Introduction Introduction Cysteine Cysteine Proteinases - PDF document

ั ั ั ์ 22/07/54 Oral Presentation CRDC 5 การศึกษาบริเวณเร่งปฏิกิริยาตําแหน่ง S 1 subsite เอนไซม์ปาเปน ทําปฏิกิริยากับซับสเตรตสังเคราะห์อนุพันธ์พารา - ไนโตรอะนิไลด์ ํ ป ิ ิ ิ ั ์ ไ โ ิไ ์ Study on active site at S 1 subsite position of papain reaction with synthesized p -nitroanilide derivative substrates สุรพงษ์ พินิจกลาง 1 ศิริพร จิรเจริญผล คิน เลย์ คู 2 รัชนี ไสยประจง 1 และ กนก รตนกนกชย กนก รัตนกนกชัย 2 1 คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหอการค้าไทย 2 คณะทรัพยากรชีวภาพและเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าธนบุรี 1 1 Introduction Introduction � Cysteine Cysteine Proteinases Proteinases � Papain (EC 3.4.22.6) � Fruit Bromelain (EC 3.4.22.33) � Ficain (EC 3.4.22.3) � Actinidain (EC 3.4.22.14) 2 2 1

22/07/54 Oral Presentation CRDC 5 3 3 Molecular Modeling Molecular Modeling 1PPP Papain : CRYSTAL STRUCTURE OF PAPAIN-E64-C COMPLEX. BINDING DIVERSITY OF E64-C TO PAPAIN S2 AND S3 SUBSITES Authers : Kim, M.J. , Yamamoto, D. , Matsumoto, K. , Inoue, M. , Ishida, T. , Mizuno, H. , Sumiya, S. , Kitamura, K. Journal: (1992) Biochem.J. 287: 797-803 4 4 2

ุ 22/07/54 Oral Presentation CRDC 5 Molecular Docking Molecular Docking 5 5 Method � แยกเอนไซม์ปาเปนให้บริสุทธิ� � การสังเคราะห์ซับสเตรตอนุพันธ์พารา - ไนโตรอะนิไลด์ � ตรวจสอบโครงสร้างวิธี NMR � ตรวจสอบ L-form วิธี Optical analysis � ตรวจสอบมวลโมเลกุลวิธี Mass Spectrophotometer � ตรวจสอบปริมารธาตุ C,H และ N วิธี Elemental analysis l i � Enzyme catalysed hydrolysis 3

22/07/54 Oral Presentation CRDC 5 Results Results 7 7 • Papain Green • Chymopapain Blue • Caricain Yellow • Actinidain Red • Fruit Bromelain Pink Sequence Identity 30.7 % Sequence Similarity 37.5% Fig.1 Superimpositions of cysteine proteinases 8 8 4

22/07/54 Oral Presentation CRDC 5 B A A : Papain B: Actinidain Fig 2. Three – dimensional structure of papain and actinidain 9 9 A B A : Papain A : Papain B: Actinidain Fig 3. Electrostatic surface of papain and actinidain 10 10 5

22/07/54 Oral Presentation CRDC 5 Asp161 O … H4 His162 H … O17 His162 H … O18 Gln19 H22 … O18 Gln19 H22 … O17 Gly68 O … H5 Cys25 S … H4 y Gly68 N … O5 Gln19 H21 … O17 Cys25 N … O17 Fig 4. Active site binding interactions between actinidain and E64c within 3.5 Å 11 11 PDB-code 1PPP 12 12 Fig 5. Papain and E64c complex 6

22/07/54 Oral Presentation CRDC 5 Asp158 O … H4 His159 H … O17 His159 H … O18 Gln19 H22 … O18 Gln19 H22 … O17 Gly66 N … O5 Gln19 H21 … O17 Cys25 N … O17 Trp26 N … O5 Fig 6. Active site binding interactions between papain and E64c within 3.5 Å 13 13 Asp 158 Papain Asp161 Actidain His 159 His 162 Cys25 Cys25 Gln 19 Gly 66 Gln 19 Gly 68 Gly 68 Trp 26 E64c complex with Papain E64c complex with Actinidain 14 14 Fig 7. Active site binding of papain and actinidain complexs with E64c 7

22/07/54 Oral Presentation CRDC 5 N -Ac-L-Phe-Arg- p -nitroanilide N -Ac-L-Phe-Gly- p -nitroanilide Fig 8. N -Ac-L-Phe-Leu- p -nitroanilide N -Ac-L-Phe-Phe- p -nitroanile 15 15 Fig 9. N -Ac-L-Phe- Gly - p -nitroanilide K i =1.53 mM, K cat / K m =269.77M -1 s -1 8

22/07/54 Oral Presentation CRDC 5 Fig 10 N -Ac-L-Phe- Leu - p -nitroanilide K i =20.23 μ M, K cat / K m =1367.00 M -1 s -1 Fig 11 N -Ac-L-Phe- Phe - p -nitroanilide K i =295.86 μ M, K cat / K m =473.49 M -1 s -1 9

22/07/54 Oral Presentation CRDC 5 Fig 12 N -Ac-L-Phe- Arg - p -nitroanile K i =116.65 μ M, K cat / K m =1469.37 M -1 s -1 Fig 13 N -Ac-L-Phe-Arg- p -nitroanilide สีเหลือง N -Ac-L-Phe-Gly- p -nitroanilide สีฟ้า N -Ac-L-Phe-Leu- p -nitroanilide สีเขียว N -Ac-L-Phe-Phe- p -nitroanile สีม่วง 10

22/07/54 Oral Presentation CRDC 5 Fig 14 N -Ac-L-Glu-Phe-Arg- p -nitroanilide Fig 15 การทําโมเลคิวลาร์ ด๊อกกิ�งระหว่างซับสเตรต N -Ac-L-Glu-Phe-Arg- p -nitroanilide กับ เอนไซม์ปาเปน K i =22.65 nM 11

22/07/54 Oral Presentation CRDC 5 Conclusion Conclusion 1 .N -Ac-L-Phe- Gly - p -nitroanilide K i =1.53 mM, K cat / K m =269.77M -1 s -1 2. N -Ac-L-Phe-Leu- p -nitroanilide K i =20.23 μ M, K cat / K m =1367.00 M -1 s -1 3. N -Ac-L-Phe-Phe-p-nitroanilide K i =295.86 μ M, K cat / K m = 473.49 M -1 s -1 4. N -Ac-L-Phe-Arg- p -nitroanile K i =116.65 μ M, K cat / K m =1469.37 M -1 s -1 5. บริเวณ Active site ตําแหน่ง S 1 subsite ของเอนไซม์ปาเปนมีสมบัติ Broad specificity 23 23 Thank You 24 24 12