QUESTIONING THE DOGMA IN THE CENTRAL DOGMA PENN STATE - - PowerPoint PPT Presentation

PENN ¡STATE ¡iGEM ¡TEAM ¡

QUESTIONING ¡THE ¡DOGMA ¡ IN ¡THE ¡ CENTRAL ¡DOGMA ¡

Introduction

• Scenarios that the Central Dogma does not

answer

• Answers are needed for rational design

Transcription Initiation Translation Initiation Translation Elongation

Bidirectional Promoters

Transcription Initiation

The Background

• Normal ¡promoter ¡sequences ¡contain ¡two ¡

hexamers ¡

– Bind ¡to ¡σ ¡factor ¡ – Control ¡direc9on ¡of ¡transcrip9on ¡

• Bba_J23102 ¡

– 5’ ¡ ¡GTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTACTGTGCTAGCT ¡ ¡3’ ¡

Hexamer ¡II ¡ +1 ¡

• ­‑1 ¡
• ­‑35 ¡
• ­‑10 ¡

Hexamer ¡I ¡ mRNA ¡

What if…

• the ¡promoter ¡is ¡palindromic? ¡

– which ¡direc9on ¡is ¡transcribed? ¡ ¡

• palindromic ¡promoter: ¡

– TAACTTGACAATTATAAAAAAAAAATATAATTGTCAAATATTCA ¡

Hexamer₂ ¡I ¡ Hexamer₁ ¡II ¡ Hexamer₂ ¡II ¡ Hexamer₁ ¡I ¡

The Design

• 1. ¡
• 2. ¡

The Design

Palindromic ¡Sequences ¡ ¡

• Bba_K933004 ¡

– TAACTTGACAATTATAAAAAAAAAATATAATTGTCAAATATTCA ¡

• Bba_K933005 ¡

– TAACAACTGTATTATAAAAAAAAAATATAATTGTCAAATATTCA ¡

• Bba_K933006 ¡

– ATAACTTGACAATTATAAAAAAAAAAAAGCCGGTGTCAAATATTCA ¡

Normalization of Data

• RFP ¡and ¡GFP ¡are ¡expressed ¡unequally ¡ ¡
• Calculated ¡constant ¡K ¡ ¡to ¡compare ¡fluorescence ¡values ¡

The Results

Control ¡BBa_K933003 ¡ (BBa_J23102) ¡

II ¡ I ¡ ¡I ¡ I ¡ ¡II ¡ ¡II ¡

0 ¡ 2000 ¡ 4000 ¡ 6000 ¡ 8000 ¡ 10000 ¡ 12000 ¡ RFP ¡ GFP*K(RFP/GFP) ¡ Rela)ve ¡Fluoresence ¡ TECAN ¡M1000 ¡: ¡Spectrophotmetry ¡: ¡Bulk ¡fluoresence ¡per ¡OD600 ¡

BBa_K933003 ¡ ¡

0 ¡ 2000 ¡ 4000 ¡ 6000 ¡ 8000 ¡ 10000 ¡ 12000 ¡ 14000 ¡ 16000 ¡ 18000 ¡ 20000 ¡ RFP ¡ GFP*K(RFP/GFP) ¡ Rela)ve ¡Fluoresence ¡ TECAN ¡M1000 ¡: ¡Spectrophotmetry ¡: ¡Bulk ¡fluoresence ¡per ¡OD600 ¡

Bba_K933004 ¡

Direc)onal ¡Value: ¡ 0.969 ¡

¡BBa_K933004 ¡ ¡

Direc)onal ¡Value: ¡ 0.701 ¡

The Results

BBa_K933005 ¡ ¡

¡I ¡ I ¡ ¡II ¡ ¡II ¡ ¡I ¡ I ¡ ¡II ¡ ¡II ¡

0 ¡ 2000 ¡ 4000 ¡ 6000 ¡ 8000 ¡ 10000 ¡ 12000 ¡ 14000 ¡ 16000 ¡ Rela)ve ¡Fluoresence ¡ TECAN ¡M1000 ¡: ¡Spectrophotmetry ¡: ¡Bulk ¡fluoresence ¡per ¡OD600 ¡

Bba_K933005 ¡

0 ¡ 5000 ¡ 10000 ¡ 15000 ¡ 20000 ¡ 25000 ¡ 30000 ¡ RFP ¡ GFP*K(RFP/GFP) ¡ Rela)ve ¡Fluoresence ¡ ¡ TECAN ¡M1000 ¡: ¡Spectrophotmetry ¡: ¡Bulk ¡fluoresence ¡per ¡OD600 ¡

Bba_K933006 ¡

Direc)onal ¡Value: ¡ 0.885 ¡

BBa_K933006 ¡ ¡

Direc)onal ¡Value: ¡ 0.969 ¡

The ¡Results ¡

BBa_J23114 ¡

II ¡ I ¡

0 ¡ 1000 ¡ 2000 ¡ 3000 ¡ 4000 ¡ 5000 ¡ 6000 ¡ 7000 ¡

Direc)onal ¡Value: ¡ 0.820 ¡

RFP ¡ GFP*K(RFP/GFP) ¡ TECANM1000: ¡Spectrophotometry ¡: ¡Bulk ¡fluorescence ¡per ¡OD600 ¡ ¡

Bba_J23114 ¡

Rela9ve ¡fluorescence ¡

The Conclusion

• Promoter ¡sequences ¡can ¡be ¡bidirec9onal ¡
• Placement ¡of ¡hexamer ¡sequences ¡effects ¡ ¡

– direc9onality ¡ – expression ¡rate ¡

• Watch ¡out ¡for… ¡promoters ¡with ¡palindromes! ¡

Mul9ple ¡Start ¡Codons ¡

Transla9on ¡Ini9a9on ¡

What ¡if… ¡

• Two ¡start ¡codons ¡exist ¡on ¡a ¡single ¡mRNA ¡strand ¡
• Which ¡is ¡chosen ¡for ¡ini9a9on? ¡

RBS ¡

ATG ¡ ATG ¡ ATG ¡

NN ¡ NNNN ¡

? ¡ ? ¡ ? ¡

The Design

• Designed ¡with ¡low-­‑ini9a9ng ¡RBS ¡

sequence ¡

• Removal ¡of ¡all ¡interim ¡stop ¡codons ¡

within ¡both ¡frames ¡of ¡reference ¡

ATG ¡ ATG ¡

[(n*3N)+1] ¡ weak ¡RBS ¡ RFP ¡ sfGFP ¡

N ¡

The Results

• Construct ¡for ¡start ¡codons ¡within ¡7 ¡nucleo9des ¡ ¡
• Calculated ¡approximate ¡rela9ve ¡fluorescence ¡using ¡K ¡

constant ¡from ¡promoter ¡data ¡

0 ¡ 4000 ¡ 8000 ¡ 12000 ¡

Rela9ve ¡fluorescence ¡ Bulk ¡fluorescence ¡per ¡OD600 ¡

Fluorescence ¡of ¡sfGFP ¡and ¡RFP ¡by ¡ ini9ated ¡by ¡start ¡codons ¡

The Conclusion

• Ribosome ¡overwhelmingly ¡bound ¡to ¡sfGFP-­‑

ini9a9ng ¡start ¡codon ¡

• Tes9ng ¡with ¡varying ¡RBS ¡transla9on ¡ini9a9on ¡

rates ¡and ¡lengths ¡between ¡codons ¡

• Watch ¡out ¡for…mul)ple ¡start ¡codons! ¡

Codon ¡Op9miza9on ¡

Transla9on ¡Elonga9on ¡

The Background

• Codon: ¡3 ¡nucleo9des ¡that ¡

code ¡for ¡an ¡amino ¡acid ¡

• Which ¡codon ¡sequence ¡is ¡

the ¡best ¡for ¡each ¡amino ¡ acid? ¡

Threonine ¡ ACT ¡ ACC ¡ ACA ¡ ACG ¡ Alanine ¡ GCT ¡ GCC ¡ GCA ¡ GCG ¡ Proline ¡ CCT ¡ CCC ¡ CCA ¡ CCG ¡

What ¡if… ¡

• Rare ¡codons ¡are ¡translated? ¡

– Ribosomes ¡read ¡rare ¡sequence ¡

• Charged ¡tRNA ¡not ¡as ¡available ¡with ¡matching ¡

codon ¡

– Transla9on ¡will ¡be ¡inhibited ¡ ¡ – mRNA ¡degrada9on ¡may ¡result ¡

• GFP: ¡reference ¡constant ¡
• RFP ¡will ¡vary: ¡amount ¡expressed ¡indicates ¡codon ¡op9miza9on ¡

The Design

GFP ¡ mCherry ¡

AHL ¡leader ¡ sequence ¡ 6 ¡codon ¡repeat ¡sequence ¡ RBS ¡ RBS ¡

The Results

Compared ¡with ¡ previous ¡data* ¡

• Using ¡9 ¡repeats-­‑

similar ¡results ¡

• GFP ¡differences ¡

0 ¡ 10 ¡ 20 ¡ 30 ¡ 40 ¡ 50 ¡ 60 ¡ 70 ¡ 80 ¡ ACT ¡ ACC ¡ ACA ¡ ACG ¡

Threonine ¡6 ¡repeat-­‑GFP ¡and ¡mCherry ¡ Expression ¡

Threonine ¡9 ¡Repeat ¡

*Dr. ¡Mike ¡Speer: ¡currently ¡at ¡Cargill ¡

The Conclusion

• Based ¡on ¡previous ¡results ¡and ¡our ¡6 ¡repeat ¡

results ¡for ¡Threonine ¡ ¡

– ACG ¡is ¡op9mal ¡codon ¡for ¡DH10B ¡E. ¡coli ¡during ¡ exponen9al ¡growth ¡

• Watch ¡Out ¡For…rare ¡codons! ¡

*Welch, ¡Mark, ¡Sridhar ¡Govindarajan, ¡Jon ¡Ness, ¡et ¡al. ¡"Design ¡Parameters ¡to ¡Control ¡Synthe9c ¡Gene ¡Expression ¡in ¡Escherichia ¡coli." ¡PLoS ¡ONE. ¡4.9 ¡(2009): ¡ 1-­‑10. ¡Print. ¡

Educational Outreach

• Presented ¡at ¡local ¡high ¡school ¡
• Molecular ¡Biology ¡Anima9on ¡
• Prezi ¡Presenta9ons ¡
• Americas ¡East ¡Jamboree ¡high ¡

school ¡presenta9on ¡

Ques9oning ¡the ¡Dogma ¡ in ¡the ¡Central ¡Dogma ¡

• Watch ¡out ¡for ¡Palindromic ¡Promoters ¡

– They ¡transcribe ¡in ¡both ¡direc9ons! ¡

• Watch ¡out ¡for ¡Mul)ple ¡Start ¡Codons ¡

– They ¡may ¡translate ¡the ¡wrong ¡protein! ¡

• Watch ¡out ¡for ¡Rare ¡Codons ¡in ¡Coding ¡Sequences ¡

– They ¡will ¡slow ¡down ¡transla9on! ¡

Asribu9ons ¡

• Dr. ¡Tom ¡Richard ¡lab ¡at ¡Penn ¡State ¡

– Mike ¡Speer ¡

• Dr. ¡Howard ¡Salis ¡lab ¡at ¡Penn ¡State ¡

– RBS ¡calculator ¡sotware ¡

Our ¡Team ¡