L'importanza di un'attenta valutazione dei biomarcatori - PowerPoint PPT Presentation

¡ ¡ ¡ ¡ L'importanza ¡di ¡un'attenta ¡valutazione ¡dei ¡biomarcatori ¡ circolanti: ¡un ¡metodo ¡validato ¡per ¡la ¡quanti6icazione ¡ assoluta ¡di ¡microRNA ¡in ¡siero ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ Valentina ¡Spedaletti ¡PhD ¡ ¡ ¡ ¡ The ¡importance ¡of ¡a ¡careful ¡evaluation ¡of ¡circulating ¡ biomarkers: ¡a ¡validated ¡method ¡for ¡the ¡absolute ¡ quanti6ication ¡of ¡microRNAs ¡in ¡serum ¡

¡ ¡ ¡ ¡ Molecular ¡Biomarkers ¡ Biomarker : ¡ ¡ A ¡characteristic ¡that ¡is ¡measured ¡and ¡evaluated ¡as ¡an ¡indicator ¡of ¡normal ¡biological ¡ processes, ¡pathogenic ¡processes, ¡or ¡pharmacological ¡responses ¡to ¡a ¡therapeutic ¡ intervention. ¡ ¡ Molecular ¡Biomarkers: ¡ ü ¡DNA ¡biomarkers: ¡Single ¡nucleotide ¡polymorphisms ¡(SNPs), ¡short ¡tandem ¡ repeats ¡(STRs), ¡deletions, ¡insertions, ¡or ¡other ¡variation ¡at ¡DNA ¡sequence ¡level ¡ ü RNA ¡biomarkers: ¡ -­‑ ¡mRNA ¡levels ¡ -­‑ ¡miRNA ¡levels ¡ ü Protein ¡biomarkers: ¡a ¡protein ¡status ¡evaluation ¡

¡ ¡ ¡ ¡ Types ¡of ¡Biomarkers ¡ ¡ ü Predictive ¡biomarkers ¡ Give ¡information ¡about ¡the ¡effect ¡of ¡a ¡therapeutic ¡intervention. ¡ ¡ Example: ¡High ¡cellular ¡expression ¡of ¡ER ¡predicts ¡beneKit ¡from ¡tamoxifen-­‑based ¡ ¡ chemotherapy ¡ ¡ ü Prognostic ¡biomarkers ¡ ¡ ¡ Provide ¡information ¡about ¡the ¡patients ¡overall ¡outcome, ¡regardless ¡ ¡of ¡therapy. ¡ Example: ¡K-­‑ras ¡mutation ¡is ¡associated ¡with ¡poor ¡prognosis ¡in ¡NSCLC ¡patients ¡ ¡ ü Pharmacodynamic ¡biomarkers ¡ Associated ¡with ¡drug ¡effect. ¡ Example: ¡skin ¡rash ¡with ¡EGFR ¡Inhibitor ¡

¡ ¡ ¡ ¡ microRNAs: ¡a ¡new ¡class ¡of ¡biomarkers ¡ ¡ Small ¡noncoding ¡RNAs ¡that ¡regulate ¡gene ¡expression ¡ Evolutionary ¡conserved ¡ One ¡miRNA ¡has ¡multiple ¡targets ¡ One miRNA … mRNA mRNA mRNA mRNA mRNA

¡ ¡ ¡ ¡ microRNAs ¡characteristics ¡ ¡ ¡ ü Small ¡(17-­‑25nt), ¡non ¡coding, ¡RNA ¡molecules ¡with ¡ epigenetic ¡function ¡ ü Generated ¡from ¡endogenous ¡hairpin-­‑shaped ¡ transcripts ¡encoded ¡in ¡the ¡genomes ¡ ¡ ü More ¡than ¡500 ¡microRNAs ¡encoded ¡in ¡human ¡ genome ¡ ü It ¡has ¡been ¡estimated ¡that ¡more ¡than ¡30% ¡of ¡protein-­‑ coding ¡genes ¡can ¡be ¡regulated ¡by ¡microRNAs ¡ ü Regulate ¡fundamental ¡cellular ¡processes ¡ ¡

¡ ¡ ¡ ¡ microRNAs ¡biogenesis ¡ ü Transcribed ¡by ¡RNA ¡Polymerase ¡II ¡as ¡a ¡ long ¡primary ¡transcript ¡(pri-­‑miRNAs). ¡ ü In ¡the ¡nucleus, ¡pri-­‑miRNAs ¡are ¡processed ¡ by ¡RNAse ¡III-­‑like ¡enzyme ¡Drosha. ¡ ¡ ü Pre-­‑miRNAs ¡are ¡then ¡exported ¡to ¡the ¡ cytosol ¡by ¡Exportin ¡5. ¡ ü In ¡the ¡cytosol, ¡RNAse ¡III-­‑like ¡Dicer ¡ processes ¡these ¡precursors. ¡ ü Mature ¡miRNAs ¡are ¡incorporated ¡in ¡RISC. ¡ ¡ ü miRNAs ¡with ¡high ¡homology ¡to ¡the ¡target ¡ mRNA ¡lead ¡to ¡mRNA ¡cleavage. ¡ ü miRNAs ¡with ¡imperfect ¡base ¡pairing ¡to ¡the ¡ target ¡mRNA ¡lead ¡to ¡translational ¡ repression. ¡

¡ ¡ ¡ ¡ microRNAs ¡effects ¡ miRNAs ¡with ¡high ¡ miRNAs ¡with ¡imperfect ¡ homology ¡to ¡the ¡target ¡ base ¡pairing ¡to ¡the ¡target ¡ mRNA ¡lead ¡to ¡mRNA ¡ mRNA ¡lead ¡to ¡translational ¡ cleavage ¡ repression ¡ Cellular ¡Proliferation ¡ Cellular ¡migration ¡ Cellular ¡Differentiation ¡ Apoptosis ¡

¡ ¡ ¡ ¡ Circulating ¡microRNAs ¡as ¡Biomarkers ¡ ü High ¡stability ¡and ¡speci6icity ¡ ¡in ¡biological ¡6luids ¡ ü Detectable ¡in ¡samples ¡without ¡invasive ¡ collection ¡procedures ¡ ü Indicators ¡with ¡optimal ¡levels ¡of ¡clinical ¡ sensitivity. ¡The ¡expression ¡pro6iles ¡of ¡circulating ¡ miRNAs ¡, ¡in ¡fact ¡, ¡have ¡proved ¡to ¡be ¡ pathognomonic ¡showing ¡a ¡high ¡correlation ¡with ¡ the ¡disease ¡ ü Expression ¡levels ¡are ¡proportional ¡to ¡the ¡ severity ¡of ¡the ¡disease ¡ ü Valid ¡biomarkers ¡for ¡translational ¡studies ¡

¡ ¡ ¡ ¡ microRNAs ¡in ¡Research ¡and ¡Clinical ¡Trials ¡ Growing number of miRNA-based clinical trials (https://clinicaltrials.gov/) ¡“clinical ¡trials ¡including ¡miRNA” ¡ 60 ¡ 51 ¡ 50 ¡ 40 ¡ 40 ¡ 30 ¡ 19 ¡ >2000 peer-reviewed publications on miRNA biomarkers 20 ¡ 14 ¡ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) 10 ¡ 9 ¡ 10 ¡ 5 ¡ 3 ¡ 0 ¡ 0 ¡ 2006 ¡ 2007 ¡ 2008 ¡ 2009 ¡ 2010 ¡ 2011 ¡ 2012 ¡ 2013 ¡ 2014 ¡

¡ ¡ ¡ ¡ microRNAs ¡as ¡biomarkers ¡in ¡Clinical ¡Trials ¡ Trends in Molecular Medicine August 2014, Vol. 20, No. 8

¡ ¡ ¡ ¡ microRNAs ¡as ¡biomarkers ¡in ¡Clinical ¡Trials ¡ The ¡Role ¡of ¡microRNA-­‑29b ¡in ¡the ¡Oral ¡ REmodelling ¡in ¡Diabetic ¡CardiOmapathy: ¡ Squamous ¡Cell ¡Carcinoma ¡ Gender ¡Response ¡to ¡PDE5i ¡InhibiTOrs ¡ (NCT02009852) ¡ (NCT01803828) ¡ ü Observational ¡Study ¡ ü Phase ¡4 ¡– ¡Drug: ¡Tadala6il ¡vs ¡Placebo ¡ ü Outcome: ¡microRNA-­‑29b ¡ ü Outcome: ¡Change ¡in ¡Circulating ¡ [Time ¡Frame: ¡3 ¡years] ¡ microRNA ¡levels ¡at ¡0, ¡ ¡3 ¡and ¡6 ¡months ¡ ü Samples: ¡Tissue, ¡serum, ¡saliva ¡ ü Samples: ¡Plasma ¡ ü Estimated ¡Enrollment: ¡100 ¡ ¡ ü Estimated ¡Enrollment: ¡164 ¡ ¡ Description: ¡ ¡ Description: ¡ ¡ To ¡6ind ¡out ¡if ¡there ¡is ¡prognostic ¡value ¡of ¡ Evaluation ¡of ¡miRNAs ¡(miR208, ¡499, ¡1, ¡ microRNA-­‑29b ¡in ¡oral ¡cancer ¡and ¡provide ¡ 133, ¡29, ¡223, ¡222) ¡before ¡and ¡after ¡ some ¡reference ¡for ¡future ¡treatment ¡ treatment ¡and ¡gender ¡differences ¡

¡ ¡ ¡ ¡ microRNAs ¡pro?iling ¡methods ¡ HT

¡ ¡ ¡ ¡ miRNA ¡analysis: ¡qPCR ¡ qPCR ¡(quantitative ¡real-­‑time ¡Polymerase ¡Chain ¡Reaction) ¡is ¡a ¡PCR ¡reaction ¡to ¡be ¡ visualized ¡“in ¡real ¡time” ¡as ¡the ¡reaction ¡progresses. ¡ It ¡is ¡a ¡6luorescence ¡based ¡method: ¡emission ¡of ¡6luorescence ¡is ¡directly ¡correlated ¡to ¡the ¡ amount ¡of ¡ampli6ied ¡DNA ¡ The ¡point ¡of ¡the ¡ampli6ication ¡reaction ¡at ¡which ¡the ¡ 6luorescence ¡rises ¡signi6icantly ¡above ¡the ¡background ¡ is ¡known ¡as ¡ threshold ¡cycle ¡ (C T ¡or ¡ C q ¡ ) ¡and ¡is ¡ correlated ¡to ¡the ¡starting ¡quantity ¡of ¡each ¡sample. ¡ qPCR ¡Advantages: ü The ¡ most ¡sensitive ¡procedure ¡for ¡DNA/ RNA ¡detection ¡and ¡quanti6ication ¡ It ¡is ¡extremely ¡accurate ¡and ¡speci6ic ¡ ü It ¡allows ¡to ¡measure ¡minute ¡amounts ¡of ¡ ü target ¡sample ¡ It ¡has ¡a ¡high ¡range ¡of ¡quanti6ication: ¡at ¡ ü least ¡7 ¡log ¡ It ¡shows ¡low ¡contamination ¡risks ¡ ü

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ qPCR: ¡SYBR-­‑Green ¡and ¡Taqman ¡Probes ¡ Taqman ¡probes ¡ SYBR-­‑Green ¡ The ¡TaqMan ¡probes ¡contain ¡a ¡6luorescent ¡reporter ¡dye ¡at ¡ SYBR ¡Green ¡dye ¡is ¡a ¡DNA ¡intercalator ¡and ¡binds ¡ the ¡5′end ¡of ¡the ¡probe ¡and ¡a ¡quencher ¡dye ¡at ¡the ¡3′end ¡of ¡ the ¡minor ¡groove ¡of ¡double-­‑stranded ¡DNA. ¡ ¡ the ¡probe. ¡ ¡ ¡ ¡ When ¡SYBR ¡Green ¡dye ¡binds ¡to ¡double-­‑stranded ¡ Probe ¡cleavage ¡during ¡the ¡PCR ¡reaction ¡spatially ¡ DNA, ¡the ¡intensity ¡of ¡the ¡6luorescence ¡increases. ¡ ¡ separates ¡the ¡reporter ¡dye ¡from ¡the ¡quencher ¡dye, ¡ thereby ¡allowing ¡detection ¡of ¡the ¡reporter ¡dye ¡ 6luorescence. ¡