Greensboro-Aus+n iGEM Team Gene+c code Non-canonical amino - - PowerPoint PPT Presentation

Greensboro-­‑Aus+n ¡iGEM ¡Team ¡

Gene+c ¡code ¡ Non-­‑canonical ¡amino ¡acids ¡ Mussel ¡adhesion ¡proteins ¡ BactoArt ¡ Biosecurity ¡ Open ¡Sequence ¡Ini+a+ve ¡

2 ¡

The ¡gene+c ¡code ¡ ¡

3 ¡

Transla'on ¡

tRNA ¡& ¡ ¡ Synthetase ¡pair ¡

AMP ¡+ ¡PPi ¡

Charged ¡tRNA ¡ Polypep+de ¡ Ribosome ¡& ¡tRNA ¡

What ¡could ¡we ¡do ¡with ¡an ¡ expanded ¡gene+c ¡code? ¡

5 ¡

Can ¡your ¡gene+c ¡code ¡do ¡this? ¡

covalent ¡bonds ¡via ¡ photocrosslinking ¡ extended ¡disulfide ¡bridges ¡ (long ¡distance ¡staples!) ¡ heavy ¡atom ¡for ¡X-­‑ray ¡ crystallography ¡ fluorescent ¡ amino ¡acid ¡

6 ¡

So ¡how ¡exactly ¡do ¡we ¡code ¡for ¡a ¡21st ¡ amino ¡acid? ¡

7 ¡

Redundancy ¡in ¡the ¡gene+c ¡code ¡ ¡

Gene+c ¡code ¡ Non-­‑canonical ¡amino ¡acids ¡ Mussel ¡adhesion ¡proteins ¡ BactoArt ¡ Biosecurity ¡ Open ¡Sequence ¡Ini+a+ve ¡

9 ¡

Methanocaldococcus ¡jannaschii ¡ ¡

10 ¡

Tyrosine ¡ A ¡U ¡C ¡

Deiters ¡A, ¡and ¡Schultz ¡PG. ¡In ¡vivo ¡incorpora+on ¡of ¡an ¡alkyne ¡into ¡proteins ¡in ¡Escherichia ¡coli. ¡Bioorg ¡Med ¡Chem ¡LeZ. ¡2005 ¡Mar ¡1;15(5): 1521-­‑4.Pubmed ¡PMID: ¡15713420. ¡

• M. ¡jannaschii ¡tyrosyl-­‑tRNA ¡synthetase ¡

11 ¡

ncAA ¡

A ¡U ¡C ¡

Non-­‑canonical ¡Transla+on ¡

12 ¡

tRNA ¡& ¡Synthetase ¡pair ¡

AUC ¡

ncAA ¡

AMP ¡+ ¡PPi ¡

Charged ¡tRNA ¡

AUC ¡

ncAA ¡

Ribosome ¡& ¡tRNA ¡

AUC ¡ UAG ¡

ncAA ¡

Polypep+de ¡

ncAA ¡

Tes+ng ¡synthetase ¡incorpora+on ¡with ¡ GFP ¡

13 ¡

GFP ¡Fluorophore ¡with ¡ncAA ¡3-­‑iodotyrosine ¡ Normal ¡GFP ¡Fluorophore ¡

Tes+ng ¡synthetase ¡incorpora+on ¡

14 ¡

Tyrosine ¡

Tes+ng ¡synthetase ¡incorpora+on ¡

15 ¡

Tes+ng ¡synthetase ¡incorpora+on ¡

16 ¡

Tyrosine ¡

Tes+ng ¡synthetase ¡incorpora+on ¡

17 ¡

3-­‑Iodotyrosine ¡

Tes+ng ¡synthetase ¡incorpora+on ¡

18 ¡

3-­‑Iodotyrosine ¡

Bringing ¡ncAA ¡to ¡iGEM ¡

• BBa_K1178000 ¡

– tRNA ¡and ¡synthetase ¡to ¡repurpose ¡UAG ¡codon ¡for ¡ ncAA ¡usage ¡

19 ¡

Muta'ons ¡necessary ¡for: ¡

3-­‑iodotyrosine ¡incorpora+on ¡ H-­‑70 ¡to ¡A ¡ D-­‑158 ¡to ¡T ¡ I-­‑ ¡159 ¡to ¡S ¡

Sakamoto ¡et. ¡al. ¡ ¡

L-­‑DOPA ¡incorpora+on ¡ ¡ Y-­‑32 ¡to ¡L ¡ A-­‑67 ¡to ¡S ¡ H-­‑70 ¡to ¡N ¡ A-­‑167 ¡to ¡Q ¡

Alfonta ¡et. ¡al ¡

Other ¡Possibili+es ¡

20 ¡

p-­‑Acetylphenylalanine ¡ O-­‑methyltyrosine ¡ p-­‑Benzoylphenylalanine ¡

Liu ¡CC, ¡Schultz ¡PG. ¡Adding ¡New ¡Chemistries ¡to ¡the ¡Gene+c ¡Code. ¡Annu ¡Rev ¡Biochem. ¡2010;79:413-­‑44. ¡doi: ¡10.1146/annurev.biochem. 052308.105824. ¡PubMed ¡PMID: ¡20307192. ¡

Gene+c ¡code ¡ Non-­‑canonical ¡amino ¡acids ¡ Mussel ¡adhesion ¡proteins ¡ BactoArt ¡ Biosecurity ¡ Open ¡Sequence ¡Ini+a+ve ¡

21 ¡

Improving ¡an ¡ncAA-­‑dependent ¡phenotype ¡

• 1. ¡Find: ¡
• 2. ¡Test: ¡

(phenotype) ¡ ↑ ¡phenotype ¡

protein ¡X ¡

ncAA ¡ ncAA ¡ ncAA ¡

protein ¡X ¡

ncAA ¡ ncAA ¡ ncAA ¡

Improving ¡an ¡ncAA-­‑dependent ¡phenotype ¡

• strong ¡and ¡durable ¡
• s+ck ¡to ¡variety ¡of ¡surfaces ¡
• works ¡underwater ¡
• non-­‑immunogenic ¡
• environmentally-­‑friendly ¡

The ¡mussel’s ¡glue ¡

• surgical ¡sutures ¡
• underwater ¡adhesives ¡

The ¡mussel’s ¡glue ¡

L-­‑tyrosine ¡ L-­‑DOPA ¡ (non-­‑canonical) ¡

adhesive ¡ proper+es ¡

Probing ¡the ¡limits ¡of ¡adhesiveness ¡

glue ¡ protein ¡

Y ¡ Y ¡ Y ¡

with ¡codon ¡repurposing: ¡ adhesiveness ¡ ¡∝ ¡ ¡L-­‑DOPA ¡content ¡

… ¡

but: ¡indeterminate ¡fate ¡of ¡tyrosines ¡ fine-­‑tuned ¡control ¡& ¡predictability ¡

glue ¡ protein ¡

Y ¡ Y ¡ L-­‑DOPA ¡ MAP01 ¡ MAP02 ¡ MAP17 ¡

Library ¡construc+on ¡

13 ¡gBlocks: ¡

5’ ¡fp1: ¡ ¡ ¡0 ¡– ¡10 ¡Ambers ¡ fp5: ¡ ¡ ¡0 ¡– ¡20 ¡Ambers ¡ 3’ ¡fp1: ¡ ¡ ¡0 ¡– ¡11 ¡Ambers ¡ Challenges: ¡

• highly ¡repe++ve ¡sequences ¡
• G/C ¡content ¡

Mixed ¡variants: ¡ 5’ ¡fp1 ¡ fp5 ¡ 3’ ¡fp1 ¡ # ¡Ambers ¡ 2 ¡ 4 ¡ 2 ¡ 8 ¡ 2 ¡ 7 ¡ 2 ¡ 11 ¡ 5 ¡ 4 ¡ 5 ¡ 14 ¡ 5 ¡ 7 ¡ 5 ¡ 17 ¡ 5 ¡ 10 ¡ 5 ¡ 20 ¡ 5 ¡ 20 ¡ 5 ¡ 30 ¡ 10 ¡ 20 ¡ 9 ¡ 39 ¡ Amber ¡codons ¡in ¡fp5: ¡ 5’ ¡fp1 ¡ fp5 ¡ 3’ ¡fp1 ¡ # ¡Ambers ¡ 0 ¡ 0 ¡ 0 ¡ 0 ¡ 0 ¡ 4 ¡ 0 ¡ 4 ¡ 0 ¡ 7 ¡ 0 ¡ 7 ¡ 0 ¡ 10 ¡ 0 ¡ 10 ¡ 0 ¡ 20 ¡ 0 ¡ 20 ¡ Amber ¡codons ¡in ¡fp1: ¡ 5’ ¡fp1 ¡ fp5 ¡ 3’ ¡fp1 ¡ # ¡Ambers ¡ 2 ¡ 0 ¡ 0 ¡ 2 ¡ 2 ¡ 0 ¡ 5 ¡ 7 ¡ 5 ¡ 0 ¡ 5 ¡ 10 ¡ 5 ¡ 0 ¡ 9 ¡ 14 ¡ 10 ¡ 0 ¡ 9 ¡ 19 ¡

Library ¡construc+on ¡

L-­‑tyrosine ¡ Future ¡direc'on: ¡self-­‑sufficiency ¡ TH ¡ UAG ¡ AUC ¡ ribosome ¡ L-­‑DOPA ¡ ¡( ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡) ¡ L-­‑DOPA-­‑tRNAL-­‑DOPA ¡ L-­‑DOPA ¡RS ¡

tRNAL-­‑DOPA ¡

L-­‑DOPA ¡ ¡( ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡) ¡ L-­‑DOPA-­‑tRNAL-­‑DOPA ¡

glue ¡protein ¡variant ¡ TH ¡ PCD ¡ DHPR ¡ tRNA ¡ L-­‑DOPA ¡RS ¡

• 5 ¡different ¡
• rganisms ¡
• all ¡three ¡domains ¡
• f ¡life! ¡

glue ¡protein ¡variant ¡ TH ¡ PCD ¡ DHPR ¡ tRNA ¡ L-­‑DOPA ¡RS ¡

Gene+c ¡code ¡ Non-­‑canonical ¡amino ¡acids ¡ Mussel ¡adhesion ¡proteins ¡ BactoArt ¡ Biosecurity ¡ Open ¡Sequence ¡Ini+a+ve ¡

32 ¡

Gene+c ¡code ¡ Non-­‑canonical ¡amino ¡acids ¡ Mussel ¡adhesion ¡proteins ¡ BactoArt ¡ Biosecurity ¡ Open ¡Sequence ¡Ini+a+ve ¡

40 ¡

Biosecurity ¡

Biosecurity ¡– ¡Pathogenic ¡Gene ¡Synthesis ¡

42 ¡

• No ¡regula+on ¡requiring ¡

DNA ¡synthesis ¡companies ¡ to ¡screen ¡orders ¡ ¡

• 80% ¡of ¡companies ¡screen ¡

dsDNA ¡orders ¡down ¡to ¡ 200 ¡bp ¡against ¡a ¡select ¡ agent ¡list ¡of ¡pathogenic ¡ sequences ¡

Biosecurity ¡– ¡Pathogenic ¡Gene ¡Synthesis ¡

43 ¡

• No ¡regula+on ¡requiring ¡

DNA ¡synthesis ¡companies ¡ to ¡screen ¡orders ¡ ¡

• 80% ¡of ¡companies ¡screen ¡

dsDNA ¡orders ¡down ¡to ¡ 200 ¡bp ¡against ¡a ¡select ¡ agent ¡list ¡of ¡pathogenic ¡ sequences ¡

• ssDNA? ¡

DNA ¡Synthesis ¡and ¡Select ¡Agents ¡

• From ¡discussions ¡with ¡FBI ¡

agents ¡we’ve ¡learned ¡that ¡

• ligo ¡orders ¡aren’t ¡screened ¡

at ¡all ¡

• Gene ¡synthesis ¡using ¡single-­‑

stranded ¡oligos ¡is ¡doable ¡by ¡ any ¡moderately ¡trained ¡ synthe+c ¡biologist ¡

44 ¡ acg+nc.com ¡

Set ¡6 ¡reading ¡ frames ¡ Chop ¡famed ¡ sequences ¡into ¡ certain ¡lengths ¡ ¡ Query ¡ Nucleo+de ¡ Database ¡ ¡ Use ¡Best ¡Match ¡ to ¡determine ¡ Top ¡Hit ¡ If ¡homologous, ¡ set ¡pathogen ¡ to ¡“YES” ¡ If ¡no ¡homology, ¡ set ¡pathogen ¡ to ¡“NO” ¡

Oligo ¡Screening ¡Program ¡

Read ¡oligo ¡at ¡6 ¡ reading ¡ frames ¡ Chop ¡framed ¡ sequences ¡ into ¡certain ¡ lengths ¡(L) ¡ Run ¡chopped ¡ sequences ¡ through ¡BLAST ¡ Use ¡Best ¡ Match ¡to ¡ determine ¡Top ¡ Hit ¡

45 ¡

FBI ¡Biosecurity ¡Workshop ¡at ¡UT ¡

46 ¡

FBI ¡Biosecurity ¡Workshop ¡at ¡UT ¡

47 ¡

We’d ¡like ¡to ¡thank ¡Agents ¡You, ¡So ¡ and ¡Runkel ¡

Gene+c ¡code ¡ Non-­‑canonical ¡amino ¡acids ¡ Mussel ¡adhesion ¡proteins ¡ BactoArt ¡ Biosecurity ¡ Open ¡Sequence ¡Ini+a+ve ¡

48 ¡

BioBricks ¡

• A ¡standard ¡for ¡submission ¡to ¡the ¡Registry ¡of ¡

Standard ¡Biological ¡Parts ¡

• An ¡archival ¡standard ¡
• An ¡assembly ¡standard ¡

BioBricks ¡

Part ¡

EcoRI ¡ XbaI ¡ SpeI ¡ PstI ¡

BioBricks ¡

Part ¡ Suffix ¡ Prefix ¡ EcoRI ¡ XbaI ¡ SpeI ¡ PstI ¡

• The ¡BioBrick ¡standard ¡is ¡limi+ng ¡
• Difficult ¡to ¡submit ¡long, ¡novel ¡parts ¡

Jus+fica+on ¡

The ¡Probability ¡of ¡Encountering ¡an ¡Illegal ¡Restric+on ¡Site ¡ ¡ for ¡a ¡Given ¡Sequence ¡Length ¡ Average ¡prokaryo+c ¡ gene ¡length ¡

What ¡do ¡other ¡teams ¡think? ¡

PstI ¡ PstI ¡ Greensboro-­‑Aus+n ¡DOPA ¡Synthetase ¡Part ¡

• How ¡many ¡other ¡teams ¡are ¡having ¡to ¡

remove ¡illegal ¡sites? ¡

• Short ¡survey ¡sent ¡out ¡to ¡various ¡iGEM ¡teams ¡
• Designed ¡to ¡understand ¡how ¡this ¡issue ¡

affected: ¡

– Other ¡teams ¡ – The ¡parts ¡registry ¡ ¡

Are ¡teams ¡having ¡to ¡go ¡through ¡extra ¡ work ¡to ¡submit ¡parts? ¡

Did ¡your ¡team ¡use ¡site-­‑directed ¡ mutagenesis ¡techniques ¡to ¡remove ¡illegal ¡ restric+on ¡sites ¡from ¡a ¡part? ¡

Yes ¡ 51% ¡ N=43 ¡

Are ¡there ¡poten+ally ¡useful ¡parts ¡ missing ¡from ¡the ¡registry ¡due ¡to ¡these ¡ restric+ons? ¡

In ¡the ¡past, ¡has ¡your ¡team ¡decided ¡to ¡not ¡submit ¡ a ¡part ¡to ¡the ¡Registry ¡due ¡to ¡the ¡presence ¡of ¡ illegal ¡restric+on ¡sites? ¡

Yes 29% No 71%

We’re ¡missing ¡out ¡

• n ¡all ¡these ¡parts! ¡

N=43 ¡

Our ¡Proposal: ¡RFC[95] ¡

• New ¡submiZed ¡plasmid: ¡pSB1C95 ¡
• Homing ¡endonuclease ¡sites ¡
• Includes ¡the ¡BioBrick ¡prefix ¡and ¡suffix ¡

Homing ¡endonuclease ¡sites ¡ BBF ¡RFC ¡95: ¡A ¡part ¡submission ¡standard ¡to ¡complement ¡ modern ¡DNA ¡assembly ¡ ¡techniques ¡

Our ¡Proposal: ¡RFC[95] ¡

• Homing ¡Endonucleases: ¡Quality ¡Control ¡
• Removes ¡restric+ons ¡
• Higher ¡specificity ¡

Homing ¡endonuclease ¡sites ¡

Our ¡Proposal: ¡RFC[95] ¡

• Decouple ¡archival ¡and ¡assembly ¡
• Backwards ¡compa+ble ¡

Homing ¡endonuclease ¡sites ¡

Our ¡Proposal: ¡RFC[95] ¡

The ¡Probability ¡of ¡Encountering ¡an ¡Illegal ¡Restric+on ¡Site ¡ ¡ for ¡a ¡Given ¡Sequence ¡Length ¡ Average ¡prokaryo+c ¡ gene ¡length ¡

Sponsors ¡

Special ¡Thanks ¡

The ¡Ellington ¡Lab, ¡UT ¡Aus+n ¡ The ¡Keasling ¡Lab, ¡UC ¡Berkeley ¡ University ¡of ¡OZawa ¡iGEM ¡Team ¡

• Dr. ¡Robert ¡Newman, ¡Dr. ¡Randal ¡Hayes, ¡Dr. ¡Jian ¡Han ¡

William ¡So, ¡FBI ¡Biological ¡Countermeasures ¡Unit ¡ Jim ¡Runkel, ¡FBI ¡Regional ¡Office ¡ The ¡Daily ¡Texan ¡ KVR ¡News ¡

“We ¡started ¡our ¡experiments ¡using ¡ restric+on-­‑liga+on ¡but ¡all ¡of ¡these ¡failed. ¡ Next ¡we ¡tried ¡Gibson ¡assembly ¡and ¡were ¡ almost ¡immediately ¡successful.” ¡-­‑Student ¡

Ques+ons/Comments? ¡

“Very ¡few ¡people ¡use ¡RFC ¡10 ¡and ¡thus ¡ requiring ¡submission ¡in ¡that ¡format ¡seems ¡ unreasonable.” ¡-­‑Graduate ¡Advisor ¡ “About ¡+me. ¡And ¡good ¡job!” ¡

• ­‑Faculty ¡Instructor ¡

Quotes ¡shown ¡were ¡gathered ¡from ¡our ¡survey ¡ hZp://+nyurl.com/osi-­‑survey ¡ "If ¡you ¡have ¡problems ¡with ¡cloning ¡or ¡the ¡ presence ¡of ¡'illegal' ¡restric+on ¡sites, ¡stop ¡ complaining ¡and ¡deal ¡with ¡it.” ¡

• ­‑Graduate ¡Advisor ¡

Taking ¡into ¡account ¡the ¡dropping ¡costs ¡of ¡ chemical ¡synthesis ¡of ¡DNA, ¡molecular ¡cloning ¡ will ¡not ¡be ¡used ¡for ¡biotechnological ¡purposes ¡ in ¡a ¡couple ¡of ¡years. ¡Biobrick-­‑based ¡molecular ¡ cloning ¡is ¡obsolete." ¡-­‑Faculty ¡Instructor ¡ "I ¡strongly ¡agree ¡with ¡ this ¡statement. ¡Having ¡ to ¡perform ¡site-­‑directed ¡ mutagenesis ¡in ¡order ¡to ¡ submit ¡parts ¡to ¡the ¡ Registry ¡is ¡a ¡complete ¡ waste ¡of ¡+me" ¡Student ¡