What is a BioBot? Biological robot programmed to sense, interac t - - PowerPoint PPT Presentation

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What is a BioBot? Biological robot programmed to sense, interac t - - PowerPoint PPT Presentation

Jul 20, 2023 122 likes •621 views

What is a BioBot? Biological robot programmed to sense, interac t with environment What would make a good BioBot? Multiple Configurations What are the naturally occurring cell sensors that interact with the human body? Integrins

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What is a BioBot?

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Biological robot programmed to sense, with environment interac t ¡

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What would make a good BioBot?

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Multiple

Configurations

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What are the naturally occurring cell sensors that interact with the human body?

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Integrins

  • Previous attempts to

express integrins on bacterial cells were unsuccessful

  • Differences in the

intercellular

  • rganizations of

mammalian and bacterial cells

  • We propose to

redesign the integrin extracellular sequence and use bacterial display technologies to solve these issues

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What are the synthetic biology tools that we need to achieve this goal?

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Our Project

RBS PCR Assembly

Transcribe ¡ (1) ¡ Transport ¡ (2) ¡ Dimerize ¡ (3) ¡ Bind ¡ligand ¡ (4) ¡

PET-mCherry Z-Domain Split GFP KQAGDV-GFP

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Our Project

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Outreach RBS Primer PET-mCherry Split GFP KQAGDV-GFP Z-domain

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RBS PCR Assembly

ATG ¡ BioBrick ¡

RBS ¡

Suffix ¡ Prefix ¡

Transcribe ¡

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SLIDE 14

ATG ¡ BioBrick ¡ Suffix ¡ Prefix ¡

RBS PCR Assembly

ATG ¡ BioBrick ¡

RBS ¡

Suffix ¡ Prefix ¡ Duplex ¡InserFon ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡3A ¡Assembly ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Standard ¡Assembly ¡

Transcribe ¡

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RBS PCR Assembly

Transcribe ¡

[1] ¡

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RBS Primer Design

Transcribe ¡

Scar

T A C T A G A A A G A G G A G A A A

Ribosomal Binding Site

A T G

Part

G A A T T C G C G G C C G C T T C T A G

Prefix Back-Bone

T G

EcoRI XbaI

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Primer Testing

ATG ¡Parts ¡from ¡iGEM ¡Well ¡Plates ¡ PCR ¡ reac6on ¡ iGEM ¡Kit ¡ Transcribe ¡

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Primer Testing

  • Amplification indicates presence of site
  • Amplification of 21/24 BioBricks from plate

Unsuccess ful ¡ 12% ¡ Successful ¡ 88% ¡ Transcribe ¡

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RBS Primer

New RBS Primer 3A Assembly Time 15 min active 2 hr PCR 48 hr process Labor Intensive? No Yes Success Rate 87.5% <10% Cost $ $$$$

Transcribe ¡

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RBS PCR Assembly

Sense Primer: RBS Primer EcoRI XbaI RBS Scar TGGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAGATG Antisense Primer: Standard Antisense Sequencing Primer (VR) GTATTACCGCCTTTGAGTGA Transcribe ¡

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How do we transport sensors

to the surface of cells?

PET-mCherry

Transcribe ¡ Transport ¡

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SLIDE 22

Autodisplay

SP ¡ ¡ ¡passenger ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡linker ¡β-­‑barrel ¡ autotransporter ¡ Transport ¡ Transcribe ¡

[3] ¡

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SLIDE 23

PET-mCherry

  • Optimized for E.

coli

  • Removal of

Standard 10 restriction sites

  • Addition of T7,

lacI, and RBS

  • Packaged for

Biobrick Standard 10

Prefi x mCherry Suffix T7 + LacI + RBS SP passenger linker β-barrel

Transport ¡ Transcribe ¡

[3] ¡

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PET-mCherry gBlock Assembly

Transport ¡ Transcribe ¡

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SLIDE 25

PET-mCherry

NovaBlue (DE3)

  • E. coli

Nitrocellulose Paper IPTG Plate

PET_mCherry Expression through IPTG induction!

Transport ¡ Transcribe ¡

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PET-mCherry

  • Characterization using:
  • Flow cytometry
  • Immunostaining
  • Monoclonal

mouse and polyclonal rabbit Ab

  • Secondary

fluorescently tagged anti- mouse or anti- rabbit ¡

Transport ¡ Transcribe ¡

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SLIDE 27

PET-mCherry

Pet-­‑mCherry ¡ Pet-­‑mCherry ¡IPTG ¡ Control ¡+ ¡IPTG ¡ Control ¡ Transport ¡ Transcribe ¡

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Does LacI work?

YES!

Transport ¡ Transcribe ¡

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Is PET-mCherry extracellularly

expressed?

Most Likely…

Transport ¡ Transcribe ¡

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SLIDE 30

Z-domain

What is an alternative to autotransporters?

Transport ¡ Transcribe ¡

[3] ¡

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SLIDE 31

Z-domain

Sense PRM Antisense PRM Zdomain 1 Zdomain 2

  • IgG binding domain that naturally occurs in

staphylococcus aureus

  • Redesigned for E. coli
  • Double binding site

Z domain

  • E. ¡coli ¡

Transport ¡ Transcribe ¡

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Z Domain

Z ¡Domain ¡ Z ¡Domain ¡

  • E. Coli Cell

Transport ¡ Transcribe ¡

Alph subu Be su

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SLIDE 33

How do we characterize dimerization?

Split GFP

Transport ¡ Transcribe ¡ Dimerize ¡

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SLIDE 34
  • Sequence on Registry is correct
  • However restriction digest found EcoRI site
  • Site directed mutagenesis used to correct

error

Split GFP

BBa k916003

BBa B0034

PstI (722) ANTISEN SE PRM SENSE PRM pSB1A3 Bba K916003 Bba B0034 RBS splitGFP

2937 bp

EcoRI Transport ¡ Transcribe ¡ Dimerize ¡

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SLIDE 35

How do we determine active binding after dimerization?

KQAGDV-GFP

Transcribe ¡ Transport ¡ Dimerize ¡ Bind ¡Ligand ¡

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SLIDE 36

KQAGDV-GFP

  • Binding region of fibrinogen

fused with fluorescent protein

  • Fibrinogen is the natural

ligand for α2bβ3 integrins

KQAG DV

Transport ¡ Transcribe ¡ Dimerize ¡ Bind ¡Ligand ¡

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SLIDE 37
  • BioBot ¡v.1 ¡

Summary of Work

Prefix ¡

BioBrick ¡

Transcribe ¡ (1) ¡ Transport ¡ (2) ¡ Dimerize ¡ (3) ¡ Bind ¡ligand ¡ (4) ¡

RBS Primer PET-mCherry Z-Domain Split GFP KQAGDV-GFP

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  • BioBot ¡v.1 ¡

Outreach

  • Work ¡with ¡Nicole ¡Chapman ¡from ¡

Core]a ¡Sco] ¡King ¡Women’s ¡School ¡

  • Aid ¡the ¡Lambert ¡High ¡School ¡iGEM ¡

Team ¡

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SLIDE 39

Working with Nicole

Chapman

  • Chemistry ¡and ¡Biotechnology ¡teacher ¡at ¡

Core]a ¡Sco] ¡King ¡School ¡

  • ¡Founding ¡a ¡high ¡school ¡iGEM ¡Team ¡
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Is HybB a cold-shock promoter?

Helping Lambert High

School

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Helping Lambert

High School

HybB ¡ YFP ¡ fdrA ¡ CFP ¡

HybB ¡Promoter ¡ Control ¡Promoter ¡

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SLIDE 42

Helping Lambert

High School

HybB ¡-­‑ ¡YFP ¡ Control ¡-­‑ ¡CFP ¡ HybB ¡-­‑ ¡YFP ¡ Control ¡-­‑ ¡CFP ¡ No ¡InducFon ¡ Cold ¡Shock ¡Induced ¡

There is no difference!

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Recap

Although we did not end up expressing the integrin, major steps have been made towards

  • ur goal:
  • The development of the standard RBS primer
  • Indications that PET mCherry (large

autotransporter) is expressed on cell surface

  • Developed alternative autotransporter with Z-

Domain

  • Fixed Split GFP from previous years, which

can indicate presence of expressed integrins

  • Introduced iGEM to Coretta Scott King High

School

  • Helped Lambert iGEM through

experimentation with hybB promoter

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  • BioBot ¡v.1 ¡

Future Work

  • Fuse αIIb β3 integrin subunits to an

autotransporter or IgG binding domain (Z Domain)

  • Characterize our BioBot interaction
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  • BioBot ¡v.1 ¡

Parts

BBa_K1156000 Pet_mcherry BBa_K1156001 Z domain BBa_K1156002 GFP-KQAGDV BBa_K1156003 T7-lacI BBa_K1156004 RBS-NGFP BBa_K1156005 RBS-CGFP BBa_K9160003 NGFP BBa_K1156006 T7lacIrbsGFPN BBa_K1156007 T7lacIrbsKQAGDV BBa_K1156008 T7LacIrbsGFPC BBa_K1156009 T7lacIrbsNGFPrbsCG FP

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The Team

Team Members: Rachael Blackstone Tilak Balavijayan Haoli Du Jack Jenkins Spencer Cooper Casey Haynes Jessica Siemer Facilitators:

  • Dr. Anton

Bryksin Haylee Bachman Vince Fiore

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Acknowledgements

Thank you to all the people and companies that made Georgia Tech iGEM possible!

  • Georgia Tech Biomedical Engineering

Department

  • Macrogen USA
  • Integrated DNA Technologies
  • VWR
  • Dr. Thomas Barker
  • Dr. Robert Guldberg
  • Dr. Larry McIntire
  • Dr. Ravi Bellamkonda
  • Dr. Esfandiar Behravesh
  • Dr. Mark Styczynski
  • Dr. M.G. Finn
  • Dr. Brian Hammer
  • Dr. Kirill Lobachev
  • Dr. Gang Bao
  • Dr. Eric Gaucher
  • Dr. Barbara Fasse
  • Edward Burdette
  • Jesus Mata-Acosta
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Resources

1. Bryksin, A. V., & Matsumura, I. (2010). Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids. BioTechniques, 48(6), 463. 2. By Integrin.png:Juergen Bode at de.wikipedia derivative work: Odysseus1479 (Integrin.png) [CC-BY-SA-3.0 (http:// creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], from Wikimedia Commons 3. Sevastsyanovich et al. Microbial Cell Factories 2012, 11:69 Page 3 of 10 4. PCR tubes [Web Photo]. Retrieved from http://www.bioworld.com/siteaccounts/masterfiles/IMAGES/ PI-11190019.jpg 5. 96 well plate [Web Photo]. Retrieved from http://www.4ti.co.uk/files/cache/ e7199a9f456dacab058c6be0b54e9235.jpg 6. Brown, S. D., Fiedler, J. D., & Finn, M. G. (2009). Assembly

  • f hybrid bacteriophage qβ virus-like particles. Biochemistry,

(48), 11155–11157. Retrieved from http://pubs.acs.org/doi/ pdf/10.1021/bi901306p

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Thank you! Questions?