Single-cell RNA sequencing methodologies and ESCG pla:orm - - PowerPoint PPT Presentation

Single-­‑cell ¡RNA ¡sequencing ¡ methodologies ¡and ¡ESCG ¡pla:orm ¡

Karolina ¡Wallenborg ¡ October ¡2, ¡2017 ¡

From ¡Wikipedia ¡

Short ¡history ¡of ¡scRNA-­‑seq ¡

Adapted ¡from: ¡Kolodziejczyk ¡A ¡et ¡al, ¡Molecular ¡Cell, ¡2015 ¡

10XGenomics ¡ BioRad/Illumina ¡ BD ¡Resolve ¡

ApplicaTons ¡for ¡scRNA-­‑sequencing ¡

• Heterogeneity ¡analysis ¡
• Cell ¡type ¡idenTficaTon ¡
• Lineage ¡tracing, ¡cellular ¡states ¡in ¡differenTaTon ¡and ¡

development ¡

• Monoallelic ¡gene ¡expression, ¡splicing ¡paZerns ¡

¡

Zeisel ¡A, ¡et ¡al, ¡Science ¡2015 ¡

Single-­‑cell ¡isolaTon ¡or ¡capture ¡

Adapted ¡from: ¡Kolodziejczyk ¡A ¡et ¡al, ¡Molecular ¡Cell, ¡2015 ¡ MulT-­‑Sample ¡ Nano-­‑ Dispenser ¡ Micro-­‑well ¡chip ¡ Cytoplasmic ¡aspiraTon ¡

Reverse ¡transcripTon ¡and ¡amplificaTon ¡

Adapted ¡from: ¡Kolodziejczyk ¡A ¡et ¡al, ¡Molecular ¡Cell, ¡2015 ¡

• Poly(T) ¡primer ¡
• Single ¡cell ¡contain ¡~10 ¡pg ¡total ¡RNA ¡
• 1-­‑5% ¡is ¡mRNA ¡
• 10-­‑20% ¡of ¡the ¡transcripts ¡get ¡reverse ¡transcribed ¡

Current ¡scRNA-­‑sequencing ¡protocols ¡

Adapted ¡from ¡Poulin ¡JF ¡et ¡al, ¡Nature ¡Neuroscience, ¡2016 ¡

Single-­‑cell ¡RNA-­‑sequencing ¡protocols ¡

• ­‑Which ¡method ¡suits ¡you? ¡
• Full-­‑length ¡

– Whole ¡transcript ¡ informaTon ¡ – Gene ¡expression ¡ quanTficaTon ¡ – Isoform, ¡SNP ¡and ¡ mutaTons ¡

¡

• Tag-­‑based ¡methods ¡(5’ ¡or ¡3’) ¡

– EsTmate ¡of ¡transcript ¡abundance ¡ – Early ¡mulTplexing ¡ – Combined ¡with ¡molecular ¡ counTng ¡ – Retain ¡DNA ¡strand ¡informaTon ¡

¡

ESCG ¡pla:orm ¡

• Started ¡in ¡2015 ¡
• Sten ¡Linnarsson ¡(STRT-­‑seq, ¡STRT/C1), ¡Rickard ¡Sandberg ¡

(Smart-­‑seq2) ¡

• High ¡throughput ¡single-­‑cell ¡RNA-­‑sequencing ¡
• 280,000 ¡single ¡cells ¡sequenced ¡
• 77 ¡projects ¡

¡

0 ¡ 2 ¡ 4 ¡ 6 ¡ 8 ¡ 10 ¡ 12 ¡ Oligodendrocytes ¡ Breast ¡Cancer ¡Cells ¡ Brain ¡cells ¡ Ependymal ¡cells ¡ Cardiomyocytes ¡ Neurons ¡ KeraTnocytes ¡ GBM ¡cells ¡ Neural ¡Crest ¡Cells ¡ Innate ¡Lymphoid ¡Cells ¡ Blastema ¡Cells ¡ ES ¡Cells ¡ Immune ¡Cells ¡ CAFs ¡ Endothelial ¡Cells ¡ Pericytes ¡ SpermaTds ¡ Fibroblasts ¡ Pancreas ¡cells ¡ Mesenchymal ¡Cells ¡ Smooth ¡muscle ¡Cells ¡ CLL ¡tumor ¡Cells ¡ Epithelial ¡Cells ¡ Bone ¡marrow ¡Cells ¡ Kidney ¡Cells ¡ Microglia ¡ Thymic ¡Cells ¡ Macrophages ¡ Liver ¡ Astrocytes ¡ Endothelial ¡Cells ¡ Leukemia ¡Cells ¡ IPS ¡Cells ¡ Cancer ¡Cell ¡line ¡ Tongue ¡Cells ¡

Number ¡of ¡projects ¡per ¡cell ¡type ¡

How ¡do ¡you ¡get ¡started? ¡

User ¡meeTng ¡

– Project ¡discussion ¡

• Feasibility ¡
• Tissue, ¡cells ¡
• Project ¡size ¡
• Time ¡line ¡

– Choice ¡of ¡method ¡

• Data ¡output ¡
• Number ¡of ¡cells ¡to ¡be ¡analyzed ¡
• LocaTon, ¡cell ¡delivery ¡

– BioinformaTcs ¡

• Early ¡contact ¡
• NaTonal ¡BioinformaTcs ¡Infrastructure ¡Sweden ¡(NBIS) ¡

– Data ¡delivery ¡ – User ¡fees ¡

How ¡many ¡cells ¡ must ¡I ¡analyze? ¡ And ¡how ¡deep ¡ must ¡I ¡ sequence ¡? ¡

Single ¡cell ¡submission ¡guidelines ¡

OpTmize ¡your ¡cell ¡isolaTon ¡protocol ¡

– Limit ¡Tme ¡of ¡isolaTon ¡ – Be ¡gentle ¡

Single ¡cell ¡suspension ¡criteria ¡

– High ¡viability ¡(>80%) ¡ – No ¡cell ¡clumps ¡or ¡debris ¡ – Cell ¡strain ¡and ¡wash ¡

FACS ¡facility ¡

– Cell ¡viability ¡stain ¡

Visit ¡us ¡

– Single ¡cell ¡suspension ¡quality ¡control ¡

Smart-­‑seq2 ¡at ¡ESCG ¡

• 384 ¡well ¡plates ¡
• IsolaTon: ¡FACS ¡
• Input: ¡cells/nuclei ¡
• Full-­‑length ¡
• Sequencing: ¡50bp ¡single-­‑read ¡
• ERCC ¡spike-­‑ins ¡

– Two ¡different ¡diluTons ¡

• Flexible ¡delivery ¡

¡

STRT-­‑seq-­‑2i: ¡dual-­‑index ¡5’ ¡single-­‑cell ¡ ¡ RNA-­‑sequencing ¡

Adapted ¡from: ¡Hochgerner ¡H, ¡et ¡al, ¡BioRxiv, ¡2017 ¡

• IsolaTon: ¡FACS/dispensing ¡
• Input: ¡Cells/nuclei ¡
• Scale: ¡9600 ¡cells ¡(~2500 ¡cells) ¡
• Sequencing: ¡5’-­‑tag ¡(50 ¡bp ¡single ¡read) ¡
• Up ¡to ¡8 ¡samples ¡in ¡parallel ¡
• No ¡size ¡limitaTon ¡
• UMI:s ¡

10X ¡Genomics ¡

• ­‑Drop-­‑seq ¡technology ¡
• IsolaTon: ¡Droplets ¡
• Input: ¡Cells/nuclei ¡
• Scale: ¡500-­‑10,000 ¡x ¡8 ¡
• Sequencing: ¡3’-­‑tag ¡

(HiSeq2500/NovaSeq) ¡

• Up ¡to ¡8 ¡samples ¡in ¡parallel ¡
• Validated ¡up ¡to ¡30μm ¡

(channels ¡50μm) ¡

• UMI, ¡cell ¡barcode, ¡sample ¡

barcode ¡

• CellRanger, ¡Loupe, ¡R-­‑package ¡

Comparing ¡our ¡services ¡

Full-­‑length ¡ Quan?ta?ve ¡

Smart-­‑seq2 ¡ STRT-­‑Wafergen ¡ 10xGenomics ¡

Format ¡ Eppendorf ¡ ¡ Twin-­‑tek ¡ Microwell ¡chip ¡ Chromium ¡ microfluidics ¡chip ¡ ¡ Cell ¡number ¡ 384 ¡ 9,600 ¡(~2,500) ¡ 8 ¡x ¡500-­‑10,000 ¡ Input ¡ FACS-­‑sorted ¡cells ¡ Suspension ¡ Suspension ¡ Transcript ¡ coverage ¡ Full-­‑length ¡ 5’ ¡ 3’ ¡ Features ¡

• Flexible ¡delivery ¡
• Isoforms, ¡SNPs, ¡

mutaTons ¡

• Nuclei ¡
• ERCC ¡spike-­‑ins ¡
• LimiTng ¡diluTon/

FACS ¡

• Cell ¡selecTon ¡
• Unbiased ¡
• 8 ¡samples ¡parallel ¡ ¡
• Nuclei ¡
• High ¡throughput ¡
• 8 ¡samples ¡parallel ¡
• Nuclei ¡
• Sample ¡pooling ¡

Data ¡delivery ¡

• Sequencing ¡at ¡NGI, ¡HiSeq2500, ¡NovaSeq ¡
• Analysis ¡pipelines ¡for ¡mouse ¡and ¡human ¡

– In-­‑house: ¡STRT, ¡smart-­‑seq2 ¡ – Cell ¡ranger: ¡10xGenomics ¡

• UPPMAX, ¡BioinformaTcs ¡compute ¡and ¡storage ¡

– Users ¡apply ¡individually ¡for ¡projects ¡ ¡ – Annotated ¡gene ¡expression ¡data, ¡QC-­‑files, ¡Fastq ¡

• BioinformaTcs ¡

– Done ¡by ¡user ¡ – Support ¡from ¡BILS ¡and ¡WABI ¡ – CollaboraTons ¡ ¡

User ¡fees ¡

Smart-­‑seq2 ¡ ¡ 384 ¡well ¡plate ¡ STRT-­‑Wafergen ¡ ¡ 9600 ¡wells ¡chip ¡ (~2,500 ¡cells) ¡ 10XGenomics ¡ ¡ 1 ¡sample ¡ ¡ (~3,000 ¡cells) ¡

• ValidaTon ¡
• Smart-­‑seq2 ¡

library ¡ ¡

• Sequencing ¡ ¡
• (50 ¡bp, ¡single-­‑

read ¡

• ValidaTon ¡
• STRT ¡library ¡(dual ¡

index) ¡

• Sequencing ¡(50 ¡bp ¡

single-­‑read) ¡

• ValidaTon ¡
• Illumina ¡library ¡
• Sequencing ¡

(paired-­‑end, ¡dual ¡ index) ¡ ~40,000 ¡SEK ¡ ~50,000 ¡SEK ¡ ~42,000 ¡SEK ¡

Costs ¡include: ¡Reagents, ¡consumables, ¡instrument ¡depreciaTon, ¡instrument ¡ service, ¡personnel. ¡Overhead ¡is ¡not ¡included. ¡

ESCG ¡StaTsTcs ¡

Smart-­‑seq2, ¡ 95500 ¡ STRT-­‑C1 ¡ (Fluidigm), ¡ 6729 ¡ STRT-­‑seq-­‑2i ¡ (Wafergen), ¡ 21282 ¡ 10X ¡ Genomics, ¡ 158500 ¡ Mouse ¡, ¡37 ¡ Human, ¡33 ¡ Newt, ¡2 ¡ Pig, ¡1 ¡ Monkey, ¡2 ¡ Hydra, ¡1 ¡ Zebrafish, ¡ 1 ¡ KI, ¡Solna ¡ KI, ¡Huddinge ¡ UU ¡ SU ¡ Lund ¡ LICR ¡ InternaTonal ¡

What ¡lays ¡ahead? ¡

• Emerging ¡techniques ¡

– Single ¡nuclei ¡RNA-­‑sequencing ¡ – Single ¡cell ¡ATAC-­‑seq ¡ – Transcriptome ¡+ ¡Epigenome ¡ – Transcriptome ¡+ ¡Proteome ¡ – CRISPR-­‑Cas9 ¡+ ¡Transcriptome ¡ – ‘split-­‑pooling’ ¡scRNA-­‑seq ¡ ¡

• ValidaTon ¡

– Small ¡molecule ¡FISH ¡

• Human ¡Cell ¡Atlas ¡

Modified from: Picelli (2016), RNA Biology, July 21: 1-14

The STRT/C1 method

mRNA RT & template switching

C1-P1-T31

AAAAAAAA TTTTTTTTT AAAAAAAA

rGrGrG

C C C

C1-P1-TSO

cDNA amplifjcation

C1-P1-PCR PvuI site

TTTTTTTTT

UMI

AAAAAAAA GGG CCC TTTTTTTTT

C1-P1-PCR

Tagmentation GGG CCC AAAAAAAA TTTTTTTTT GGG CCC AAAAAAAA TTTTTTTTT

Cell barcode Illumina P2 biotin

Streptavidin bead separation - pooling - PvuI restriction GGG CCC AAAAAAAA TTTTTTTTT Sequencing GGG CCC

Read 2 Read 1

Modified from: Picelli (2016), RNA Biology, July 21: 1-14

The Smart-seq2 method

mRNA RT & template switching

SMARTdT30VN

AAAAAAAA NVTTTTTTTTT AAAAAAAA NVTTTTTTTTT

rGrG+G

C C C

TSO-LNA

cDNA amplifjcation NVTTTTTTTTT GGG CCC AAAAAAAA

ISPCR ISPCR

Tagmentation & library preparation NVTTTTTTTTT GGG CCC AAAAAAAA

i5 index i7 index Illumina P7 Illumina P5

Sequencing

Read 1 Read 2

+G --> LNA-modifjed G