Toulouse ¡ INSA T oulouse T eam 2013
E. E. calculus Yes we count ! 2 ¡
+ e l b a i = e l R Simple life form Modular e l b a i l e R Simple life form A d a p t a b l r e t o a i t s l u d o M e n v i r Solid o n m e n t l l u R e f p r l e i c w a t e o P e t a c l i p e R 3 ¡
E. E. calculus Yes we count ! Our Project � The E. calculus Project aimed to create a binary full-adder using Boolean logic operators 4 ¡
E. E. calculus Basic elements of a full Yes we count ! adder � 5 logic gates � 2 XOR gates, 2 AND gates, and 1 OR gate à Exemple of an AND gate: à logic gates are the devices that perform the Boolean logic operations 5 ¡
E. E. calculus Yes we count ! Design of a full adder � 3 input signals � 2 input bits and the previous stage carry � 2 output signals Basic full adder à Our envisioned design could theoretically perform n-bits counting with a carry . n-bits full adder 6 ¡
E. E. calculus Yes we count ! E. calculus design INPUT LOGIC GATES OUTPUT A B S C IN CARRY C OUT CARRY 7 ¡
E. calculus E. How we imagined it? Yes we count ! � 3 bits full-adder 0 1 1 1 1 0 CARRY ¡ 0 0 1 8 ¡
E. E. calculus E. calculus Yes we count ! 9 ¡
E. E. calculus Module: Input Yes we count ! 3 inputs 3 recombinases A general inducer - Design not optimal for the input module - Red receptor - TP901 Switch to the - Intermediate constructions added to the registry - Bxb1 - Blue receptor “calculation” state - PhiC31 - AHL receptor 10 ¡
E. E. calculus Module: Output Yes we count ! 2 outputs ¡pigment ¡that ¡can ¡be ¡ ¡pigment ¡that ¡can ¡be ¡ measured ¡even ¡with ¡ measured ¡even ¡with ¡ - RFP -RFP low ¡expression ¡levels ¡ low ¡expression ¡levels ¡ ¡ molecule ¡that ¡could ¡ molecule ¡that ¡could ¡ -AHL, the carry transmit ¡a ¡message ¡ transmit ¡a ¡message ¡ - AHL, the carry from ¡one ¡colony ¡to ¡the from ¡one ¡colony ¡to ¡the 11 ¡
E. E. calculus Module: Carry Yes we count ! Calculation of the AHL dif fusion Model of the AHL dif fusion Model of the AHL reception Numerical model coef ficient Model allowing the design of the full adder on agar plates 12 ¡
E. E. calculus Yes we count ! Module: Logic gates � Recombination-based logic gates with four recombinases � De fi nitive (one-way only) and binary switch. Design ¡based ¡on ¡SiuA, ¡P., ¡Yazbek, ¡J., ¡Lu, ¡T.K., ¡2013. ¡ Synthe9c ¡circuits ¡integra9ng ¡logic ¡and ¡ memory ¡in ¡living ¡cells . ¡Nature ¡Biotechnology ¡31, ¡448–452 ¡and ¡Bonnet, ¡J.Y., ¡2013. ¡ 13 ¡ Amplifying ¡Gene9c ¡Logic ¡Gates . ¡Science ¡340, ¡599–603. ¡ ¡ ¡
E. calculus E. Module : Logic gates Yes we count ! AND1 ¡ ¡ BBa_B0015 BBa_J61048 Promoter attB - Bxb1 attP - Bxb1 attL - Bxb1 attR - Bxb1 attL-TP901 attR-TP901 attB-TP901 attP-TP901 Ou Output TP901 Bxb1 14 ¡
E. E. calculus Module: Logic gates Yes we count ! XOR1 ¡ AND1 ¡ attB attB attP attP attB attB attP attP attB attB attB attB attP attP attP attP TP901 TP901 TP901 TP901 Bxb1 Bxb1 Bxb1 Bxb1 TP901 TP901 Bxb1 Bxb1 Bxb1 Bxb1 TP901 TP901 AND2 ¡ XOR2 ¡ attB attB IRL IRL IRR IRR attP attP attB attB IRL IRL IRR IRR attP attP PhiC31 PhiC31 FimE FimE FimE FimE PhiC31 PhiC31 PhiC31 PhiC31 FimE FimE FimE FimE PhiC31 PhiC31 15 ¡
E. E. calculus Module: Logic gates Yes we count ! � XOR1 with Bxb1 � In vitro RFP ¡ RFP ¡ Gate ¡ FimE ¡ Bxb1 ¡ Gat e ¡ Bxb1 ¡ +Bxb1 ¡ RFP ¡ 16 ¡
E. E. calculus Module: Logic gates Yes we count ! � XOR1 with Bxb1 � In vivo Normalized ¡fluorimetry ¡ 1 ¡ 0,8 ¡ 0,6 ¡ 0,4 ¡ 0,2 ¡ 0 ¡ Posi1ve ¡control ¡ Nega1ve ¡control ¡ XOR1-‑Bxb1 ¡ RFP ¡ RFP ¡ RFP ¡ Bxb1 ¡ � Sequencing Design of XOR1 validated ( in vitro , in vivo and by sequencing) 17 ¡ ¡
E. E. calculus Module: Logic gates Yes we count ! SAll ¡working ¡on ¡AND2 ¡ Design validated 18 ¡
E. E. calculus Module: Logic gates Yes we count ! � But : � Genetic switch is permanent � Low level of recombinase expression can lead to gate activation Strong regulation to avoid unwanted recombinations 19 ¡
E. E. calculus Module: Riboregulator Yes we count ! Two regulations: Transcription Translation 20 ¡
E. calculus E. Module: Riboregulator Yes we count ! � Riboregulators RBS ¡ ¡ Gene ¡X ¡ P 1 ¡ P 2 ¡ Only ¡P 2 ¡ P 1 ¡and ¡P 2 ¡ iRNA ¡ induced ¡ induced ¡ RBS ¡blocked ¡ RBS ¡unlocked ¡ Expression ¡of ¡ Protein ¡X ¡ 21 ¡ Callura et al.
E. E. calculus Module: Riboregulator Yes we count ! Riboregulators : characterization � RBS ¡ ¡ mRFP ¡ P tetR ¡ P lac ¡ aTc ¡ IPTG ¡ Transcribed ¡RNA ¡ Expected ¡result ¡ White ¡ -‑ ¡ -‑ ¡ none ¡ + ¡ -‑ ¡ White ¡ -‑ ¡ + ¡ White ¡or ¡pink ¡ + ¡ + ¡ Red ¡ 22 ¡
E. E. calculus Module: Riboregulator Yes we count ! P lac -‑mRFP ¡(+ ¡IPTG) ¡ Riboregulator ¡alone ¡ (+IPTG) ¡ P lac ¡ Attenuated expression of the AYenuated ¡expression ¡of ¡the ¡RFP ¡ RFP with the riboregulator with ¡the ¡riboregulator ¡ Riboregulator-‑mRFP ¡(+ ¡IPTG) ¡ 23 ¡
E. E. calculus Module: Riboregulator Yes we count ! Fluorimetry ¡of ¡Riboregulator-‑mRFP ¡ ¡ in ¡XL1 ¡strain ¡at ¡37°C ¡ aTc ¡ IPTG ¡ 1 ¡ 0,9 ¡ 0,8 ¡ 0,7 ¡ RFP ¡ 0,6 ¡ 0,5 ¡ 0,4 ¡ 0,3 ¡ 0,2 ¡ 0,1 ¡ Regulation depends 0 ¡ RegulaAon ¡depends ¡ -‑IPTG ¡-‑aTc ¡ +IPTG ¡-‑aTc ¡ -‑IPTG ¡+aTc ¡ +IPTG ¡+aTc ¡ Posi1ve ¡ on two promoters on ¡two ¡promoters ¡ control ¡ Zero ¡ Regula1on ¡of ¡transla1on ¡ level ¡ is ¡ ¡ ¡ efficient! ¡ 24 ¡
E. E. calculus Module: Yes we count ! riboregulator Design validated a fi ne regulation on translation 7 Biobricks submitted : 4 di ff erent riboregulators (iRNA design) with di ff erent promoters 25 ¡
E. E. calculus Our modules Yes we count ! Logic gates : design validated and well characterized Input ¡ -‑ ¡13 ¡Biobricks ¡ -‑ ¡construcAons ¡ready ¡for ¡other ¡ Riboregulator ¡ projects ¡ Fine ¡regulaAon ¡of ¡translaAon ¡ Carry ¡ 4 ¡riboregulators ¡added ¡to ¡the ¡registry ¡ -‑ ¡Modeling ¡the ¡diffusion ¡ ¡-‑ ¡n-‑bit ¡adder ¡design ¡validated ¡ Recombinases-based logic gates : Complex ¡arAficial ¡ Signal: ¡ Detector ¡of ¡ - Permanent switch - Permanent switch - Permanent switch - Permanent switch propagaAon ¡and ¡ regulaAon ¡ unique ¡event ¡ -no sensitive to metabolic variation -no sensitive to metabolic variation -no sensitive to metabolic variation -no sensitive to metabolic variation amplificaAon ¡ pathways ¡ -genetic transmission -genetic transmission -genetic transmission -genetic transmission 26 ¡
E. E. calculus Contribution to Yes we count ! the community New Biobricks � Generic & Independent modules � Available for other iGEM teams and the scienti fi c community 27 ¡
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E. E. calculus Carry Yes we count ! PluxR/cI: - when cI: repressed - when AHL and no cI: not repressed 30 ¡
E. E. calculus Riboregulator design Yes we count ! RBS ¡ ¡ Gene ¡X ¡ P 1 ¡ P 2 ¡ iRNA ¡ Unlocking ¡ sequence ¡ RBS ¡ Unlocking ¡ sequence ¡ 31 ¡ Callura ¡et ¡al. ¡ SimulaAon ¡done ¡on ¡ RNAfold ¡Webserver . ¡
E. E. calculus Binary addition Yes we count ! � Basic binary addition rules A ¡+ ¡B ¡ SUM ¡ Carry ¡ 0 ¡+ ¡0 ¡ 0 ¡ 0 ¡ 1 ¡+ ¡0 ¡ 1 ¡ 0 ¡ 0 ¡+ ¡1 ¡ 1 ¡ 0 ¡ 1 ¡+ ¡1 ¡ 0 ¡ 1 ¡ � Examples ¡ ¡ Carry-out of bit 1, Carries carry-in to bit 2 ¡ ¡ ¡ ¡ 1 ¡ ¡ ¡1 ¡ ¡ ¡1 ¡ 1 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡0 ¡0 ¡1 ¡0 ¡ ¡ ¡ ¡0 ¡0 ¡1 ¡0 ¡ + ¡ ¡ ¡ ¡1 ¡1 ¡1 ¡0 ¡ + ¡1 ¡0 ¡1 ¡0 ¡ = ¡1 ¡0 ¡1 ¡0 ¡0 ¡ ¡ = ¡1 ¡1 ¡0 ¡0 ¡ ¡ ¡ ¡
E. E. calculus Logical gates Yes we count ! Input ¡1 ¡(A) ¡ Input ¡2 ¡(B) ¡ And ¡Results ¡ Xor ¡Results ¡ 0 ¡ 0 ¡ 0 ¡ 0 ¡ 1 ¡ 0 ¡ 0 ¡ 1 ¡ 0 ¡ 1 ¡ 0 ¡ 1 ¡ 1 ¡ 1 ¡ 1 ¡ 0 ¡ 33 ¡
E. E. calculus Human Practice Yes we count ! Reliable ¡and ¡ Adap1ve ¡and ¡ precise ¡ con1nuous ¡ Op1mum? ¡ Natural 34 ¡
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