Introduction Introduction Cysteine Cysteine Proteinases - - PDF document

Oral Presentation CRDC 5 22/07/54 1

การศึกษาบริเวณเร่งปฏิกิริยาตําแหน่ง S1subsite เอนไซม์ปาเปน ํ ป ิ ิ ิ ั ั ั ์ ั ์ ไ โ ิไ ์ ทําปฏิกิริยากับซับสเตรตสังเคราะห์อนุพันธ์พารา-ไนโตรอะนิไลด์

Study on active site at S1 subsite position of papain reaction with synthesized p-nitroanilide derivative substrates

สุรพงษ์ พินิจกลาง1 ศิริพร จิรเจริญผล คิน เลย์ คู2 รัชนี ไสยประจง1 และ กนก รัตนกนกชัย2 กนก รตนกนกชย

1คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยหอการค้าไทย 2คณะทรัพยากรชีวภาพและเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าธนบุรี

1 1

Introduction Introduction

Cysteine

Cysteine Proteinases Proteinases

Papain (EC 3.4.22.6) Fruit Bromelain (EC 3.4.22.33) Ficain (EC 3.4.22.3) Actinidain (EC 3.4.22.14)

2 2

Oral Presentation CRDC 5 22/07/54 2

3 3

Molecular Modeling Molecular Modeling

1PPP Papain : CRYSTAL STRUCTURE OF PAPAIN-E64-C

• COMPLEX. BINDING DIVERSITY OF E64-C TO PAPAIN S2 AND S3

SUBSITES Authers : Kim, M.J., Yamamoto, D., Matsumoto, K., Inoue, M., Ishida, T., Mizuno, H., Sumiya, S., Kitamura, K. Journal: (1992) Biochem.J. 287: 797-803

4 4

Oral Presentation CRDC 5 22/07/54 3

Molecular Docking Molecular Docking

5 5

Method

แยกเอนไซม์ปาเปนให้บริสุทธิ การสังเคราะห์ซับสเตรตอนุพันธ์พารา-ไนโตรอะนิไลด์

ุ

ตรวจสอบโครงสร้างวิธี NMR ตรวจสอบ L-form วิธี Optical analysis ตรวจสอบมวลโมเลกุลวิธี Mass Spectrophotometer ตรวจสอบปริมารธาตุ C,H และ N วิธี Elemental

l i analysis

Enzyme catalysed hydrolysis

Oral Presentation CRDC 5 22/07/54 4

Results Results

7 7

• Papain

Green

• Chymopapain

Blue

• Caricain

Yellow

• Actinidain

Red

• Fruit Bromelain Pink

Sequence Similarity 37.5% Sequence Identity 30.7 %

Fig.1 Superimpositions of cysteine proteinases 8

8

Oral Presentation CRDC 5 22/07/54 5

A B A : Papain B: Actinidain

Fig 2. Three – dimensional structure of papain and actinidain

9 9

A B A : Papain A : Papain B: Actinidain

Fig 3. Electrostatic surface of papain and actinidain

10 10

Oral Presentation CRDC 5 22/07/54 6

His162 H … O17 Asp161 O … H4 Gln19 H22 … O18 Gln19 H22 … O17 Gly68 O … H5 His162 H … O18 Cys25 S … H4 Gln19 H21 … O17 Gly68 N … O5 Cys25 N … O17 y Fig 4. Active site binding interactions between actinidain and E64c within 3.5 Å 11

11

PDB-code 1PPP

Fig 5. Papain and E64c complex

12 12

Oral Presentation CRDC 5 22/07/54 7

His159 H … O17 His159 H … O18 Asp158 O … H4 Gln19 H22 … O17 Gln19 H22 … O18 Trp26 N … O5 Cys25 N … O17 Gln19 H21 … O17 Gly66 N … O5 Fig 6. Active site binding interactions between papain and E64c within 3.5 Å 13

13

His 159 His 162 Asp 158 Asp161 Papain Actidain Gln 19 Gln 19 Cys25 Cys25 Gly 66 Gly 68 Gly 68 Trp 26 E64c complex with Papain E64c complex with Actinidain Fig 7. Active site binding of papain and actinidain complexs with E64c

14 14

Oral Presentation CRDC 5 22/07/54 8

N-Ac-L-Phe-Arg-p-nitroanilide N-Ac-L-Phe-Gly-p-nitroanilide

15 15

Fig 8. N-Ac-L-Phe-Leu-p-nitroanilide N -Ac-L-Phe-Phe-p-nitroanile Fig 9. N-Ac-L-Phe- Gly -p-nitroanilide Ki=1.53 mM, Kcat/Km=269.77M-1s-1

Oral Presentation CRDC 5 22/07/54 9

Fig 10 N-Ac-L-Phe- Leu -p-nitroanilide Ki=20.23 μM, Kcat/Km=1367.00 M-1s-1 Fig 11 N-Ac-L-Phe- Phe -p-nitroanilide Ki=295.86 μM, Kcat/Km=473.49 M-1s-1

Oral Presentation CRDC 5 22/07/54 10

Fig 12 N -Ac-L-Phe- Arg -p-nitroanile Ki=116.65 μM, Kcat/Km=1469.37 M-1s-1 Fig 13 N-Ac-L-Phe-Arg-p-nitroanilide สีเหลือง N-Ac-L-Phe-Gly-p-nitroanilide สีฟ้า N-Ac-L-Phe-Leu-p-nitroanilide สีเขียว N -Ac-L-Phe-Phe-p-nitroanile สีม่วง

Oral Presentation CRDC 5 22/07/54 11

Fig 14 N-Ac-L-Glu-Phe-Arg-p-nitroanilide Fig 15 การทําโมเลคิวลาร์ ด๊อกกิงระหว่างซับสเตรต N-Ac-L-Glu-Phe-Arg-p-nitroanilide กับ เอนไซม์ปาเปน Ki=22.65 nM

Oral Presentation CRDC 5 22/07/54 12

Conclusion Conclusion

1.N-Ac-L-Phe- Gly -p-nitroanilide Ki=1.53 mM, Kcat/Km=269.77M-1s-1 2.N-Ac-L-Phe-Leu-p-nitroanilideKi=20.23 μM, Kcat/Km=1367.00 M-1s-1 3.N-Ac-L-Phe-Phe-p-nitroanilide Ki=295.86 μM, Kcat/Km= 473.49 M-1s-1

• 4. N -Ac-L-Phe-Arg-p-nitroanile Ki=116.65 μM, Kcat/Km=1469.37 M-1s-1
• 5. บริเวณ Active site ตําแหน่ง S1 subsite ของเอนไซม์ปาเปนมีสมบัติ

Broad specificity

23 23

Thank You

24 24