a new generation of molecular weight markers Protein Study - PowerPoint PPT Presentation

a ¡new ¡generation ¡of ¡molecular ¡weight ¡markers ¡

Protein ¡Study ¡& ¡Analysis ¡ § Important ¡in ¡biotechnology ¡and ¡ biomedical ¡research ¡ ¡ Agriculture ¡ Health ¡

Biopharmaceutical ¡Research ¡and ¡Development ¡ Studying ¡proteins ¡is ¡essential ¡ ¡ ¡ § Determine ¡Protein ¡candidate ¡ ¡ § Discovery ¡pharmaceutical ¡target ¡ § Drug ¡design ¡and ¡development ¡

Is ¡SDS ¡PAGE ¡Relevant? ¡ $100 ¡ ¡ MILLION ¡ PER ¡YEAR ¡ SDS ¡PAGE ¡ ¡ Used ¡by ¡ ¡ 87.9% ¡of ¡ All ¡Researchers ¡ Yu, ¡Jeff ¡Xiaofeng ¡(2007) ¡

Observations ¡of ¡Silver ¡Stained ¡Gels ¡

Polar ¡Amino ¡Acids ¡Interact ¡With ¡Ag + ¡ § Mechanism ¡has ¡not ¡yet ¡been ¡elucidated ¡ . ¡ H ¡ -­‑ ¡ x ¡ O ¡ .. ¡ O ¡ .. ¡ .. ¡ .. ¡ Formaldehyde ¡ H 2 C ¡ O ¡ H ¡ H 2 C ¡ O ¡ H ¡ .. ¡ .. ¡ .. ¡ H ¡ ¡ ¡ ¡C ¡ ¡ ¡ ¡ ¡H ¡ H ¡ ¡ ¡ ¡C ¡ ¡ ¡ ¡H ¡ NH 2 ¡ O ¡ Ag + ¡ Ag 0 ¡ H ¡ ¡ ¡ ¡N ¡ H ¡ ¡ ¡ ¡N ¡ .. ¡ .. ¡ H ¡ ¡ ¡ ¡N ¡ ¡ ¡ ¡H + ¡ H ¡ ¡ ¡ ¡N ¡ C ¡ .. ¡ H ¡ H ¡ H 2 N ¡ COOH ¡ COOH ¡ COOH ¡ H 2 N ¡ H 2 N ¡ Lysine ¡ COOH ¡ H 2 N ¡ COOH ¡ H 2 N ¡ Kurosaki ¡et ¡al. ¡(1984) ¡

Origin ¡of ¡Colour ¡Formation ¡ ¡ ¡ Nielsen ¡and ¡Brown ¡(1984) ¡ “ ” Chuba ¡and ¡Palchaudhuri ¡(1985) ¡ 8

Relationship ¡Between ¡Amino ¡Acid ¡& ¡Colour ¡ Cysteine ¡ Tyrosine ¡ Threonine ¡

Our ¡Hypothesis ¡ We ¡hypothesize ¡that ¡polar ¡amino ¡acids ¡are ¡ responsible ¡for ¡colour ¡variations ¡of ¡protein ¡bands ¡ after ¡silver ¡staining ¡

Sequence ¡Design ¡ Shine-­‑Dalgarno ¡sequence ¡ Spacer ¡ Start ¡codon ¡ Novel ¡sequence ¡ Histidine ¡tag ¡ Stop ¡codon ¡ Protein ¡purification ¡ 23 ¡specific ¡amino ¡acid ¡sequences ¡ through ¡a ¡Nickel ¡column ¡ ¡ ¡

Current ¡DNA ¡Synthesis ¡Limitations ¡ § Reduce ¡number ¡of ¡consecutive ¡repeats ¡ ¡ § GC ¡content ¡is ¡too ¡high ¡or ¡too ¡low ¡ ¡ § Decrease ¡length ¡of ¡repetitive ¡sequences ¡

Our ¡Solution ¡to ¡Synthesis ¡Limitations ¡ § Intercalation ¡of ¡non-­‑polar ¡ amino ¡acids ¡ § Use ¡of ¡Redundant ¡Codons ¡to ¡ reduce ¡base ¡pair ¡repetitions ¡

Architecture ¡of ¡our ¡BioBrick ¡ Scar ¡ Insert ¡ T7 ¡promoter ¡ iGEM ¡prefix ¡ iGEM ¡suffix ¡ pSB1C3

Oversight ¡of ¡iGEM ¡Requirements ¡ Insert Incomplete suffix Incomplete prefix pSB1C3

Insertion ¡of ¡Flanking ¡Regions ¡Using ¡PCR ¡

Architecture ¡of ¡our ¡BioBrick ¡

Transformation ¡of ¡Expression ¡Host ¡ ¡ ¡ § 302 ¡transformants ¡were ¡ generated ¡ § At ¡least ¡one ¡per ¡sequence ¡

Screening ¡Transformants ¡Through ¡Colony ¡PCR ¡ § 5 ¡colonies ¡contained ¡inserts ¡ § 2 ¡inserts ¡were ¡the ¡correct ¡size ¡ ¡

Expression, ¡Purification ¡& ¡Colour ¡Analysis ¡ 4 ¡ 3 ¡ 1 ¡ 2 ¡ Induction ¡and ¡ Purification ¡with ¡ Silver ¡Stain ¡ ¡ expression ¡ SDS ¡PAGE ¡ Ni-­‑NTA ¡column ¡ ¡

We ¡did ¡it! ¡We ¡Made ¡a ¡Purple ¡Protein ¡ 50 ¡kDa ¡ 37 ¡kDa ¡ 25 ¡kDa ¡ 20 ¡kDa ¡ 19 ¡kDa ¡

Data ¡Interpretation ¡ MW ¡Marker ¡ Pixel ¡Count ¡ ** *** Cys-­‑Thr ¡ Colour ¡Intensity ¡ ** ¡p<0.01, ¡*** ¡p<0.005 ¡

Applications ¡of ¡this ¡Technology ¡ Coloured ¡Molecular ¡ Molecular ¡Weight ¡Markers ¡which ¡allow ¡ Reporter ¡Assays ¡ Triangulation ¡in ¡2D ¡electrophoresis ¡ Weight ¡Markers ¡ The ¡Tech ¡Museum, ¡iGEM ¡2014 ¡ Bio-­‑RAD ¡ ¡

Human ¡ Practices ¡ Compiling ¡teams’ ¡perspectives ¡on ¡their ¡iGEM ¡journey ¡ 25

Acknowledgements ¡