a new generation of molecular weight markers Protein Study - - PowerPoint PPT Presentation

a ¡new ¡generation ¡of ¡molecular ¡weight ¡markers ¡

Protein ¡Study ¡& ¡Analysis ¡

§ Important ¡in ¡biotechnology ¡and ¡ biomedical ¡research ¡ ¡

Agriculture ¡ Health ¡

Biopharmaceutical ¡Research ¡and ¡Development ¡

Studying ¡proteins ¡is ¡essential ¡ ¡ ¡

§ Determine ¡Protein ¡candidate ¡ ¡ § Discovery ¡pharmaceutical ¡target ¡ § Drug ¡design ¡and ¡development ¡

Is ¡SDS ¡PAGE ¡Relevant? ¡

SDS ¡PAGE ¡ Used ¡by ¡ ¡ 87.9% ¡of ¡ All ¡Researchers ¡

Yu, ¡Jeff ¡Xiaofeng ¡(2007) ¡

$100 ¡ ¡

MILLION ¡ PER ¡YEAR ¡ ¡

Observations ¡of ¡Silver ¡Stained ¡Gels ¡

Polar ¡Amino ¡Acids ¡Interact ¡With ¡Ag+ ¡

Kurosaki ¡et ¡al. ¡(1984) ¡ .. ¡ NH2 ¡ COOH ¡ H2N ¡ Lysine ¡ O ¡ C ¡ H ¡ H ¡ Formaldehyde ¡ H ¡ ¡ ¡ ¡N ¡ ¡ ¡ ¡H+ ¡ H ¡ ¡ ¡ ¡C ¡ ¡ ¡ ¡ ¡H ¡ O ¡ . ¡ .. ¡ .. ¡

x ¡

• ­‑ ¡

H2N ¡ COOH ¡ H ¡ ¡ ¡ ¡N ¡ H ¡ ¡ ¡ ¡C ¡ ¡ ¡ ¡H ¡ O ¡ H2N ¡ COOH ¡ H ¡ .. ¡

§ Mechanism ¡has ¡not ¡yet ¡been ¡elucidated ¡

H ¡ ¡ ¡ ¡N ¡ H2C ¡ O ¡ H2N ¡ COOH ¡ H ¡ .. ¡ .. ¡ Ag+ ¡ .. ¡ H ¡ ¡ ¡ ¡N ¡ H2C ¡ O ¡ H2N ¡ COOH ¡ H ¡ .. ¡ .. ¡ Ag0 ¡ .. ¡

8

Origin ¡of ¡Colour ¡Formation ¡ ¡ ¡

Nielsen ¡and ¡Brown ¡(1984) ¡ “ Chuba ¡and ¡Palchaudhuri ¡(1985) ¡ ”

Relationship ¡Between ¡Amino ¡Acid ¡& ¡Colour ¡

Cysteine ¡ Tyrosine ¡ Threonine ¡

We ¡hypothesize ¡that ¡polar ¡amino ¡acids ¡are ¡ responsible ¡for ¡colour ¡variations ¡of ¡protein ¡bands ¡ after ¡silver ¡staining ¡

Our ¡Hypothesis ¡

Sequence ¡Design ¡

23 ¡specific ¡amino ¡acid ¡sequences ¡ ¡

Shine-­‑Dalgarno ¡sequence ¡ Spacer ¡ Start ¡codon ¡ Novel ¡sequence ¡ Histidine ¡tag ¡ Stop ¡codon ¡

Protein ¡purification ¡ through ¡a ¡Nickel ¡column ¡ ¡

Current ¡DNA ¡Synthesis ¡Limitations ¡

§ Reduce ¡number ¡of ¡consecutive ¡repeats ¡

¡

§ GC ¡content ¡is ¡too ¡high ¡or ¡too ¡low ¡

¡

§ Decrease ¡length ¡of ¡repetitive ¡sequences ¡

Our ¡Solution ¡to ¡Synthesis ¡Limitations ¡

§ Use ¡of ¡Redundant ¡Codons ¡to ¡ reduce ¡base ¡pair ¡repetitions ¡ § Intercalation ¡of ¡non-­‑polar ¡ amino ¡acids ¡

Architecture ¡of ¡our ¡BioBrick ¡

iGEM ¡prefix ¡ iGEM ¡suffix ¡ T7 ¡promoter ¡ Scar ¡ Insert ¡ pSB1C3

Oversight ¡of ¡iGEM ¡Requirements ¡

Incomplete suffix Incomplete prefix Insert

pSB1C3

Insertion ¡of ¡Flanking ¡Regions ¡Using ¡PCR ¡

Architecture ¡of ¡our ¡BioBrick ¡

Transformation ¡of ¡Expression ¡Host ¡ ¡

¡ § 302 ¡transformants ¡were ¡ generated ¡ § At ¡least ¡one ¡per ¡sequence ¡

Screening ¡Transformants ¡Through ¡Colony ¡PCR ¡

§ 5 ¡colonies ¡contained ¡inserts ¡ § 2 ¡inserts ¡were ¡the ¡correct ¡size ¡ ¡

Expression, ¡Purification ¡& ¡Colour ¡Analysis ¡

Purification ¡with ¡ Ni-­‑NTA ¡column ¡ ¡ SDS ¡PAGE ¡ Silver ¡Stain ¡ ¡ Induction ¡and ¡ expression ¡

1 ¡ 2 ¡ 3 ¡ 4 ¡

We ¡did ¡it! ¡We ¡Made ¡a ¡Purple ¡Protein ¡

50 ¡kDa ¡ 37 ¡kDa ¡ 25 ¡kDa ¡ 20 ¡kDa ¡ 19 ¡kDa ¡

Data ¡Interpretation ¡

Colour ¡Intensity ¡ Pixel ¡Count ¡ MW ¡Marker ¡ Cys-­‑Thr ¡

** ¡p<0.01, ¡*** ¡p<0.005 ¡ ** ***

Applications ¡of ¡this ¡Technology ¡

Coloured ¡Molecular ¡ Weight ¡Markers ¡ Reporter ¡Assays ¡

The ¡Tech ¡Museum, ¡iGEM ¡2014 ¡

Molecular ¡Weight ¡Markers ¡which ¡allow ¡ Triangulation ¡in ¡2D ¡electrophoresis ¡

Bio-­‑RAD ¡ ¡

25

Human ¡Practices ¡

Compiling ¡teams’ ¡perspectives ¡on ¡their ¡iGEM ¡journey ¡

Acknowledgements ¡