INSA T oulouse T eam 2013 E. E. calculus Yes we count ! 2 + - - PowerPoint PPT Presentation

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INSA T oulouse T eam 2013 E. E. calculus Yes we count ! 2 + - - PowerPoint PPT Presentation

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Toulouse INSA T oulouse T eam 2013 E. E. calculus Yes we count ! 2 + e l b a i = e l R Simple life form Modular e l b a i l e R Simple life form A d a p t a b l r e t o a i t s l u d o M e

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SLIDE 1

Toulouse ¡

INSA T

  • ulouse

T eam 2013

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SLIDE 2

E.

  • E. calculus

Yes we count !

2 ¡

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SLIDE 3

3 ¡

+ =

Simple life form A d a p t a b l e t

  • i

t s e n v i r

  • n

m e n t R e p l i c a t e R e l i a b l e Solid P

  • w

e r f u l l M

  • d

u l a r R e l i a b l e Modular Simple life form R e p l i c a t e

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SLIDE 4

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Our Project

The E. calculus Project aimed to create a binary full-adder using Boolean logic operators

4 ¡

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SLIDE 5

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Basic elements of a full adder

5 logic gates

2 XOR gates, 2 AND gates, and 1 OR gate

à logic gates are the devices that perform the Boolean logic operations

5 ¡

àExemple of an AND gate:

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SLIDE 6

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Design of a full adder

3 input signals

2 input bits and the previous

stage carry

2 output signals

6 ¡

àOur envisioned design could theoretically perform n-bits counting with a carry.

Basic full adder n-bits full adder

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SLIDE 7

E.

  • E. calculus

Yes we count !

  • E. calculus design

7 ¡

INPUT OUTPUT

S COUT CIN B A

CARRY CARRY LOGIC GATES

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SLIDE 8

E.

  • E. calculus

Yes we count !

How we imagined it?

3 bits full-adder

8 ¡ 1 1 1 1 1

CARRY ¡

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SLIDE 9

E.

  • E. calculus

Yes we count !

  • E. calculus

9 ¡

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SLIDE 10

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Module: Input

10 ¡

3 inputs

  • Red receptor
  • Blue receptor
  • AHL receptor

3 recombinases

  • TP901
  • Bxb1
  • PhiC31

A general inducer Switch to the “calculation” state

  • Design not optimal for the input module
  • Intermediate constructions added to the registry
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SLIDE 11

E.

  • E. calculus

Yes we count ! ¡pigment ¡that ¡can ¡be ¡ measured ¡even ¡with ¡ low ¡expression ¡levels ¡ molecule ¡that ¡could ¡ transmit ¡a ¡message ¡ from ¡one ¡colony ¡to ¡the

Module: Output

11 ¡

2 outputs

  • RFP
  • AHL, the carry

¡pigment ¡that ¡can ¡be ¡ measured ¡even ¡with ¡ low ¡expression ¡levels ¡ molecule ¡that ¡could ¡ transmit ¡a ¡message ¡ from ¡one ¡colony ¡to ¡the

  • RFP

¡

  • AHL, the carry
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SLIDE 12

E.

  • E. calculus

Yes we count !

12 ¡

Numerical model

Module: Carry

Calculation of the AHL dif fusion coef ficient Model allowing the design of the full adder on agar plates Model of the AHL reception Model of the AHL dif fusion

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SLIDE 13

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Module: Logic gates

Recombination-based logic gates with four recombinases

Definitive (one-way only) and binary switch.

13 ¡

Design ¡based ¡on ¡SiuA, ¡P., ¡Yazbek, ¡J., ¡Lu, ¡T.K., ¡2013. ¡Synthe9c ¡circuits ¡integra9ng ¡logic ¡and ¡ memory ¡in ¡living ¡cells. ¡Nature ¡Biotechnology ¡31, ¡448–452 ¡and ¡Bonnet, ¡J.Y., ¡2013. ¡ Amplifying ¡Gene9c ¡Logic ¡Gates. ¡Science ¡340, ¡599–603. ¡ ¡ ¡

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SLIDE 14

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Module: Logic gates

14 ¡

Promoter attB-TP901 attP-TP901 BBa_J61048 attB - Bxb1 attP - Bxb1 BBa_B0015

TP901 Bxb1

attL-TP901 attR-TP901 attL - Bxb1 attR - Bxb1

AND1 ¡ ¡

Ou Output

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SLIDE 15

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Module: Logic gates

15 ¡

attB Bxb1 attP Bxb1 attB TP901 attP TP901

AND1 ¡ XOR1 ¡ AND2 ¡ XOR2 ¡

attB Bxb1 attP Bxb1 attB TP901 attP TP901 attB PhiC31 attP PhiC31 IRL FimE IRR FimE attB PhiC31 attP PhiC31 IRL FimE IRR FimE attB Bxb1 attP Bxb1 attB TP901 attP TP901 attB Bxb1 attP Bxb1 attB TP901 attP TP901 attB PhiC31 attP PhiC31 IRL FimE IRR FimE attB PhiC31 IRL FimE IRR FimE attP PhiC31

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SLIDE 16

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Gate ¡

+Bxb1 ¡

Gate ¡

Bxb1 ¡

XOR1 with Bxb1

In vitro

16 ¡

Module: Logic gates

RFP ¡

RFP ¡ Bxb1 ¡ RFP ¡

FimE ¡

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SLIDE 17

E.

  • E. calculus

Yes we count !

XOR1 with Bxb1

In vivo Sequencing

17 ¡

Module: Logic gates

0 ¡ 0,2 ¡ 0,4 ¡ 0,6 ¡ 0,8 ¡ 1 ¡

Posi1ve ¡control ¡ Nega1ve ¡control ¡ XOR1-­‑Bxb1 ¡

Normalized ¡fluorimetry ¡

RFP ¡ Bxb1 ¡ RFP ¡ RFP ¡

Design of XOR1 validated (in vitro, in vivo and by sequencing)

¡

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SLIDE 18

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Design validated

SAll ¡working ¡on ¡AND2 ¡

Module: Logic gates

18 ¡

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SLIDE 19

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Module: Logic gates

19 ¡

But :

Genetic switch is permanent Low level of recombinase expression can lead

to gate activation

Strong regulation to avoid unwanted recombinations

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SLIDE 20

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Module: Riboregulator

20 ¡

Two regulations: Transcription Translation

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SLIDE 21

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Riboregulators

21 ¡

Gene ¡X ¡

P1 ¡ P2 ¡

iRNA ¡ RBS ¡unlocked ¡ RBS ¡blocked ¡ RBS ¡ ¡

Expression ¡of ¡ Protein ¡X ¡

Only ¡P2 ¡ induced ¡ P1 ¡and ¡P2 ¡ induced ¡

Module: Riboregulator

Callura et al.

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SLIDE 22

E.

  • E. calculus

Yes we count !

  • Riboregulators : characterization

22 ¡

aTc ¡ IPTG ¡ Transcribed ¡RNA ¡ Expected ¡result ¡

  • ­‑ ¡
  • ­‑ ¡

none ¡

White ¡

+ ¡

  • ­‑ ¡

White ¡

  • ­‑ ¡

+ ¡

White ¡or ¡pink ¡

+ ¡ + ¡

Red ¡

mRFP ¡ PtetR ¡ Plac ¡

RBS ¡ ¡

Module: Riboregulator

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SLIDE 23

E.

  • E. calculus

Yes we count ! Plac-­‑mRFP ¡(+ ¡IPTG) ¡ Riboregulator ¡alone ¡ (+IPTG) ¡ Riboregulator-­‑mRFP ¡(+ ¡IPTG) ¡

Plac ¡

AYenuated ¡expression ¡of ¡the ¡RFP ¡ with ¡the ¡riboregulator ¡ Attenuated expression of the RFP with the riboregulator

23 ¡

Module: Riboregulator

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SLIDE 24

E.

  • E. calculus

Yes we count !

0 ¡ 0,1 ¡ 0,2 ¡ 0,3 ¡ 0,4 ¡ 0,5 ¡ 0,6 ¡ 0,7 ¡ 0,8 ¡ 0,9 ¡ 1 ¡

  • ­‑IPTG ¡-­‑aTc ¡

+IPTG ¡-­‑aTc ¡

  • ­‑IPTG ¡+aTc ¡ +IPTG ¡+aTc ¡

Posi1ve ¡ control ¡

Fluorimetry ¡of ¡Riboregulator-­‑mRFP ¡ ¡ in ¡XL1 ¡strain ¡at ¡37°C ¡

Zero ¡ level ¡ Regula1on ¡of ¡transla1on ¡ is ¡ ¡ ¡efficient! ¡

RegulaAon ¡depends ¡

  • n ¡two ¡promoters ¡

Regulation depends

  • n two promoters

24 ¡

RFP ¡ aTc ¡ IPTG ¡

Module: Riboregulator

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SLIDE 25

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Module: riboregulator

25 ¡

7 Biobricks submitted: 4 different riboregulators (iRNA design) with different promoters Design validated a fine regulation on translation

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SLIDE 26

E.

  • E. calculus

Yes we count ! Carry ¡

  • ­‑ ¡Modeling ¡the ¡diffusion ¡

¡-­‑ ¡n-­‑bit ¡adder ¡design ¡validated ¡ Riboregulator ¡ Fine ¡regulaAon ¡of ¡translaAon ¡ 4 ¡riboregulators ¡added ¡to ¡the ¡registry ¡ Input ¡

  • ­‑ ¡13 ¡Biobricks ¡
  • ­‑ ¡construcAons ¡ready ¡for ¡other ¡

projects ¡ Recombinases-based logic gates: Signal: ¡ propagaAon ¡and ¡ amplificaAon ¡

Our modules

26 ¡

Logic gates: design validated and well characterized Detector ¡of ¡ unique ¡event ¡ Complex ¡arAficial ¡ regulaAon ¡ pathways ¡

  • Permanent switch
  • no sensitive to metabolic variation
  • genetic transmission
  • Permanent switch
  • no sensitive to metabolic variation
  • genetic transmission
  • Permanent switch
  • no sensitive to metabolic variation
  • genetic transmission
  • Permanent switch
  • no sensitive to metabolic variation
  • genetic transmission
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SLIDE 27

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Contribution to the community

Generic & Independent modules Available for other iGEM teams and the scientific

community

New Biobricks

27 ¡

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SLIDE 28

T hank you for listening

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SLIDE 29

Any questions?

Our Sponsors

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SLIDE 30

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Carry

30 ¡

PluxR/cI: - when cI: repressed

  • when AHL and no cI: not repressed
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SLIDE 31

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Riboregulator design

31 ¡

Unlocking ¡ sequence ¡ RBS ¡ Unlocking ¡ sequence ¡

iRNA ¡

Gene ¡X ¡

P1 ¡ P2 ¡

RBS ¡ ¡

Callura ¡et ¡al. ¡ SimulaAon ¡done ¡on ¡RNAfold ¡Webserver. ¡

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SLIDE 32

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Binary addition

Basic binary addition rules Examples

A ¡+ ¡B ¡ SUM ¡ Carry ¡ 0 ¡+ ¡0 ¡ 0 ¡ 0 ¡ 1 ¡+ ¡0 ¡ 1 ¡ 0 ¡ 0 ¡+ ¡1 ¡ 1 ¡ 0 ¡ 1 ¡+ ¡1 ¡ 0 ¡ 1 ¡ ¡ ¡ ¡0 ¡0 ¡1 ¡0 ¡ + ¡1 ¡0 ¡1 ¡0 ¡ = ¡1 ¡1 ¡0 ¡0 ¡ ¡ ¡

1 ¡ Carry-out of bit 1, carry-in to bit 2 ¡ ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡0 ¡0 ¡1 ¡0 ¡ + ¡ ¡ ¡ ¡1 ¡1 ¡1 ¡0 ¡ = ¡1 ¡0 ¡1 ¡0 ¡0 ¡ ¡ ¡

1 ¡ ¡ ¡1 ¡ ¡ ¡1 ¡ ¡ Carries ¡ ¡

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SLIDE 33

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Logical gates

Input ¡1 ¡(A) ¡ Input ¡2 ¡(B) ¡ And ¡Results ¡ Xor ¡Results ¡ 0 ¡ 0 ¡ 0 ¡ 0 ¡ 1 ¡ 0 ¡ 0 ¡ 1 ¡ 0 ¡ 1 ¡ 0 ¡ 1 ¡ 1 ¡ 1 ¡ 1 ¡ 0 ¡

33 ¡

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SLIDE 34

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Human Practice

Natural

Adap1ve ¡and ¡ con1nuous ¡ Reliable ¡and ¡ precise ¡ Op1mum? ¡

34 ¡

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SLIDE 35

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Light sensors

35 ¡

Darkness leads to phosphorylation of a specific protein in both cases: then, a specific promoter is activated and the downstream gene is supposed to be

  • expressed. In the presence of light, no downstream gene should be produced.

gene ¡

Specific ¡ promoter ¡

Dark

Kinase ¡

Photo-­‑ receptor ¡

P

Light

Kinase ¡

Photo-­‑ receptor ¡

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SLIDE 36

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Light sensors

36 ¡

Red sensor

  • Cph8: fusion of the PCB photoreceptor

and the EnvZ histidine kinase

  • ho1 and pcyA: required for PCB

biosynthesis

  • pOmpC: promoter regulated by Cph8

Blue sensor

  • YF1:fusion of a LOV photoreceptor and a

histidine kinase

  • YF1-FixJ: fusion protein sensitive to light.
  • pFixK2: promoter regulated by YF1-FixJ
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SLIDE 37

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Why ¡design ¡new ¡logic ¡gates? ¡ Perfect control of the switch Novel Approach Complex tree decision in cells

Universality of recombination based logic gates

Design of riboregulators Modularity and adaptability Varied input and output genes

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SLIDE 38

E.

  • E. calculus

Yes we count !

Strategy of Integration

38 ¡

Logic gates on the strain è Stability Low copy number plasmid