ¡the ¡

column ¡into ¡the ¡same ¡wash ¡tube. ¡Add ¡750 ¡μl ¡of ¡wash ¡soluPon ¡and ¡centrifuge ¡for ¡1 ¡min. ¡

• 10. ¡Discard ¡the ¡wash ¡soluPon ¡from ¡the ¡tube, ¡and ¡replace ¡the ¡column ¡into ¡the ¡same ¡wash ¡tube. ¡Centrifuge ¡for ¡1 ¡

addiPonal ¡minute ¡to ¡remove ¡residual ¡wash ¡soluPon. ¡

• 11. ¡Transfer ¡the ¡plasmid ¡mini ¡column ¡to ¡a ¡1.5–2.0 ¡ml ¡capped ¡microcentrifuge ¡tube ¡(not ¡provided). ¡Add ¡50 ¡μl ¡of ¡

eluPon ¡soluPon ¡onto ¡the ¡membrane ¡stack ¡at ¡the ¡base ¡of ¡the ¡column ¡and ¡allow ¡1 ¡min ¡for ¡the ¡soluPon ¡to ¡ saturate ¡the ¡membranes. ¡Centrifuge ¡for ¡1 ¡min ¡to ¡elute ¡the ¡plasmid. ¡

• 12. ¡Discard ¡the ¡mini ¡column ¡and ¡store ¡the ¡eluted ¡DNA ¡at ¡4ºC. ¡

QuanPficaPon ¡of ¡DNA ¡

• Used ¡Spectrophotometer ¡
• OmpC: ¡20 ¡ng/ul, ¡25 ¡ng/ul ¡
• Banana: ¡43 ¡ng/ul, ¡20 ¡ng/ul ¡

RestricPon ¡DigesPon ¡

• We ¡did ¡restricPon ¡digests ¡on ¡OmpC ¡and ¡

Banana ¡Odor ¡Generator. ¡

• We ¡set ¡up ¡our ¡restricPon ¡digesPons ¡as ¡

suggested ¡by ¡New ¡England ¡Biolabs. ¡We ¡ incubated ¡the ¡reacPons ¡at ¡37°C ¡for ¡30 ¡minutes ¡ and ¡then ¡heat ¡inacPvated ¡for ¡20 ¡minutes ¡at ¡ 80°C. ¡

RestricPon ¡Digest ¡ReacPons ¡

OmpC ¡

• 25 ¡ul ¡Purified ¡Plasmid ¡(500 ¡

ng) ¡

• 1 ¡ul ¡SpeI ¡RestricPon ¡Enzyme ¡
• 1 ¡ul ¡PstI ¡RestricPon ¡Enzyme ¡
• 5 ¡ul ¡10X ¡NEB ¡Buffer ¡2 ¡
• .5 ¡ul ¡100X ¡BSA ¡
• 17.5 ¡ul ¡H20 ¡
• Total: ¡50 ¡ul ¡

Banana ¡

• 11.4 ¡ul ¡Purified ¡Plasmid ¡

(500 ¡ng) ¡

• 1 ¡ul ¡Xbal ¡RestricPon ¡Enzyme ¡
• 1 ¡ul ¡PstI ¡RestricPon ¡Enzyme ¡
• 5 ¡ul ¡10X ¡NEB ¡Buffer ¡3 ¡
• .5 ¡ul ¡100X ¡BSA ¡
• 31.1 ¡ul ¡H20 ¡
• Total: ¡50 ¡ul ¡

Gel ¡ExtracPon ¡

Gel ¡ExtracKon/Fragment ¡PurificaKon ¡ We ¡used ¡the ¡Sigma ¡GenElute™ ¡Gel ¡DNA ¡ExtracPon ¡Kit ¡to ¡elute ¡the ¡digested ¡DNA ¡out ¡of ¡the ¡gel. ¡Procedure ¡A. ¡Spin ¡Procedure ¡for ¡Agarose ¡Gels ¡ All ¡centrifugaPons ¡(spins) ¡are ¡performed ¡at ¡12,000 ¡to ¡16,000 ¡x ¡g ¡(See ¡Appendix ¡I ¡to ¡convert ¡g-­‑force ¡to ¡rpm). ¡

• 1a. ¡Excise ¡band. ¡Excise ¡the ¡DNA ¡fragment ¡of ¡interest ¡from ¡the ¡agarose ¡gel ¡with ¡a ¡clean, ¡sharp ¡scalpel ¡or ¡razor ¡blade. ¡Trim ¡away ¡excess ¡gel ¡to ¡

minimize ¡the ¡amount ¡of ¡agarose. ¡

• 2a. ¡Weigh ¡gel. ¡Weigh ¡the ¡gel ¡slice ¡in ¡a ¡tared ¡colorless ¡tube. ¡
• 3a. ¡Solubilize ¡gel. ¡Add ¡3 ¡gel ¡volumes ¡of ¡the ¡Gel ¡SolubilizaPon ¡SoluPon ¡to ¡the ¡gel ¡slice. ¡In ¡other ¡words, ¡for ¡every ¡100 ¡mg ¡of ¡agarose ¡gel, ¡add ¡300 ¡

µL ¡of ¡Gel ¡SolubilizaPon ¡SoluPon. ¡Incubate ¡the ¡gel ¡mixture ¡at ¡50-­‑60 ¡°C ¡for ¡10 ¡minutes, ¡or ¡unPl ¡the ¡gel ¡slice ¡is ¡completely ¡dissolved. ¡Vortex ¡ briefly ¡every ¡2-­‑3 ¡minutes ¡during ¡incubaPon ¡to ¡help ¡dissolve ¡the ¡gel. ¡ ¡

• 4a. ¡Prepare ¡binding ¡column. ¡Place ¡the ¡GenElute ¡Binding ¡Column ¡G ¡into ¡one ¡of ¡the ¡provided ¡2 ¡ml ¡collecPon ¡tubes. ¡Add ¡500 ¡µL ¡of ¡the ¡Column ¡

PreparaPon ¡SoluPon ¡to ¡each ¡binding ¡column. ¡Centrifuge ¡for ¡1 ¡minute. ¡Discard ¡flowthrough ¡liquid. ¡

• 5a. ¡Check ¡the ¡color ¡of ¡the ¡mixture. ¡Once ¡the ¡gel ¡slice ¡is ¡completely ¡dissolved ¡(step ¡3a) ¡make ¡sure ¡the ¡color ¡of ¡the ¡mixture ¡is ¡yellow ¡(similar ¡to ¡

fresh ¡Gel ¡SolubilizaPon ¡SoluPon ¡with ¡no ¡gel ¡slice) ¡prior ¡to ¡proceeding ¡to ¡the ¡following ¡step. ¡ ¡

• 6a. ¡Add ¡isopropanol. ¡Add ¡1 ¡gel ¡volume ¡of ¡100% ¡isopropanol ¡and ¡mix ¡unPl ¡homogenous. ¡For ¡a ¡gel ¡with ¡an ¡agarose ¡concentraPon ¡greater ¡than ¡

2%, ¡use ¡2 ¡gel ¡volumes ¡of ¡100% ¡isopropanol. ¡

• 7a. ¡Bind ¡DNA. ¡Load ¡the ¡solubilized ¡gel ¡soluPon ¡mixture ¡from ¡step ¡6a ¡into ¡the ¡binding ¡column ¡that ¡is ¡assembled ¡in ¡a ¡2 ¡ml ¡collecPon ¡tube. ¡It ¡is ¡

normal ¡to ¡see ¡an ¡occasional ¡color ¡change ¡from ¡yellow ¡to ¡red ¡once ¡the ¡sample ¡is ¡applied ¡to ¡the ¡binding ¡column. ¡If ¡the ¡volume ¡of ¡the ¡gel ¡ mixture ¡is ¡>700 ¡µL, ¡load ¡the ¡sample ¡onto ¡the ¡column ¡in ¡700 ¡µL ¡porPons. ¡Centrifuge ¡for ¡1 ¡minute ¡aser ¡loading ¡the ¡column ¡each ¡Pme. ¡Discard ¡ the ¡flowthrough ¡liquid. ¡ ¡

• 8a. ¡Wash ¡column. ¡Add ¡700 ¡µL ¡of ¡Wash ¡SoluPon ¡(diluted ¡from ¡Wash ¡SoluPon ¡Concentrate ¡G ¡as ¡described ¡under ¡PreparaPon ¡InstrucPons) ¡to ¡

the ¡binding ¡column. ¡Centrifuge ¡for ¡1 ¡minute. ¡Remove ¡the ¡binding ¡column ¡from ¡the ¡collecPon ¡tube ¡and ¡discard ¡the ¡flow-­‑through ¡liquid. ¡Place ¡ the ¡binding ¡column ¡back ¡into ¡the ¡collecPon ¡tube ¡and ¡centrifuge ¡again ¡for ¡1 ¡minute ¡without ¡any ¡addiPonal ¡wash ¡soluPon ¡to ¡remove ¡excess ¡

• ethanol. ¡ ¡
• 9a. ¡Elute ¡DNA. ¡Transfer ¡the ¡binding ¡column ¡to ¡a ¡fresh ¡collecPon ¡tube. ¡Add ¡50 ¡µL ¡of ¡EluPon ¡SoluPon ¡to ¡the ¡center ¡of ¡the ¡membrane ¡and ¡

incubate ¡for ¡1 ¡minute. ¡Centrifuge ¡for ¡1 ¡minute. ¡ ¡

Future ¡Uses ¡

CAPS ¡engineering ¡partnership ¡ Arom-­‑O’Clock ¡put ¡into ¡acPon ¡ Sell ¡product ¡ Good-­‑bye ¡sleep ¡problems ¡ More ¡aromaology ¡ApplicaPons ¡(Alzheimer's) ¡

CAPS ¡Engineering ¡Partnership ¡

Arom-­‑O’Clock ¡Put ¡Into ¡AcPon ¡

Sell ¡Product ¡

Good-­‑bye ¡Sleep ¡Problems ¡

HUMAN ¡PRACTICES ¡

Our ¡IntroducPon ¡to ¡SynthePc ¡Biology ¡

• CAPS ¡Bioscience ¡Classes ¡
• Dr. ¡Todd ¡Eckdahl’s ¡synthePc ¡biology ¡workshop ¡

at ¡Missouri ¡Western ¡University ¡

Middle ¡School ¡Camps ¡

• CAPS ¡Bioscience ¡Camp ¡-­‑25 ¡middle ¡schoolers ¡
• KSU ¡ Engineering ¡ Camp ¡ where ¡ 24 ¡ ninth ¡

graders ¡completed ¡the ¡3A ¡ ¡Assembly ¡Kit. ¡

• KSU ¡Engineering ¡Workshop ¡where ¡15 ¡middle ¡

and ¡ high ¡ school ¡ biology ¡ instructors ¡ completed ¡ a ¡ 3A ¡ ¡ Assembly ¡ paper ¡ acPvity ¡ created ¡by ¡the ¡CAPS ¡Bioscience ¡instructors. ¡

Middle ¡School ¡Camp ¡

Elementary ¡School ¡Outreach ¡

• CoBonwood ¡Point ¡Elementary ¡School ¡Science ¡
• utreach ¡where ¡40 ¡second ¡graders ¡were ¡

introduce ¡to ¡DNA ¡ ¡and ¡forensics. ¡

Safety ¡

• The ¡CAPS ¡Bioscience ¡Research ¡Team ¡made ¡

sasey ¡a ¡number ¡one ¡priority ¡throughout ¡

• experimentaPon. ¡We ¡followed ¡all ¡general ¡

sasey ¡rules ¡outlined ¡in ¡the ¡manual ¡below, ¡and ¡ took ¡extra ¡precauPon ¡when ¡dealing ¡with ¡ potenPally ¡hazardous ¡materials. ¡Lab ¡coats, ¡ protecPve ¡eyeware, ¡and ¡gloves ¡were ¡worn ¡at ¡ all ¡Pmes ¡while ¡in ¡the ¡lab, ¡and ¡general ¡sasey ¡ awareness ¡was ¡promoted ¡by ¡all ¡members ¡of ¡ the ¡team. ¡

Acknowledgements ¡

• We ¡would ¡like ¡to ¡thank, ¡first ¡and ¡foremost, ¡our ¡

advisors/teachers: ¡Mr. ¡Joe ¡Whalen ¡and ¡Mrs. ¡ Eric ¡Kessler ¡

• Special ¡thanks ¡to ¡Natalie ¡Kuldell ¡at ¡BioBuilder, ¡

Todd ¡Eckdahl ¡at ¡Missouri ¡Western, ¡and ¡Alyssa ¡ Henning ¡at ¡Ginkgo ¡Bioworks. ¡

Lessons ¡Learned ¡

• InnovaPon ¡
• Give-­‑and-­‑Take ¡
• Entertainment ¡
• Moving ¡Forward ¡