Fluoreszenz-Mikroskopie Stefan W. Hell MPI Biophys. Chemie, - PDF document

Fluoreszenz-Mikroskopie Stefan W. Hell MPI Biophys. Chemie, Göttingen, Germany NP Chemie 2014 mit E. Betzig und W. Moerner Pictures/Movies of the S. W. Hell group: www.nanoscopy.de https://www.youtube.com/watch?time_continue=9&v=YyBGiZZSslY&feature=emb_logo https://www.youtube.com/watch?v=9BzGB1SUPGQ&feature=emb_logo https://www.youtube.com/watch?v=CYSVd2qTfAk (all contributions) Videolink https://youtu.be/FQlnpdkhfAU Folien zur Verfügung gestellt von Stefan W. Hell, MPI Göttingen, von PL ergänzt Stefan W. Hell .. Lebenslauf - CV • Familie Banater Schwaben aus einem Dorf in Rumänien, deutsche Schule • Übersiedlung der Familie nach Deutschland in 1978, Abitur in Ludwigshafen • Physikstudium in Heidelberg, 1981-1987 • Promotion zur Abb. transparenter Mikrostrukturen im konfokalen Mikroskop, 1990 • Freier Erfinder: Lichtmikroskope mit höhere Auflösung, Grundlage für die 4Pi- Mikroskopie • European Molecular Biology Laboratory, Demonstration und Tiefenauflösung der 4Pi- Mikroskopie, 1991 - 1993 • Univ. Turku, Finnland, Prinzip der STED-Mikroskopie (STED: Stimulated Emission Depletion) • Habilitation, Physik, Heidelberg, 1996 • Leiter einer Nachwuchsgruppe am Göttinger MPI für biophysikalische Chemie, Arbeiten zu Theorien von Hell und Wichmann, 2000 • MPI-Direktor, Göttingen, und apl. Professor, Heidelberg, Göttingen, .. Mitglied der Leopoldina Fluoreszenz-Lichtmikroskope können Beugungsbeschränkung ( l /2 ~200 Nanometer) • überwinden • Nobelpreis Chemie 2014 mit Eric Betzig (opt. Nahfeldmikroskopie) und William E. Moerner (einzelne Moleküle mit Licht) Wikipedia 1

Die Qual mit der Auflösung: • optische Mikroskopie ist praktisch • es gibt lange Erfahrung mit optischen Instrumenten • weit verbreitet: das Auge, Experimente sind möglich an Luft, .. • Absorption organischer Materie ist klein im sichtbaren Spektralbereich 500 nm l   x  2 n sin   200 nm l Wavelength Lens E. Abbe (1873), Arch. Mikroskop. Anat. 9, 413. Stefan W. Hell, MPI Göttingen Verschiedene Lösungsmöglichkeiten: Beugung ist eine fundamentale Eigenschaft der EM-Welle • konfokale Mikroskopie – Beleuchtung und Bildgebung geschehen durch beugungsbegrenzte Foki – Rastermethode: Optimierung und Ortsinformation • Immersionsmikroskopie – Flüssigkeit (n>1) zwischen Objekt und Objektiv • 4pi-Mikroskopie – Vergrößerung des Raumwinkels • Fluoreszenzspektrokopie – Farbstoffen werden an selektiven Plätzen gebunden/eingebaut – Farbstoffen werden über Laser gezielt ein/aus geschaltet – Zeit- und Frequenzauflösung: Dynamik und Struktur (Ort) Nähe des Farbstoffs • FRED: Resonanter Fluoreszenz Energie Transfer nach Förster – Energietransfer zwischen Sender- und Empfängermolekül hängt vom Abstand ab – bestimme die Zerfallszeit des Senders -> Abstand – Zeit- und Ortsinformation • Nahfeldoptik – benutzt evaneszente Wellen an der Oberfläche, z.B. durch Totalreflexion – örtliche Einschränkung Stefan W. Hell, MPI Göttingen 2

4Pi- Microscopy: resolution improvement in Z Stefan W. Hell, MPI Göttingen 4Pi- Microscopy: 70 - 140 nm r r r             E 4 Pi r z , , E r z , , E r , z , 1 2 Coherent illumination and/or fluorescence detection S.W. Hell (1990), Europ. Patent OS 0491289. S.W. Hell, et al. (1992), Opt. Commun. 93 , 277. M. Schrader, et al. (1998), Biophys. J. 75 , 1659. H. Gugel, et al. (2004), Biophys. J. 87 , 4146. Stefan W. Hell, MPI Göttingen 3

Z Microtubules, mouse fibroblast Immunofluor, Oregon Green 2 µm 2 µm X Confocal 4Pi S.W. Hell, et al. (1992), Opt. Commun. 93 , 277. M. Schrader, et al. (1998), Biophys. J. 75 , 1659. Stefan W. Hell, MPI Göttingen H. Gugel, et al. (2004), Biophys. J. 87 , 4146. Commercial 4pi-microscope H. Gugel, et al. (2004), Biophys J 87 , 4146. Z- resolution < 90 nm (Live cells /aqueous cond.) Stefan W. Hell, MPI Göttingen 4

STED-Mikroskope Stimulierte Emission und Ausbleichung 1 st physical concept to break the diffraction barrier in far-field fluorescence microscopy • Fluoreszenzfarbstoffe als Marker • Anregung durch Licht bestimmter Wellenlängen • spontane Abstrahlung: Fluoreszenz • stimulierte Emission schalten die Moleküle wieder aus S.W. Hell & J. Wichmann (1994), Opt. Lett. 19 , 780. Stefan W. Hell, MPI Göttingen Dynamik von Farbstoffmolekülen • angeregtes Farbstoffmolekül kann durch FL oder stimulierte Emission in den Grundzustand übergehen • Bestrahlung des angeregten Farbstoffmolekül vergleichbarer Wellenlänge wie Fluoreszenzlichts • Übergang in den Grundzustand durch Aussenden eines Photons • spontane Fluoreszenz ist danach unterdrückt • Prozesse werden durch Farbfilter getrennt x 200 nm y S 1   1 s n fl Fluorescence Stimulated Absorption Emission  p 1 ps S 0 vib Stefan W. Hell, MPI Göttingen S.W. Hell & J. Wichmann (1994), Opt. Lett. 19 , 780. 5

Dynamik von Farbstoffmolekülen STED-Mikroskop: • Verbesserung der konfokalen Mikroskopie (Rastern) • Reduktion des Fluoreszenzbereichs unter den Bereich der Beleuchtung durch gezieltes Ausschalten im Außenbereich des Fokus • zweiter Strahl hat ringförmiges Profil und ist dunkel wo der Anregungsstrahl maximal ist • wenige Photonen reichen zur Stimulation • der nicht ausgeschaltete zentrale Bereich ist sehr viel kleiner • Scannen der Probe Stefan W. Hell, MPI Göttingen STED-Mikroskopie y x z The stronger the STED beam Detector the narrower the fluorescent spot! 1.0 Phase Fluorescence Modulation 50 ps 50-200 ps 0.5 0.0 0 3 6 9 Depletion Excitation I STED [GW/cm 2 ] (STED) Stefan W. Hell, MPI Göttingen S.W. Hell & J. Wichmann (1994), Opt. Lett. 19 , 780. 6

Focal spot ... probed with 1 molecule l STED = 770 nm 1.0 sat  STED I I 20 sat  I I 20 0.5 0.0 0 3 6 9 I STED 48 nm 200nm Confocal 254 nm -250 -150 -50 50 150 250 x [nm] V. Westphal & S.W. Hell (2005), Phys. Rev. Lett. 94 , 143903. Stefan W. Hell, MPI Göttingen Imaging 40 nm fluorescence beads: Confocal STED X 1µm 5 counts/0,3ms 89 10 counts/0,3ms 204 Y Stefan W. Hell, MPI Göttingen 7

Imaging protein distribution on a cell membrane: SNAP 25 STED: Confocal: Synaptosomal-Associated Protein, 25kDa (SNAP-25) is a component of the trans-SNARE complex, proposed to account for the specificity of membrane fusion by forming a tight complex of synaptic vesicle and plasma membranes. Stefan W. Hell, MPI Göttingen Heavy subunit of neurofilaments in neuroblastoma Confocal STED G. Donnert, et al. (2006), PNAS 103 , 11440. Stefan W. Hell, MPI Göttingen 8

Sometimes only resolution makes subdiffraction images ! Confocal STED Pores in a porous membrane (a) (b) marked with a fluorescent dye x x 200nm y y Fluorescence dye marked (c) (d) nanostructures produced by electron beam lithography in a polymer y y 1µm x x V. Westphal, S.W. Hell (2005), Phys. Rev. Lett. 94 , 143903. V. Westphal, J. Seeger, T. Salditt, S. W. Hell (2005) , J. Phys. B 38 , S695. Stefan W. Hell, MPI Göttingen Resolution in STED microscopy • not limited by the wavelength of light! • depends on the level of fluorescence depletion. - possible with visible light and regular lenses! - leading to a modified Abbe’s law: 1.0 l   x   0.5 2 n sin 1 I I sat 0.0 0 3 6 9 I sat I >> I sat S.W. Hell (2003), Nature Biotech . 21 , 1347. S.W. Hell (2004), Phys. Lett. A 326 , 140. V. Westphal & S.W. Hell (2005), Phys. Rev. Lett. 94 , 143903. Stefan W. Hell, MPI Göttingen 9

Sharpest focal spot Validation of square-root resolution law . V. Westphal, S.W. Hell (2005), Phys. Rev. Lett. 94 , 143903. Stefan W. Hell, MPI Göttingen 4Pi- STED Microscopy Axial (z) resolution 30-50 nm and beyond … Stefan W. Hell, MPI Göttingen 10

8 STED-4Pi-Microscopy Monolayer Monolayer confocal STED-4Pi 53 nm M. Dyba, S. W. Hell Fluorescently tagged microtubuli with an axial resolution of 50-70 nm M. Dyba, S. Jakobs, S.W. Hell (2003), Nature Biotechnol. 21 , 1303. Stefan W. Hell, MPI Göttingen RESOLFT Reversible Saturable (Switchable) Linear Fluorescence Transitions is the generalized principle of STED microscopy Stefan W. Hell, MPI Göttingen 11

9 RESOLFT: Reversible Saturable Optical (Fluorescent) Transition S.W. Hell (2003), Nature Biotechnol. 21 , 1347. S.W. Hell, M. Dyba, S. Jakobs (2004), Curr. Opin. Neurobiol. 14 , 599. Stefan W. Hell, MPI Göttingen Folien von Stefan W. Hell, MPI Göttingen Acknowledgements / References: Physics: G. Donnert et al PNAS , 103 (2006) K. Willig, J. Keller, M. Bossi, S.W. Hell New J Phys , 8 (2006) V. Westphal, S.W. Hell Phys Rev Lett, 94 (2005) L. Kastrup, H. Blom, C. Eggeling, S.W. Hell Phys Rev Lett , 94 (2005) M. Hofmann, C. Eggeling, S. Jakobs, S.W. Hell PNAS, 102 (2005) Applications: K. Willig, S. Rizzoli, R. Jahn, S.W. Hell Nature , April 13, (2006) R. Kittel, et al Science , May 19, (2006) Pictures/Movies of the S. W. Hell group: www.nanoscopy.de https://www.youtube.com/watch?time_continue=9&v=YyBGiZZSslY&feature=emb_logo https://www.youtube.com/watch?v=9BzGB1SUPGQ&feature=emb_logo https://www.youtube.com/watch?v=CYSVd2qTfAk (all contributions) Stefan W. Hell, MPI Göttingen 12