IDENTIFICATION OF FLUOROPHORES IN AQUATIC NATURAL DISSOLVED - - PowerPoint PPT Presentation

3rd Student Workshop on Ecology and Optics of Coastal Zones 10 - 13 July 2017 Museum of the World Ocean, Kaliningrad, Russia 54°44'N 20°29'E

IDENTIFICATION OF FLUOROPHORES IN AQUATIC NATURAL DISSOLVED ORGANIC MATTER Trubetskaya О.Е.*, Trubetskoj О.А. **

* Branch of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Moscow region, Russia **Institute of Basic Biological Problems, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Moscow region, Russia

SRNOM international

standard 1R101N

СSRNOM=40 mg/L Suwannee River, Georgia, USA

SRNOM isolation by reverse osmosis

Scheme of experiment

Fraction В Fraction C+D

SRNOM

Preparative SEC-PAGE fractionation, dialysis and lyophilization of fractions

Analytical reversed-phase high-performance liquid chromatography with multi-wavelength fluorescence detection of retention times and emission spectra of humic-like and protein-like fluorophores

Aromatic amino acids: Tyrosine Tryptophan

Fraction А

3D - excitation/emission matrix fluorescence

analysis of fractions

1step 2step 3step

Trubetskaya O.E., Richard C., Trubetskoj O.A. 2016. Environmental Chemistry Letters 14:495-500

Preparative SEC fractionation in 7M urea and analytical electrophoresis in 10% PAG as testing system

I II III IV V VI VII VIII IX X

A B C+D

_ +

A B C+D

40 80 120 160 0,0 0,2 0,4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A280

Elution volume, ml

I II III IV V VI VII VIII IX X

Трубецкой О.А., Трубецкая О.Е., Ришар К. 2009. Водные ресурсы 36:543-550 Trubetskaya O.E., Richard C., Trubetskoj O.A. 2015. Environmental Science and Pollution Res. 14:495-500 Trubetskaya O.E., Richard C.,Voyard G., Marchenkov V.V.,Trubetskoj O.A. 2016. Desal. Water Treatm. 57:5358-5364

МSА>МSВ>МSC+D>10kDa

А В С+D

Dialysis through 10 kDa cellulose tubes and lyophilization of fractions SEC on Sephadex G-75 column 1.5х100см Electrophoresis in 10% PAG

Fraction А - 4% Fraction B - 10% Fraction C+D - 35%

Organic matter with МS<10kДa – 51%

В’

1.

3D - excitation/emission matrix fluorescence analysis of fractions A, B and C+D МSА>МSВ>МSC+D>10kДa А270=0.05 a.u.

2.

3D- и 2D- fluorescence analysis

• f fractions A, B and C+D and selection of
• ptimal conditions for RP-HPLC

Fraction А

SRNOM

Fraction В Fraction C+D

350 400 450 500 550 600 650 700 20 40 60 80 100 Fluorescence intensity Wavelength, nm SRNOM C+D A B

SRNOM

2D-fluorescence spectra λех=270 нм, А270=0.05 a.u.

200 300 400 500 600 700 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Absorbance Wavelength, nm A B C+D SRNOM

SRNOM

Absorbance spectra С=50mg/L

Analytical reversed-phase high-performance liquid chromatography with multi-wavelength fluorescence detection

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 50 100 150 200 250

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20 40 60 80 100

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

10 20 30

2 3 3a(4.9min) 4 4a (5.8min) 5 6 1a

(1.9min)

1 7

3.

Humic-like fluorophores detection

λex/λem = 270nm/450nm

Protein-like fluorophores detection

λex/λem = 270nm/330nm

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 10 20 30

2 33a 4 4a 5 6 1 1a 7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20 40 60

Retention time (min) Retention time (min) Retention time (min)

Fluorescence intensity

Tyrosine

(1.9min)

Tryptophan

(5.8min)

SRNOM Fraction А Fraction C+D Fraction В

Fluorescence intensity Fluorescence intensity

Fluorescence spectra of chromatographic peaks 1а, 3а, 4а and amino acids tyrosine and tryptophan from the data of multi-wavelength fluorescence detector at λex = 270 nm, λem = 290-580 nm

300 350 400 450 30 60 90 300 350 400 450 30 60 90 120

Fluorescence intensity

Wavelength, nm Wavelength, nm Peak 1а Tyrosine Peak 4а Peak 3а Tryptophan

Retention time : Tyrosine - 1.9 min Tryptophan - 5.8 min Peak 1а - 1.9 min Peak 4а - 5.8 min Peak 3а - 4.9 min

Fluorescence intensity

CONCLUSIONS

• Himic-like fluorescence of SRNOM is caused by the sum of several

fluorophores having different emission maxima - hydrophilic with λ = 435 nm and several hydrophobic ones with λ = 450-465 nm

• About 50% of the protein-like fluorescence of SRNOM is due to the

presence of free amino acids of tyrosine and tryptophan in the fractions of the largest and average molecular size

• The detection of free amino acids in the aquatic NOM is extremely

important for understanding the role of DOM as a natural archive of amino acids and potential source of structural components for protein synthesis as the basis of life.

Sandro Botticelli "The Birth of Venus" 1482-1486

The work has been supported by:

• COBASE, USA
• Russian Foundation for Basic

Research 13-05-00241 and 15-04- 00525

• International project №12 between

CNRS (France) – RAS(Russia)

Спектры флуоресценции хроматографических пиков по данным мультиволнового детектора флуоресценции, настроенного на λвоз = 270нм, λисп = 290-580 нм

Длина волны (нм) Длина волны (нм)

300 350 400 450 50 100 150 200 250

1 2-3 4 5 6

300 350 400 450 20 40 60 80 100

1 2 3 4 6 5

СуРОВ

Фракция C+D

300 350 400 450 5 10 15 20 25

1 3 2 4 5 6-7 1a 3a 4a 1a

300 350 400 450 5 10 15 20 25

1 2-3 4 5 1a 3a 4a 6-7 1a

Фракция В Фракция А

Интенсивность флуоресценции Интенсивность флуоресценции

• 1. Гуминоподобный

гидрофильный флуорофор (пик 1) – λмакс = 435 нм

• 2. Гуминоподобные

гидрофобные флуорофоры (пики 2-7) λмакс = 450-465 нм

• 3. Белковоподобные

флуорофоры (пики 2-7) λмакс = 350 нм

• 4. Свободные

аминокислоты тирозин (пик 1а) с λмакс = 300 нм, время выхода с колонки – 1.9мин триптофан (пик 4а) λмакс = 350 нм, время выхода с колонки – 5.8мин

3D-флуоресцентные диаграммы РОВ трех водных источников различного генезиса и географического положения

Река Сувани Онежское озеро Водопроводное озеро Джорджия, США Карелия, Россия Карелия, Россия

А270=0.05 о.е.

Emission wavelength, nm Emission wavelength, nm Emission wavelength, nm

• Важнейшим свойством и отличительной

чертой класса ГВ от биологических молекул является их устойчивость к разложению микроорганизмами и другими абиотическими факторами

• ГВ проявляют ярко выраженные

поверхностно-активные свойства

• ГВ образуют коллоидные растворы со

средним минимальным диаметром частиц от 90 до 200 Ǻ

Концентрация кислород-содержащих функциональных групп в составе средней ГВ Функциональные группы Мг-экв/грамм СООН 4,5 Фенольные ОН 2,1 Спиртовые ОН 2,8 Хиноидные С=О 2,5 Кетонные С=О 1,9 ОСН3 0,3

• M. Schnitzer, 1991, Soil Science

Гипотетические модели строения гуминовых веществ

Макромолекулярная модель Супрамолекулярная модель

Kleinhempel, 1970 Wershaw, 1986 Piccolo, 1997 Hutta et al., J.Chromatography, 2011

Твердофазный 13C-ЯМР ГК чернозема и фракций A, B и C+D

Trubetskoj O.А., Hatcher P.G., Trubetskaya O.E. 2010, Chemistry and Ecology 26, 315-325

300 250 200 150 100 50 0 ppm C+D B A HAU HA