L'importanza di un'attenta valutazione dei biomarcatori - - PowerPoint PPT Presentation

L'importanza ¡di ¡un'attenta ¡valutazione ¡dei ¡biomarcatori ¡ circolanti: ¡un ¡metodo ¡validato ¡per ¡la ¡quanti6icazione ¡ assoluta ¡di ¡microRNA ¡in ¡siero ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ The ¡importance ¡of ¡a ¡careful ¡evaluation ¡of ¡circulating ¡ biomarkers: ¡a ¡validated ¡method ¡for ¡the ¡absolute ¡ quanti6ication ¡of ¡microRNAs ¡in ¡serum ¡

¡ ¡ ¡ ¡

Valentina ¡Spedaletti ¡PhD ¡

¡ ¡ ¡ ¡

Biomarker: ¡ ¡

A ¡characteristic ¡that ¡is ¡measured ¡and ¡evaluated ¡as ¡an ¡indicator ¡of ¡normal ¡biological ¡ processes, ¡pathogenic ¡processes, ¡or ¡pharmacological ¡responses ¡to ¡a ¡therapeutic ¡

• intervention. ¡ ¡

Molecular ¡Biomarkers: ¡

ü ¡DNA ¡biomarkers: ¡Single ¡nucleotide ¡polymorphisms ¡(SNPs), ¡short ¡tandem ¡ repeats ¡(STRs), ¡deletions, ¡insertions, ¡or ¡other ¡variation ¡at ¡DNA ¡sequence ¡level ¡ ü RNA ¡biomarkers: ¡

• ­‑ ¡mRNA ¡levels ¡
• ­‑ ¡miRNA ¡levels ¡

ü Protein ¡biomarkers: ¡a ¡protein ¡status ¡evaluation ¡

Molecular ¡Biomarkers ¡

¡ ¡ ¡ ¡

¡

ü Predictive ¡biomarkers ¡

Give ¡information ¡about ¡the ¡effect ¡of ¡a ¡therapeutic ¡intervention. ¡ ¡

Example: ¡High ¡cellular ¡expression ¡of ¡ER ¡predicts ¡beneKit ¡from ¡tamoxifen-­‑based ¡ ¡ chemotherapy ¡

¡

ü Prognostic ¡biomarkers ¡

¡ ¡ Provide ¡information ¡about ¡the ¡patients ¡overall ¡outcome, ¡regardless ¡ ¡of ¡therapy. ¡Example: ¡K-­‑ras ¡mutation ¡is ¡associated ¡with ¡poor ¡prognosis ¡in ¡NSCLC ¡patients ¡

¡

ü Pharmacodynamic ¡biomarkers ¡

Associated ¡with ¡drug ¡effect. ¡Example: ¡skin ¡rash ¡with ¡EGFR ¡Inhibitor ¡

Types ¡of ¡Biomarkers ¡

¡ ¡ ¡ ¡ Small ¡noncoding ¡RNAs ¡that ¡regulate ¡gene ¡expression ¡ Evolutionary ¡conserved ¡ One ¡miRNA ¡has ¡multiple ¡targets ¡

microRNAs: ¡a ¡new ¡class ¡of ¡biomarkers ¡ ¡

mRNA One miRNA mRNA mRNA mRNA mRNA

…

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡

ü Small ¡(17-­‑25nt), ¡non ¡coding, ¡RNA ¡molecules ¡with ¡ epigenetic ¡function ¡ ü Generated ¡from ¡endogenous ¡hairpin-­‑shaped ¡ transcripts ¡encoded ¡in ¡the ¡genomes ¡ ¡ ü More ¡than ¡500 ¡microRNAs ¡encoded ¡in ¡human ¡ genome ¡ ü It ¡has ¡been ¡estimated ¡that ¡more ¡than ¡30% ¡of ¡protein-­‑ coding ¡genes ¡can ¡be ¡regulated ¡by ¡microRNAs ¡ ü Regulate ¡fundamental ¡cellular ¡processes ¡ ¡

microRNAs ¡characteristics ¡

¡ ¡ ¡ ¡

ü Transcribed ¡by ¡RNA ¡Polymerase ¡II ¡as ¡a ¡ long ¡primary ¡transcript ¡(pri-­‑miRNAs). ¡ ü In ¡the ¡nucleus, ¡pri-­‑miRNAs ¡are ¡processed ¡ by ¡RNAse ¡III-­‑like ¡enzyme ¡Drosha. ¡ ¡ ü Pre-­‑miRNAs ¡are ¡then ¡exported ¡to ¡the ¡ cytosol ¡by ¡Exportin ¡5. ¡ ü In ¡the ¡cytosol, ¡RNAse ¡III-­‑like ¡Dicer ¡ processes ¡these ¡precursors. ¡ ü Mature ¡miRNAs ¡are ¡incorporated ¡in ¡RISC. ¡ ¡ ü miRNAs ¡with ¡high ¡homology ¡to ¡the ¡target ¡ mRNA ¡lead ¡to ¡mRNA ¡cleavage. ¡ ü miRNAs ¡with ¡imperfect ¡base ¡pairing ¡to ¡the ¡ target ¡mRNA ¡lead ¡to ¡translational ¡

• repression. ¡

microRNAs ¡biogenesis ¡

¡ ¡ ¡ ¡

microRNAs ¡effects ¡

miRNAs ¡with ¡high ¡ homology ¡to ¡the ¡target ¡ mRNA ¡lead ¡to ¡mRNA ¡ cleavage ¡ miRNAs ¡with ¡imperfect ¡ base ¡pairing ¡to ¡the ¡target ¡ mRNA ¡lead ¡to ¡translational ¡ repression ¡ Cellular ¡Proliferation ¡ Apoptosis ¡ Cellular ¡Differentiation ¡ Cellular ¡migration ¡

¡ ¡ ¡ ¡

ü High ¡stability ¡and ¡speci6icity ¡ ¡in ¡biological ¡6luids ¡ ü Detectable ¡in ¡samples ¡without ¡invasive ¡ collection ¡procedures ¡ ü Indicators ¡with ¡optimal ¡levels ¡of ¡clinical ¡

• sensitivity. ¡The ¡expression ¡pro6iles ¡of ¡circulating ¡

miRNAs ¡, ¡in ¡fact ¡, ¡have ¡proved ¡to ¡be ¡ pathognomonic ¡showing ¡a ¡high ¡correlation ¡with ¡ the ¡disease ¡ ü Expression ¡levels ¡are ¡proportional ¡to ¡the ¡ severity ¡of ¡the ¡disease ¡ ü Valid ¡biomarkers ¡for ¡translational ¡studies ¡

Circulating ¡microRNAs ¡as ¡Biomarkers ¡

¡ ¡ ¡ ¡

microRNAs ¡in ¡Research ¡and ¡Clinical ¡Trials ¡

Growing number of miRNA-based clinical trials (https://clinicaltrials.gov/) >2000 peer-reviewed publications on miRNA biomarkers (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)

0 ¡ 3 ¡ 5 ¡ 9 ¡ 10 ¡ 14 ¡ 19 ¡ 40 ¡ 51 ¡ 0 ¡ 10 ¡ 20 ¡ 30 ¡ 40 ¡ 50 ¡ 60 ¡

2006 ¡ 2007 ¡ 2008 ¡ 2009 ¡ 2010 ¡ 2011 ¡ 2012 ¡ 2013 ¡ 2014 ¡ ¡“clinical ¡trials ¡including ¡miRNA” ¡

¡ ¡ ¡ ¡

microRNAs ¡as ¡biomarkers ¡in ¡Clinical ¡Trials ¡

Trends in Molecular Medicine August 2014, Vol. 20, No. 8

¡ ¡ ¡ ¡

The ¡Role ¡of ¡microRNA-­‑29b ¡in ¡the ¡Oral ¡ Squamous ¡Cell ¡Carcinoma ¡ (NCT02009852) ¡ REmodelling ¡in ¡Diabetic ¡CardiOmapathy: ¡ Gender ¡Response ¡to ¡PDE5i ¡InhibiTOrs ¡ (NCT01803828) ¡ ü Observational ¡Study ¡ ü Outcome: ¡microRNA-­‑29b ¡ [Time ¡Frame: ¡3 ¡years] ¡ ü Samples: ¡Tissue, ¡serum, ¡saliva ¡ ü Estimated ¡Enrollment: ¡100 ¡ ¡ Description: ¡ ¡ To ¡6ind ¡out ¡if ¡there ¡is ¡prognostic ¡value ¡of ¡ microRNA-­‑29b ¡in ¡oral ¡cancer ¡and ¡provide ¡ some ¡reference ¡for ¡future ¡treatment ¡ ü Phase ¡4 ¡– ¡Drug: ¡Tadala6il ¡vs ¡Placebo ¡ ü Outcome: ¡Change ¡in ¡Circulating ¡ microRNA ¡levels ¡at ¡0, ¡ ¡3 ¡and ¡6 ¡months ¡ ü Samples: ¡Plasma ¡ ü Estimated ¡Enrollment: ¡164 ¡ ¡ Description: ¡ ¡ Evaluation ¡of ¡miRNAs ¡(miR208, ¡499, ¡1, ¡ 133, ¡29, ¡223, ¡222) ¡before ¡and ¡after ¡ treatment ¡and ¡gender ¡differences ¡

microRNAs ¡as ¡biomarkers ¡in ¡Clinical ¡Trials ¡

¡ ¡ ¡ ¡

microRNAs ¡pro?iling ¡methods ¡

HT

¡ ¡ ¡ ¡

miRNA ¡analysis: ¡qPCR ¡

qPCR ¡(quantitative ¡real-­‑time ¡Polymerase ¡Chain ¡Reaction) ¡is ¡a ¡PCR ¡reaction ¡to ¡be ¡ visualized ¡“in ¡real ¡time” ¡as ¡the ¡reaction ¡progresses. ¡ It ¡is ¡a ¡6luorescence ¡based ¡method: ¡emission ¡of ¡6luorescence ¡is ¡directly ¡correlated ¡to ¡the ¡ amount ¡of ¡ampli6ied ¡DNA ¡

The ¡point ¡of ¡the ¡ampli6ication ¡reaction ¡at ¡which ¡the ¡ 6luorescence ¡rises ¡signi6icantly ¡above ¡the ¡background ¡ is ¡known ¡as ¡threshold ¡cycle ¡(CT ¡or ¡Cq ¡) ¡and ¡is ¡ correlated ¡to ¡the ¡starting ¡quantity ¡of ¡each ¡sample. ¡

qPCR ¡Advantages:

ü The ¡most ¡sensitive ¡procedure ¡for ¡DNA/

RNA ¡detection ¡and ¡quanti6ication ¡ ü It ¡is ¡extremely ¡accurate ¡and ¡speci6ic ¡ ü It ¡allows ¡to ¡measure ¡minute ¡amounts ¡of ¡ target ¡sample ¡ ü It ¡has ¡a ¡high ¡range ¡of ¡quanti6ication: ¡at ¡ least ¡7 ¡log ¡ ü It ¡shows ¡low ¡contamination ¡risks ¡

¡ ¡

¡ ¡ ¡ ¡

qPCR: ¡SYBR-­‑Green ¡and ¡Taqman ¡Probes ¡

SYBR-­‑Green ¡ Taqman ¡probes ¡

SYBR ¡Green ¡dye ¡is ¡a ¡DNA ¡intercalator ¡and ¡binds ¡ the ¡minor ¡groove ¡of ¡double-­‑stranded ¡DNA. ¡ ¡ ¡ When ¡SYBR ¡Green ¡dye ¡binds ¡to ¡double-­‑stranded ¡ DNA, ¡the ¡intensity ¡of ¡the ¡6luorescence ¡increases. ¡ ¡ The ¡TaqMan ¡probes ¡contain ¡a ¡6luorescent ¡reporter ¡dye ¡at ¡ the ¡5′end ¡of ¡the ¡probe ¡and ¡a ¡quencher ¡dye ¡at ¡the ¡3′end ¡of ¡ the ¡probe. ¡ ¡ ¡ Probe ¡cleavage ¡during ¡the ¡PCR ¡reaction ¡spatially ¡ separates ¡the ¡reporter ¡dye ¡from ¡the ¡quencher ¡dye, ¡ thereby ¡allowing ¡detection ¡of ¡the ¡reporter ¡dye ¡

• 6luorescence. ¡

Non-specific product Non-specific product

¡ ¡

¡ ¡ ¡ ¡

qPCR: ¡Melting ¡Curve ¡Analysis ¡

ü The ¡melting ¡ ¡temperature ¡(Tm) ¡of ¡a ¡duplex ¡depends ¡on ¡its ¡ length, ¡GC ¡content ¡and ¡their ¡complementarity, ¡so ¡it ¡is ¡speci6ic ¡ for ¡a ¡given ¡product. ¡ ü The ¡melting ¡curve ¡analysis ¡consists ¡in ¡a ¡gradual ¡increment ¡of ¡ sample ¡temperature ¡(65°C ¡-­‑95°C) ¡at ¡the ¡end ¡of ¡the ¡

• ampli6ication. ¡

ü In ¡a ¡SYBR-­‑Green ¡based ¡qPCR ¡assay ¡the ¡melting ¡curve ¡analysis ¡

is ¡ ¡fundamental ¡for ¡monitoring ¡target ¡speci6icity ¡

¡ ¡ ¡ ¡

qPCR: ¡LNA ¡primer ¡ ¡ LNA ¡primer ¡advantages: ¡

ü Unprecedented ¡ thermal ¡ stability ¡ when ¡ hybridized ¡ to ¡ a ¡ complementary ¡ DNA ¡ or ¡ RNA ¡ strand ¡ ü High ¡speci6icity: ¡higher ¡melting ¡temperature ¡ (Tm) ¡of ¡the ¡duplex ¡ ü Optimal ¡ for ¡ short ¡ targets: ¡ shorter ¡ than ¡ traditional ¡DNA ¡or ¡RNA ¡oligonucleotides ¡ ü Flexibility: ¡ it ¡ is ¡ possible ¡ to ¡ optimize ¡ the ¡ sensitivity ¡ and ¡ speciKicity ¡ by ¡ varying ¡ the ¡ LNA™ ¡content ¡of ¡the ¡oligonucleotide ¡

Locked ¡nucleic ¡acids ¡(LNA™) ¡are ¡a ¡class ¡of ¡high-­‑af6inity ¡RNA ¡analogs ¡in ¡which ¡the ¡ribose ¡ring ¡is ¡“locked” ¡in ¡the ¡ideal ¡ conformation ¡for ¡Watson-­‑Crick ¡binding ¡

¡ ¡ ¡ ¡

qPCR: ¡Data ¡analysis ¡

During ¡the ¡exponential ¡phase, ¡there ¡is ¡a ¡DIRECT ¡relationship ¡between ¡the ¡starting ¡amount ¡of ¡DNA ¡and ¡ the ¡Cq ¡value ¡(Ct). ¡ ¡ The ¡absolute ¡quanti6ication ¡is ¡obtained ¡plotting ¡the ¡Cq ¡value ¡(Ct) ¡of ¡each ¡sample ¡versus ¡the ¡log ¡of ¡SQ ¡

• btained ¡from ¡a ¡standard ¡curve ¡constructed ¡by ¡serial ¡dilutions ¡of ¡a ¡known ¡amount ¡of ¡the ¡target ¡

¡

¡ ¡ ¡ ¡

microRNAs ¡analysis: ¡lack ¡of ¡a ¡standard ¡qPCR ¡method ¡

ü Scienti6ic ¡publications ¡show ¡heterogeneity ¡in ¡the ¡methods ¡used ¡(different ¡ types ¡of ¡standard ¡curves ¡and ¡different ¡normalization ¡of ¡the ¡data) ¡ ¡ ü No ¡regulatory ¡guideline ¡is ¡available ¡for ¡validation ¡of ¡qPCR ¡methods ¡

VALIDATION ¡OF ¡A ¡NEW ¡METHOD ¡ ¡FOR ¡CLINICAL ¡APPLICATIONS!!! ¡

Pre-­‑Validation ¡

¡ ¡ ¡ ¡

Validation ¡Process ¡ Research ¡and ¡ Development ¡ Validation ¡ Academia ¡ Industry ¡ CRO ¡ Industry ¡ CRO ¡ Industry ¡

¡ ¡ ¡ ¡

CRO ¡as ¡the ¡ideal ¡partner ¡in ¡validation ¡Process ¡

Reasons ¡for ¡early ¡involvement ¡of ¡a ¡CRO ¡in ¡the ¡pre-­‑validation ¡and ¡ validation ¡phases: ¡ ¡

ü Properly ¡trained ¡personnel ¡ ¡ ü Habit ¡to ¡conduct ¡a ¡signi6icant ¡number ¡of ¡GLP-­‑compliant ¡studies ¡in ¡a ¡timely ¡ manner ¡ ü Habit ¡to ¡assess ¡test ¡reproducibility ¡ ¡ ü Scienti6ic ¡skills ¡for ¡rapid ¡interpretation ¡of ¡results ¡of ¡the ¡new ¡method ¡ Understanding ¡of ¡the ¡needs ¡of ¡industry ¡and ¡regulatory ¡framework ¡

¡ ¡ ¡ ¡

Ylichron ¡Srl ¡: ¡Licensing ¡of ¡a ¡patent ¡for ¡miRNA ¡as ¡Biomarkers ¡

¡miRNA ¡biomarkers ¡for ¡ ¡ Duchenne ¡Muscular ¡Distrophy ¡ ¡ (EP ¡2258963 ¡A1 ¡-­‑ ¡University ¡La ¡Sapienza) ¡

¡ ¡ ¡ ¡

Ylichron ¡Srl ¡: ¡Licensing ¡of ¡a ¡patent ¡for ¡miRNA ¡as ¡Biomarkers ¡

mdx ¡mice ¡(serum ¡samples) ¡ ¡

miR ¡1, ¡miR ¡133 ¡and ¡miR ¡206 ¡DMD ¡serum ¡biomarkers ¡

Humans ¡(serum ¡samples) ¡

miR ¡ 1 ¡ and ¡ miR ¡ 206 ¡ serum ¡ levels ¡ in ¡ exon-­‑ skipping ¡treated ¡mice ¡

miRNAs ¡as ¡serum ¡biomarkers ¡for ¡Duchenne ¡muscular ¡dystrophy ¡ Cacchiarelli ¡D, ¡et ¡al. ¡EMBO ¡Mol ¡Med. ¡2011 ¡

¡ ¡ ¡ ¡

Ylichron ¡Srl ¡: ¡Case ¡Study ¡

Method ¡Valida@on ¡and ¡ Clinical ¡Trial ¡Applica@on ¡

¡miRNA ¡biomarker ¡for ¡ ¡ Duchenne ¡Muscular ¡Distrophy ¡ ¡ (EP ¡2258963 ¡A1 ¡-­‑ ¡University ¡La ¡Sapienza) ¡

+ ¡

¡ ¡ ¡ ¡

Attributes ¡of ¡a ¡CRO ¡

ü Independence ¡from ¡assay ¡developers ¡and ¡manufacturers ¡ ¡ ü Comply ¡with ¡regulatory ¡requirements ¡ ü Ability ¡to ¡conduct ¡assays ¡under ¡GLP-­‑compliant ¡conditions ¡ ü Experience ¡to ¡develop ¡detailed ¡SOPs ¡suf6icient ¡to ¡be ¡understood ¡and ¡ correctly ¡applied ¡ ¡

¡ ¡ ¡ ¡

Ylichron ¡Srl ¡: ¡Case ¡Study ¡

+ ¡

A ¡qPCR ¡validated ¡method ¡for ¡ the ¡absolute ¡quan@fica@on ¡of ¡ miRNA ¡sequences ¡in ¡human ¡ serum ¡ ¡ Clinical ¡Trial ¡

¡miRNA ¡biomarker ¡for ¡ ¡ Duchenne ¡Muscular ¡Distrophy ¡ ¡ (EP ¡2258963 ¡A1 ¡-­‑ ¡University ¡La ¡Sapienza) ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡

“METHOD ¡FOR ¡THE ¡ABSOLUTE ¡QUANTIFICATION ¡OF ¡SPECIFIC ¡ MICRO-­‑RNAs ¡IN ¡HUMAN ¡SERUM ¡BY ¡qPCR” ¡

“Method ¡ for ¡ the ¡ quantiKication ¡ of ¡ three ¡

speciKic ¡ micro-­‑RNA ¡ sequences ¡ (miR-­‑1, ¡ miR-­‑133 ¡and ¡miR-­‑206) ¡in ¡human ¡serum ¡by ¡ a ¡ SYBR-­‑Green ¡ based ¡ real-­‑time ¡ qPCR ¡

• assay. ¡The ¡method ¡was ¡intended ¡to ¡be ¡used ¡

for ¡ the ¡ analysis ¡ of ¡ serum ¡ samples ¡ collected ¡ from ¡ patients ¡ affected ¡ by ¡ muscle ¡ degenerative ¡diseases ¡and ¡was ¡applied ¡in ¡a ¡ clinical ¡trial ¡conducted ¡on ¡DMD ¡patients”. ¡

¡ ¡ ¡ ¡

Work-­‑?low ¡of ¡the ¡qPCR ¡assay ¡for ¡the ¡absolute ¡quanti?ication ¡of ¡ miR-­‑1, ¡miR-­‑133 ¡and ¡miR-­‑206 ¡in ¡human ¡serum ¡ ¡

Blood ¡ sample ¡ Serum ¡ ¡isolation ¡ qPCR ¡with ¡miRNA ¡ speci6ic ¡primers ¡ ¡ RNA ¡extraction ¡& ¡cDNA ¡ convertion ¡ ¡

¡ ¡ ¡ ¡

Method ¡ ¡ Optimization ¡ Pre-­‑validation ¡Phase ¡of ¡the ¡qPCR ¡Method ¡for ¡miRNA ¡analysis ¡ Development ¡of ¡ ¡detailed ¡SOPs ¡ ¡ Instrument ¡ ¡ Quali6ication ¡ ¡ (IQ, ¡OQ ¡and ¡PQ) ¡ De6inition ¡ ¡

• f ¡a ¡Normalization ¡ ¡

Strategy ¡(RGT ¡Tool) ¡ Process ¡ ¡ quali6ication ¡

In ¡collaboration ¡with ¡

¡ ¡ ¡ ¡

Pre-­‑validation ¡Phase ¡of ¡the ¡qPCR ¡Method ¡for ¡miRNA ¡analysis ¡

¡ ¡ ¡ ¡

Pre-­‑validation ¡Phase ¡of ¡the ¡qPCR ¡Method ¡for ¡miRNA ¡analysis ¡

ü Determination ¡of ¡the ¡following ¡parameters: ¡ ¡

• ampli6ication ¡ef6iciency ¡ ¡
• linearity ¡of ¡the ¡assay ¡
• ¡sensitivity ¡of ¡the ¡assay ¡
• limit ¡of ¡quanti6ication ¡(LOQ ¡) ¡ ¡
• limit ¡of ¡detection ¡(LOD ¡) ¡

ü Inclusion ¡of ¡Quality ¡controls ¡for ¡Accuracy ¡and ¡Precision ¡ ü Determination ¡of ¡a ¡Normalization ¡Strategy ¡and ¡inclusion ¡of ¡Normalizers ¡

¡ ¡ ¡ ¡

Method ¡validation ¡ (pre-­‑study ¡phase) ¡

Validation ¡parameters ¡to ¡be ¡ deKined: ¡

¡

SpeciBicity ¡ Linearity ¡ Dynamic ¡range ¡ Precision ¡ Accuracy ¡

¡ ¡

Clinical ¡Study ¡ ¡ (in-­‑study ¡ validation) ¡

To ¡ decide ¡ Kitness ¡ for ¡ purpose ¡

• f ¡ the ¡ validated ¡ method ¡ and ¡

its ¡acceptance ¡criteria ¡ ¡

Validation ¡Phase ¡of ¡the ¡qPCR ¡Method ¡for ¡miRNA ¡analysis ¡

¡ ¡ ¡ ¡

Method ¡Set-­‑up ¡ SOPs ¡ IQ, ¡OQ ¡and ¡PQ ¡ RGT ¡Tool ¡

Pre-­‑validation ¡ Phase ¡ ¡ Validation ¡ Phase ¡ Clinical ¡Study ¡

Speci6icity ¡ Linearity ¡ Dynamic ¡range ¡ Precision ¡ Accuracy ¡ Samples ¡Analysis ¡ 60% ¡ 10% ¡ 30% ¡

6 ¡months ¡

¡ ¡ ¡ ¡

qPCR ¡speci?icity ¡

miR-­‑1 ¡ miR-­‑133 ¡ miR-­‑206 ¡ UniSp2 ¡

Our ¡validated ¡qPCR ¡assay ¡ shows ¡high ¡speciKicity, ¡ without ¡any ¡aspeciKic ¡target ¡ ampliKication ¡

Melt ¡Curves ¡analysis ¡

The ¡speciKicity ¡of ¡our ¡assay ¡is ¡ ensured ¡by ¡the ¡selection ¡of ¡highly ¡ speciKic ¡LNA ¡primers ¡certiKied ¡by ¡ EXIQON ¡

¡ ¡ ¡ ¡

qPCR ¡linearity ¡and ¡dynamic ¡range ¡

Four ¡calibration ¡curves ¡are ¡ included ¡in ¡each ¡ experimental ¡ session ¡ in ¡

• r d e r ¡ t o ¡ o b t a i n ¡ t h e ¡

absolute ¡ quantiKication ¡ of ¡ each ¡ miRNA ¡ (a ¡ calibration ¡ curve ¡ for ¡ the ¡ exogeous ¡ control ¡is ¡also ¡included). ¡ ¡ ¡ Our ¡validated ¡qPCR ¡assay ¡ shows ¡high ¡linearity ¡ ¡ (R2 ¡>0,98) ¡with ¡a ¡dynamic ¡ range ¡of ¡at ¡least ¡seven ¡logs ¡

¡ ¡ ¡ ¡

qPCR ¡Precision ¡

Inter-­‑assay ¡& ¡intra-­‑assay ¡reproducibility ¡

Reproducibility ¡ has ¡ been ¡ evaluated ¡ in ¡ eight ¡ independent ¡ experimental ¡ sessions ¡ for ¡ a ¡ total ¡ of ¡ 192 ¡ samples. ¡ The ¡ analysis ¡has ¡been ¡performed ¡on ¡ the ¡ Ct ¡ values ¡ of ¡ the ¡ exogenous ¡ control ¡and ¡expressed ¡as ¡CV. ¡ ¡ ¡

Mean ¡Ct ¡value ¡(UniSp2) ¡ The ¡intra-­‑assay ¡and ¡ inter-­‑assay ¡CVs ¡of ¡our ¡ miRNA ¡qPCR ¡are ¡ ¡ between ¡0,01 ¡and ¡0,03. ¡

¡ ¡ ¡ ¡

miRNA ¡assay ¡accuracy ¡

Mean ¡accuracy ¡(% ¡) ¡

0,00# 20,00# 40,00# 60,00# 80,00# 100,00# 120,00# 140,00# QCH# QCM# QCL# miR11# miR1133# miR1206#

Accuracy ¡ of ¡ the ¡ assay ¡ has ¡ been ¡ evaluated ¡ on ¡ QCs ¡ quantiKication ¡ after ¡ data ¡

• normalization. ¡ Accuracy ¡ was ¡

expressed ¡ as ¡ % ¡ of ¡ the ¡ nominal ¡ value ¡ and ¡ the ¡ mean ¡ values ¡ were ¡ calculated ¡ for ¡ each ¡miRNA ¡level. ¡

Our ¡validated ¡qPCR ¡assay ¡has ¡a ¡mean ¡overall ¡accuracy ¡of ¡ 99,59% ¡

¡ ¡ ¡ ¡

RGT ¡(miRna ¡Gene-­‑Tool) ¡for ¡data ¡Normalization ¡

RGT ¡is ¡a ¡tool ¡created ¡using ¡Microsoft ¡Excel ¡ ¡ and ¡veri6ied ¡following ¡RTC ¡SOPs ¡

ü Calculation ¡ of ¡ Ct ¡ mean ¡ and ¡ St ¡ Dev ¡ of ¡ sample ¡triplicates ¡ ü Calculation ¡of ¡SQ ¡mean ¡value ¡[SQ(miRNA)] ¡ ¡ ü Calculation ¡of ¡normalised ¡SQ ¡value ¡of ¡each ¡ sample ¡ ü Calculation ¡of ¡Accuracy ¡ ü Detection ¡ of ¡ acceptability ¡ criteria ¡ deviations ¡

¡ ¡ ¡ ¡

Advantages ¡of ¡the ¡qPCR ¡validated ¡assay ¡ ¡ for ¡absolute ¡miRNA ¡quanti?ication ¡in ¡Human ¡serum ¡

• ­‑ A ¡non-­‑invasive ¡assay ¡ ¡
• ­‑ Rapid ¡(2 ¡days) ¡quanti6ication ¡
• ­‑ Rigorous ¡quality ¡controls ¡in ¡all ¡experimental ¡sessions ¡
• ­‑ Easy-­‑to-­‑use ¡quanti6ication ¡using ¡the ¡validated ¡RGT ¡Excel ¡tool ¡ ¡

Clinical ¡Studies ¡

¡ ¡ ¡ ¡

Future ¡Perspectives ¡

myomiR ¡

DMD ¡(Duchenne ¡muscular ¡dystrophy) ¡ BMD ¡(Becker ¡muscular ¡dystrophy) ¡ ¡DM ¡(myotonic ¡dystrophy) ¡ ¡ALS ¡(amyotrophic ¡lateral ¡sclerosis) ¡ ¡FSHD ¡(facioscapulohumeral ¡dystrophy) ¡ ¡LGMD ¡(Limb-­‑girdle ¡muscular ¡dystrophy) ¡

¡

AMI ¡(acute ¡myocardial ¡infarction) ¡ CAD ¡(coronary ¡artery ¡disease) ¡ ACS ¡(acute ¡coronary ¡syndrome) ¡ VH ¡(Ventricular ¡Hypertrophy) ¡ Cardiac ¡dysrhythmia ¡

Skeletal ¡muscle ¡diseases ¡(myomiR) ¡ Cardiac ¡diseases ¡(myomiR) ¡

Oncology ¡(myomiR) ¡

Clinical ¡Studies ¡ Preclinical ¡Studies ¡

¡ ¡ ¡ ¡

Future ¡Perspectives ¡

miRNA ¡

¡ ¡ ¡ ¡

Acknowlegements ¡

• Dr. ¡Serena ¡Cinelli ¡
• Dr. ¡Isabella ¡Andreini ¡
• Dr. ¡Mercede ¡Brunetti ¡
• Dr. ¡Stefano ¡Villa ¡
• Dr. ¡Germano ¡Oberto ¡

¡

• Dr. ¡Manuela ¡Giachelia ¡
• Dr. ¡Valerio ¡de ¡Biase ¡
• Dr. ¡Roberta ¡Gioia ¡
• Dr. ¡Vittorio ¡Rosato ¡

¡

THANK ¡YOU ¡FOR ¡THE ¡ATTENTION ¡