Improving on the Accuracy of a Genome Assembly Lecture - - PowerPoint PPT Presentation

Improving ¡on ¡the ¡Accuracy ¡of ¡a ¡ Genome ¡Assembly ¡

Lecture ¡6: ¡September ¡6, ¡2012 ¡

¡

Review ¡from ¡Last ¡Lecture ¡

Sample ¡PreparaCon ¡ Sequencing ¡ Assembly ¡ Analysis ¡

Fragments ¡ Reads ¡ ConCgs ¡

Sample ¡PreparaCon ¡ Sequencing ¡ Assembly ¡ Analysis ¡

Fragments ¡ Reads ¡ ConCgs ¡

CalculaCng ¡N50 ¡

• 1. Take ¡a ¡list ¡L ¡of ¡posiCve ¡integers ¡

¡

• 2. Create ¡another ¡list ¡L’, ¡which ¡is ¡idenCcal ¡to ¡L, ¡

except ¡that ¡every ¡element ¡n ¡in ¡L ¡has ¡been ¡ replaced ¡with ¡n ¡copies ¡of ¡itself ¡ ¡

• 3. The ¡median ¡of ¡L’ ¡is ¡the ¡N50 ¡of ¡L ¡

Other ¡EvaluaCons ¡

• Number ¡of ¡inserCons, ¡deleCons, ¡and ¡

subsCtuCon ¡errors ¡in ¡an ¡assembly ¡

• misassembly ¡of ¡conCgs ¡(chimeric ¡indels) ¡

>=500 ¡bp ¡

Other ¡EvaluaCons ¡

• Number ¡of ¡inserCons, ¡deleCons, ¡and ¡

subsCtuCon ¡errors ¡in ¡an ¡assembly ¡

• misassembly ¡of ¡conCgs ¡(chimeric ¡indels) ¡

>=500 ¡bp ¡

EvaluaCon ¡Programs ¡

• BLAT ¡is ¡commonly ¡used ¡but ¡requires ¡some ¡

work: ¡

– Run ¡BLAT ¡ – Write ¡a ¡program ¡that ¡parses ¡the ¡output; ¡count ¡ mismatches ¡and ¡indels. ¡ – Can ¡be ¡tricky ¡to ¡detect ¡misassemblies. ¡

• Plantagora ¡is ¡commonly ¡used. ¡
• New ¡programs ¡are ¡developed ¡all ¡the ¡Cme. ¡

Assembly ¡Errors ¡

• The ¡number ¡of ¡subsCtuCon ¡errors, ¡inserCons ¡and ¡

deleCons ¡can ¡be ¡significantly ¡large. ¡

– ~9000 ¡errors ¡in ¡assembly ¡of ¡E.coli ¡with ¡Velvet. ¡ ¡ – 20 ¡to ¡30 ¡errors ¡for ¡every ¡100,000 ¡bp ¡with ¡SOAPdenovo. ¡

• Important ¡for ¡disCnguishing ¡between ¡true ¡variaCon ¡

and ¡arCfacts ¡of ¡the ¡assembly. ¡

• But ¡why ¡do ¡assembly ¡errors ¡occur? ¡ ¡

Fragment ¡Assembly ¡Errors ¡

Detangling ¡the ¡de ¡Bruijn ¡Graph ¡

Even ¡using ¡mate-­‑pair ¡informaCon, ¡the ¡de ¡Bruijn ¡ graph ¡is ¡highly ¡tangled. ¡ ¡ ¡ There ¡are ¡the ¡following ¡opCons ¡for ¡detangling ¡ the ¡de ¡Bruijn ¡graph: ¡

• 1. Error ¡correcCon ¡of ¡reads ¡
• 2. Bulge ¡and ¡whirl ¡removal ¡

Ingredients ¡For ¡a ¡Good ¡Assembly ¡

• Coverage: ¡high ¡coverage ¡is ¡required ¡and ¡

biased ¡coverage ¡will ¡fragment ¡the ¡assembly ¡ ¡

12 ¡

Ingredients ¡for ¡a ¡Good ¡Assembly ¡

• Read ¡length: ¡reads ¡and ¡mates ¡must ¡be ¡longer ¡

than ¡the ¡repeats ¡

13 ¡

Ingredients ¡For ¡a ¡Good ¡Assembly ¡

• Read ¡Quality: ¡errors ¡obscure ¡overlaps. ¡ ¡High ¡

error ¡rates ¡require ¡short ¡k-­‑mers, ¡which ¡leads ¡ to ¡hairball ¡regions ¡

14 ¡

Error ¡CorrecCon ¡of ¡Reads ¡

Assembly ¡from ¡NGS ¡data ¡

Next ¡ GeneraCon ¡ Sequencer ¡ billions ¡

• f ¡

bad ¡ reads ¡ ¡ CorrecCon ¡ Assembly ¡ billions ¡

• f ¡

good ¡ reads ¡ ¡ ConCgs ¡

16 ¡

• K-­‑spectrum ¡approach ¡(Chaisson ¡et ¡al., ¡Bioinforma1cs ¡2008) ¡
• SHREC ¡(Shroder ¡et ¡al., ¡Bioinforma1cs ¡2009) ¡
• RepCle ¡(Yang ¡and ¡Aluru, ¡2010) ¡

Read ¡Error ¡CorrecCon ¡

• Principle: ¡

– Use ¡the ¡coverage ¡redundancy ¡to ¡correct ¡ erroneous ¡reads ¡ ¡

AGGATGACCAGGATTAGGACCAGT GATGACCAGGATTAGGACCAGTTC GATGACCAGGATTAGGACCAGTTC ATGACCAGGATTAGGACCAGTTCA ACCAGGATTCGGACCAGTTCATTC ACCAGGATTAGGACCAGTTCATTC ACCAGGATTAGGACCAGTTCATTC CCAGGATTAGGACCAGTTCATTCA Probably ¡due ¡to ¡an ¡ error ¡sequencing ¡

17 ¡

Importance ¡of ¡Error ¡CorrecCon ¡

Avg ¡ Con(g ¡ Max ¡ Con(g ¡ N50 ¡ N75 ¡ Con(gs ¡ Before ¡ 4474 ¡ 29042 ¡ 8260 ¡ 3144 ¡ 374 ¡ ¡Aher ¡ 7094 ¡ ¡ 79281 ¡ 17397 ¡ 4675 ¡ 231 ¡

• Assembled ¡with ¡330X ¡coverage, ¡ ¡36bp ¡Illumina ¡reads ¡

¡

Bartonella ¡Henselae ¡ (bacteria ¡that ¡can ¡ ¡ cause ¡illness ¡in ¡humans) ¡ ¡

Effects ¡of ¡EC ¡of ¡Reads ¡

• Error ¡correcCon ¡of ¡reads ¡will ¡greatly ¡reduce ¡

the ¡“noise” ¡in ¡the ¡data. ¡

• The ¡de ¡Bruijn ¡graph ¡on ¡error ¡corrected ¡reads ¡

will ¡be ¡greatly ¡simplified; ¡allowing ¡it ¡to ¡be ¡ easier ¡to ¡find ¡a ¡ ¡path ¡in ¡the ¡graph. ¡

• Works ¡well ¡in ¡99% ¡percent ¡of ¡cases ¡but ¡in ¡1% ¡
• f ¡cases ¡will ¡create ¡an ¡assembly ¡error ¡rather ¡

than ¡correct ¡one. ¡

19 ¡

Error ¡CorrecCon ¡of ¡ConCgs ¡

De ¡Bruijn ¡Graph ¡of ¡a ¡Genome ¡

Example ¡Genome: ¡ ¡ ¡ABCDEFGHICDEFGKL ¡ Example ¡Genome: ¡ ¡ ¡ABCDEFGHICDEFGKL

(! ¡−1)-­‑mers ¡ !-­‑mers ¡

ABC BCD CDE DEF EFG GHI HIC ICD FGK GKL ¡ ABCD BCDE CDEF DEFG EFGH GHIC HICD ICDE EFGK FGKL ¡

De ¡Bruijn ¡Graph ¡of ¡a ¡Genome ¡

Example ¡Genome: ¡ ¡ ¡ABCDEFGHICDEFGKL ¡ Example ¡Genome: ¡ ¡ ¡ABCDEFGHICDEFGKL

1 ¡ 3 ¡ 2 ¡ ABC BCD CDE DEF EFG FGK GKL FGH GHI HIC ICD

Typical ¡De ¡Bruijn ¡Graph ¡

… ¡

De ¡Bruijn ¡Graph ¡of ¡a ¡Genome ¡

Example ¡Genome: ¡ ¡ ¡ABCDEFGHICDEFGKL ¡ Example ¡Genome: ¡ ¡ ¡ABCDEFGHICDEFGKL

1 ¡ 3 ¡ 2 ¡ ABC BCD CDE DEF EFG FGK GKL FGH GHI HIC ICD

De ¡Bruijn ¡Graph ¡of ¡a ¡Genome ¡

ABC BCD CDE DEF EFG FGK GKL

Example ¡Genome: ¡ ¡ ¡ABCDEFGHICDEFGKL ¡ Example ¡Genome: ¡ ¡ ¡ABCDEFGHICDEFGKL

De ¡Bruijn ¡Graph ¡of ¡a ¡Genome ¡

ABC BCD CDE DEF EFG FGK GKL

Example ¡Genome: ¡ ¡ ¡ABCDEFGHICDEFGKL ¡ ResulCng ¡Erroneous ¡Genome: ¡ ¡ ¡ABCDEFGKL

1 ¡

Sample ¡PreparaCon ¡ Sequencing ¡ Assembly ¡ Analysis ¡

Fragments ¡ Reads ¡ ConCgs ¡

Sample ¡PreparaCon ¡ Sequencing ¡ Assembly ¡ Analysis ¡

Fragments ¡ Reads ¡ SEQuel ¡ Refined ¡ConCgs ¡ Reads ¡ ConCgs ¡

. ¡

SEQuel ¡Algorithm ¡

I. Align ¡each ¡of ¡the ¡input ¡reads ¡to ¡each ¡of ¡the ¡iniCal ¡

• conCgs. ¡

¡ ¡ ¡ ¡

. ¡

I. Align ¡each ¡of ¡the ¡input ¡reads ¡to ¡each ¡of ¡the ¡iniCal ¡

• conCgs. ¡

¡ ¡ ¡ ¡

SEQuel ¡Algorithm ¡

. ¡

I. Align ¡each ¡of ¡the ¡input ¡reads ¡to ¡each ¡of ¡the ¡iniCal ¡

• conCgs. ¡

¡ ¡ ¡ ¡

SEQuel ¡Algorithm ¡

. ¡

I. Align ¡each ¡of ¡the ¡input ¡reads ¡to ¡each ¡of ¡the ¡iniCal ¡

• conCgs. ¡

¡ ¡ ¡ ¡

1 ¡ 2 ¡ 5 ¡ 4 ¡ 7 ¡ 10 ¡ 17 ¡ 18 ¡ 19 ¡ 22 ¡ 24 ¡ 27 ¡ 25 ¡ 24 ¡ 1 ¡ 1 ¡ 2 ¡ 4 ¡ 7 ¡ 10 ¡ 15 ¡ 16 ¡ 16 ¡ 17 ¡ 18 ¡ 22 ¡ 22 ¡ 23 ¡

SEQuel ¡Algorithm ¡

I. Align ¡each ¡of ¡the ¡input ¡reads ¡to ¡each ¡of ¡the ¡iniCal ¡

• conCgs. ¡

¡ ¡ ¡ ¡

. ¡II. Build ¡the ¡posiConal ¡de ¡Bruijn ¡graph ¡for ¡each ¡set ¡of ¡

• reads. ¡ ¡

¡ ¡

SEQuel ¡Algorithm ¡

PosiConal ¡De ¡Bruijn ¡Graph ¡

I. Choose ¡a ¡value ¡of ¡ ¡and ¡Δ. ¡ II. Each ¡posiConal ¡-­‑mer ¡() ¡is ¡an ¡edge ¡between ¡two ¡posiConal ¡ (–mers: ¡(pre)ix) ¡and ¡(suf)ix). ¡

• III. PosiConal ¡–mers, ¡() ¡and ¡(’) ¡are ¡glued ¡if ¡and ¡ ¡that ¡have ¡

the ¡same ¡label. ¡

A ¡posiConal ¡!-­‑mer ¡is ¡a ¡!-­‑mer ¡with ¡an ¡approximate ¡

• posiCon. ¡ ¡ ¡ ¡

De ¡Bruijn ¡Graph ¡of ¡a ¡Genome ¡

Example ¡Genome: ¡ ¡ ¡ABCDEFGHICDEFGKL ¡ Example ¡Genome: ¡ ¡ ¡ABCDEFGHICDEFGKL

ABC BCD CDE DEF EFG FGK GKL FGH GHI HIC ICD

PosiConal ¡De ¡Bruijn ¡Graph ¡

ABCD,1 BCDE,2 CDEF,3 DEFG,4 EFGH,5 FGHI,6 HICD,7 ICDE,8 CDEF,9 DEFG,10 EFGK,11 FGKL,12 Positional

!-­‑mers ¡

Example ¡Genome: ¡ ¡ ¡ABCDEFGHICDEFGKL

PosiConal ¡De ¡Bruijn ¡Graph ¡

ABC,1 BCD,2 CDE,3 DEF,4 FGH,6 GHI,7 HIC,8 ICD,9 CDE,10 DEF,11 FGK,13 EFG,12 … ¡ EFG,5

Example ¡Genome: ¡ ¡ ¡ABCDEFGHICDEFGKL

1 ¡ 2 ¡ 5 ¡ 4 ¡ 7 ¡ 10 ¡ 17 ¡ 18 ¡ 19 ¡ 22 ¡ 24 ¡ 27 ¡ 25 ¡ 24 ¡

PosiConal ¡ ¡

!-­‑mers ¡

AAGTAG, 1 AGTAGC, 2 GTAGCT, 3 TAGCTT, 4 AGCTTG, 5 AAGTAG, 5 AGTAGG, 9 GTAGGG,10 TAGGGC,11 AGGGCG,12

AAGTAG,1

AAGTA,1

AGTAGC,2 GTAGCT,3 TAGCTT,4 AGCTTG,5 AAGTAG,5

AGTAG,2 GTAGC,3 TAGCT,4 TAGCT,4 GCTTG,6 AGCTT,5 AGCTT,5 AAGTA,5 AGTAG,6 AGTAG,9 AGTAG,2 GTAGC,3

AGTAGG,9

GTAGG,10 GTAGG,10

GTAGGG,10

TAGGG,11

TAGGGC,11

TAGGG,11 AGGGC,12 AGGGC,12

AGGGCG,12

GGGCG,13

AAGTAG,1

AAGTA,1

AGTAGC,2 GTAGCT,3 TAGCTT,4 AGCTTG,5 AAGTAG,5

AGTAG,2 GTAGC,3 TAGCT,4 TAGCT,4 GCTTG,6 AGCTT,5 AGCTT,5 AAGTA,5 AGTAG,6 AGTAG,9 AGTAG,2 GTAGC,3

AGTAGG,9

GTAGG,10 GTAGG,10

GTAGGG,10

TAGGG,11

TAGGGC,11

TAGGG,11 AGGGC,12 AGGGC,12

AGGGCG,12

GGGCG,13

AAGTAG,1

AAGTA,1

AGTAGC,2 GTAGCT,3 TAGCTT,4 AGCTTG,5 AAGTAG,5

GTAGC,3 TAGCT,4 TAGCT,4 GCTTG,6 AGCTT,5 AGCTT,5 AAGTA,5 AGTAG,6 AGTAG,9 AGTAG,2 GTAGC,3

AGTAGG,9

GTAGG,10 GTAGG,10

GTAGGG,10

TAGGG,11

TAGGGC,11

TAGGG,11 AGGGC,12 AGGGC,12

AGGGCG,12

GGGCG,13

AAGTAG,1

AAGTA,1

AGTAGC,2 GTAGCT,3 TAGCTT,4 AGCTTG,5 AAGTAG,5

GTAGC,3 TAGCT,4 TAGCT,4 GCTTG,6 AGCTT,5 AGCTT,5 AAGTA,5 AGTAG,6 AGTAG,9 AGTAG,2 GTAGC,3

AGTAGG,9

GTAGG,10 GTAGG,10

GTAGGG,10

TAGGG,11

TAGGGC,11

TAGGG,11 AGGGC,12 AGGGC,12

AGGGCG,12

GGGCG,13

AAGTAG,1

AAGTA,1

AGTAGC,2 GTAGCT,3 TAGCTT,4 AGCTTG,5 AAGTAG,5

GTAGC,3 TAGCT,4 TAGCT,4 GCTTG,6 AGCTT,5 AGCTT,5 AAGTA,5 AGTAG,6 AGTAG,9 AGTAG,2

AGTAGG,9

GTAGG,10 GTAGG,10

GTAGGG,10

TAGGG,11

TAGGGC,11

TAGGG,11 AGGGC,12 AGGGC,12

AGGGCG,12

GGGCG,13

AAGTAG,1 AGTAGC,2 GTAGCT,3 TAGCTT,4 AGCTTG,5 AAGTAG,5 AGTAGG,9 GTAGGG,10 TAGGGC,11 AGGGCG,12

I. Align ¡each ¡of ¡the ¡input ¡reads ¡to ¡each ¡of ¡the ¡iniCal ¡

• conCgs. ¡

¡ ¡ ¡ ¡

. ¡

SEQuel ¡Algorithm ¡

• II. Build ¡the ¡posiConal ¡de ¡Bruijn ¡graph ¡for ¡each ¡set ¡of ¡
• reads. ¡ ¡
• III. Remove ¡all ¡bulges ¡and ¡whirls ¡for ¡the ¡posiConal ¡de ¡

Bruijn ¡graph. ¡ ¡

Similar ¡to ¡the ¡approach ¡to ¡Euler ¡(Pevzner, ¡Tang, ¡and ¡Tesler, ¡2004). ¡

I. Align ¡each ¡of ¡the ¡input ¡reads ¡to ¡each ¡of ¡the ¡iniCal ¡

• conCgs. ¡

¡ ¡ ¡ ¡

. ¡

SEQuel ¡Algorithm ¡

• II. Build ¡the ¡posiConal ¡de ¡Bruijn ¡graph ¡for ¡each ¡set ¡of ¡
• reads. ¡ ¡
• III. Remove ¡all ¡bulges ¡and ¡whirls ¡for ¡the ¡posiConal ¡de ¡

Bruijn ¡graph. ¡

• IV. ConCg ¡recovery ¡and ¡refinement ¡using ¡alignment ¡of ¡

new ¡conCgs ¡with ¡those ¡of ¡the ¡original ¡assembly. ¡ ¡

AAGTAG,1 AGTAGC,2 GTAGCT,3 TAGCTT,4 AGCTTG,5 AAGTAG,5 AGTAGG,9 GTAGGG,10 TAGGGC,11 AGGGCG,12

AAGTAG,1 AGTAGC,2 GTAGCT,3 TAGCTT,4 AGCTTG,5 AGTAGG,9 GTAGGG,10 TAGGGC,11 AGGGCG,12

AAGTAG,1 AGTAGC,2 GTAGCT,3 TAGCTT,4 AGCTTG,5 AGTAGG,9 GTAGGG,10 TAGGGC,11 AGGGCG,12

AAGTAGCTTG AGTAGGGCG

IniCal ¡conCg ¡

GGCTTCCGAGGACCACTGGATTATGA

GGCTTCCGAGGACCACAAATGGATTATGA TCCGACCACCAC CCGAGGACCACAAATGGAT ¡ GGTTTATGG GCGGGCCGAGGACCACA ¡

ParCal ¡conCgs ¡

GGCTTCCGAGGACCAC TGGATTATGA

IniCal ¡conCg ¡

• 1. ¡ ¡
• 2. ¡ ¡
• 3. ¡ ¡
• 4. ¡ ¡

GGCTTCCGACCACCAC TGGATTATGA TCCGACCACCAC CCGAGGACCACAAATGGAT ¡ GGTTTATGG GCGGGCCGAGGACCACA ¡

• 1. ¡ ¡
• 2. ¡ ¡
• 3. ¡ ¡
• 4. ¡ ¡

GGCTTCCGACCACCACAAATGGATTATGA CCGAGGACCACAAATGGAT ¡ GGTTTATGG GCGGGCCGAGGACCACA ¡

• 2. ¡ ¡
• 3. ¡ ¡
• 4. ¡ ¡

GGCTTCCGACCACCACAAATGGTTTATGG GGTTTATGG GCGGGCCGAGGACCACA ¡

• 3. ¡ ¡
• 4. ¡ ¡

GCGGGCCGAGGACCACAAATGGTTTATGG GCGGGCCGAGGACCACA ¡

• 4. ¡ ¡

GCGGGCCGAGGACCACAAATGGTTTATGG

Repeat ¡the ¡process ¡for ¡all ¡conCgs. ¡

249 ¡ 1945 ¡

0 ¡ 200 ¡ 400 ¡ 600 ¡ 800 ¡ 1000 ¡ 1200 ¡ 1400 ¡ 1600 ¡ 1800 ¡ 2000 ¡

Euler-­‑SR ¡ Velvet ¡ with ¡NGS-­‑Refine ¡ without ¡NGS-­‑Refine ¡

Number ¡of ¡inserCons ¡and ¡deleCons ¡ Number ¡of ¡subsCtuCon ¡errors ¡

0 ¡ 1000 ¡ 2000 ¡ 3000 ¡ 4000 ¡ 5000 ¡ 6000 ¡ 7000 ¡ 8000 ¡ 9000 ¡

Euler-­‑SR ¡ Velvet ¡ ¡

8997 ¡ 325 ¡ 351 ¡ 47 ¡ 141 ¡ 31 ¡

Standard ¡(MulC-­‑cell) ¡Data ¡ ¡

Coverage ¡

(Chitsaz ¡et ¡al., ¡2011) ¡

Single-­‑cell ¡Data ¡ ¡

Coverage ¡ Coverage ¡

(Chitsaz ¡et ¡al., ¡2011) ¡

Number ¡of ¡inserCons ¡and ¡deleCons ¡

0 ¡ 100 ¡ 200 ¡ 300 ¡ 400 ¡ 500 ¡ 600 ¡ 700 ¡ 800 ¡ 900 ¡ Euler-­‑SR ¡ Velvet-­‑SC ¡ with ¡NGS-­‑Refine ¡ without ¡NGS-­‑Refine ¡

Number ¡of ¡subsCtuCon ¡errors ¡

0 ¡ 100 ¡ 200 ¡ 300 ¡ 400 ¡ 500 ¡ Euler-­‑SR ¡ Velvet-­‑SC ¡

47 ¡ 11 ¡ 351 ¡ 897 ¡ 40 ¡ 267 ¡ 61 ¡ 453 ¡

*(Chitsaz ¡et ¡al., ¡2011) ¡ * ¡ * ¡