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http://faculty.washington.edu/tdavis/description.html http://www.youtube.com/watch?v=_5bGPa-QXV4 http://www.youtube.com/watch?v=koh6QZOeucM http://www.youtube.com/watch?v=nB6gFn0_wr8 13 10 3 Figure. The repressilator

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SLIDE 1

http://faculty.washington.edu/tdavis/description.html http://www.youtube.com/watch?v=_5bGPa-QXV4 http://www.youtube.com/watch?v=koh6QZOeucM http://www.youtube.com/watch?v=nB6gFn0_wr8

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  • Figure. The repressilator genetic regulatory network.

A Synthetic Oscillatory Network of Transcriptional Regulators; Michael Elowitz and Stanislas Leibler; Nature. 2000

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SLIDE 3
  • Figure. The repressilator genetic regulatory network.

A Synthetic Oscillatory Network of Transcriptional Regulators; Michael Elowitz and Stanislas Leibler; Nature. 2000

2008: NYMU_reloxilator 2008: Paris 2008: HKUST

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Various cell cycles: http://www.genome.jp/kegg

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Natural oscillator is better than artificial one

Various cell cycles: http://www.genome.jp/kegg

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SLIDE 6

J Am Coll Cardiol. 2006 Feb 21;47(4):708-14. Epub 2006 Jan 26. Cell Death and Differentiation (2006) 13, 984–993. doi:10.1038/sj.cdd.4401924

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SLIDE 7
  • Applications:
  • Paclitaxel & M phase

J Am Coll Cardiol. 2006 Feb 21;47(4):708-14. Epub 2006 Jan 26. Cell Death and Differentiation (2006) 13, 984–993. doi:10.1038/sj.cdd.4401924

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SLIDE 8
  • Applications:
  • Paclitaxel & M phase
  • Cancer

J Am Coll Cardiol. 2006 Feb 21;47(4):708-14. Epub 2006 Jan 26. Cell Death and Differentiation (2006) 13, 984–993. doi:10.1038/sj.cdd.4401924

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SLIDE 9

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CELL MAGIC

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CELL MAGIC

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SLIDE 12

CELL MAGIC

Time

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SLIDE 13

CELL MAGIC

Time Space

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SLIDE 14

CELL MAGIC

Time Space Microscopic

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SLIDE 15

CELL MAGIC

Time Space Microscopic Macroscopic

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SLIDE 16

CELL MAGIC

Time Space Microscopic Macroscopic

  • E. coli

Budding Yeast

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SLIDE 17

CELL MAGIC

Time Space Microscopic Macroscopic Budding Yeast

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SLIDE 18

Model Prediction

budding yeast as example

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SLIDE 19

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SLIDE 20

Promoters

cln SC

cln SC xfp t SC

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SLIDE 21

Original Cell Cycle

Chen, K. C., Calzone, L., Csikasz-Nagy, A., Cross, F. R., Novak, B., & Tyson, J. J. (2004).

  • Figure. Original cell cycle (based on cell cycle model by Chen 2004)

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SLIDE 22

Original Cell Cycle

Chen, K. C., Calzone, L., Csikasz-Nagy, A., Cross, F. R., Novak, B., & Tyson, J. J. (2004).

  • Figure. Original cell cycle (based on cell cycle model by Chen 2004)

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SLIDE 23

Cell Cycle (Detail about Cyclins)

Network of yeast cell cycle: http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?map04111

S phase G1 phase G2 phase M phase

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SLIDE 24

Genetic Circuit v1

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SLIDE 25

Model & Simulation v1

  • Figure. Concentration of XFP change with time

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SLIDE 26

Model & Simulation v1

  • Figure. Concentration of XFP change with time

男默⼥奴泪。。。

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SLIDE 27

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SLIDE 28

Degradation Tags

SC

cln SC xfp t SC SC

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SLIDE 29

Original Cell Cycle

  • Figure. Original cell cycle

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SLIDE 30

Degradation Tag

Poly-ubiquitin

Hershko, A. (1997). Huibregtse, J. M., Scheffner, M., Beaudenon, S., & Howley, P. M. (1995).

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SLIDE 31

Degradation Tag

PEST

Yamano, H., Tsurumi, C., Gannon, J., & Hunt, T. (1998). Murray, A. W., Solomon, M. J., & Kirschner, M. W. (1989).

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SLIDE 32

Degradation Tag

Destruction-box

Yamano, H., Tsurumi, C., Gannon, J., & Hunt, T. (1998). Murray, A. W., Solomon, M. J., & Kirschner, M. W. (1989).

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SLIDE 33

Degradation Tag

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SLIDE 34

Genetic Circuit v2

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SLIDE 35

Model & Simulation v2

  • Figure. Concentration of XFP change

with time

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SLIDE 36

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SLIDE 37

Targeting Peptides

SC

cln SC xfp t SC SC SC

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SLIDE 38

Targeting Peptides

Grunau, S., Schliebs, W., Linnepe, R., Neufeld, C., Cizmowski, C., Reinartz, B., . . . Erdmann, R. (2009). Drubin, D. G., Mulholland, J., Zhu, Z., & Botstein, D. (1990). Khorasanizadeh, S. (2004). Conklin, D. S., Culbertson, M. R., & Kung, C. (1994). Miyabe, S., Izawa, S., & Inoue, Y. (2001).

  • Figure. Mitochondria
  • Figure. Nucleus
  • Figure. Vacuolar

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SLIDE 39

Targeting Peptides

Grunau, S., Schliebs, W., Linnepe, R., Neufeld, C., Cizmowski, C., Reinartz, B., . . . Erdmann, R. (2009). Drubin, D. G., Mulholland, J., Zhu, Z., & Botstein, D. (1990). Khorasanizadeh, S. (2004). Conklin, D. S., Culbertson, M. R., & Kung, C. (1994). Miyabe, S., Izawa, S., & Inoue, Y. (2001).

  • Figure. Mitochondria
  • Figure. Nucleus
  • Figure. Vacuolar

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SLIDE 40

Genetic Circuit v3

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SLIDE 41

Model & Simulation v3

  • Figure. Concentration of XFP change

with time and space

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SLIDE 42

Model & Simulation v3

  • Figure. Concentration of XFP change

with time and space

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http://www.photobiology.info/Zimmer.html Nature 450, 56-62 (1 November 2007) | doi:10.1038/nature06293

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http://www.photobiology.info/Zimmer.html Nature 450, 56-62 (1 November 2007) | doi:10.1038/nature06293

Microscopic

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SLIDE 45

http://www.photobiology.info/Zimmer.html Nature 450, 56-62 (1 November 2007) | doi:10.1038/nature06293

Microscopic Macroscopic

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SLIDE 46

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SLIDE 47

Synchronization Device

sic1 SC

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SLIDE 48

Sic1 Mechanism

Nugroho, T. T., & Mendenhall, M. D. (1994). Nash, P., Tang, X., Orlicky, S., Chen, Q., Gertler, F. B., Mendenhall, M. D., . . . Tyers, M. (2001).

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SLIDE 49

Genetic Circuit v4

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SLIDE 50

Model of Synchronization

  • Figure. G1 delay by adding galactose to induce Sic1 expression

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SLIDE 51

Model of Synchronization

  • Figure. Synthetic rate and degradation rate influence the length entering plateau stage

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SLIDE 52

Model of Synchronization

  • Figure. Synthetic rate and degradation rate influence the length of plateau stage

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SLIDE 53

Synchronization Simulation

  • Figure. Synchronization simulation

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SLIDE 54

Synchronization Simulation

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SLIDE 55

Synchronization Simulation

不明觉厉。。。

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SLIDE 56

G1 Factory

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SLIDE 57

G1 Factory

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SLIDE 58

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SLIDE 59

Alternative Splicing Reporter & CRISPRi

dCas9 hub1 src1 SC

clb6 SC d-box SC gfp src1 SC tom40 SC caa SC

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SLIDE 60

Alternative Splicing to Show Synchronization

  • Figure. Two splicing form of SRC1 intron
  • Nature. 2011 May 25;474(7350):173-8. doi: 10.1038/nature10143.
  • Cell. 2013 Feb 28;152(5):1173-83. doi: 10.1016/j.cell.2013.02.022.
  • Cell. 2013 Jul 18;154(2):442-51. doi: 10.1016/j.cell.2013.06.044. Epub 2013 Jul 11.

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SLIDE 61

Alternative Splicing to Show Synchronization

  • Figure. Two splicing form of SRC1 intron
  • Figure. CRISPRi
  • Nature. 2011 May 25;474(7350):173-8. doi: 10.1038/nature10143.
  • Cell. 2013 Feb 28;152(5):1173-83. doi: 10.1016/j.cell.2013.02.022.
  • Cell. 2013 Jul 18;154(2):442-51. doi: 10.1016/j.cell.2013.06.044. Epub 2013 Jul 11.

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SLIDE 62

Genetic Circuit v5

  • Figure. Not synchronizing
g l u G1 M S G2 Met28 mOrange tyb-1 arc1 mOrange+PEST1 Clb2 RFP tyb-1 nucleus RFP+PEST2 Met16 ECFP tyb-1 ScSac3 ECFP+PEST3 Clb5 GFP tyb-1 intron vdac1 D-box+GFP MBF SBF
  • GAL
  • Clb5/6
Cdc28 ADH1 ADH1 GAL dCAS9 Spliceosome D-box+GFP+intron+vadc1 D-box+GFP HUB1 ADH1 snr52 sgRNA ADH1 sgRNA HUB1 dCas9

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SLIDE 63 gal G1 M S G2 Met28 mOrange tyb-1 arc1 mOrange+PEST1 Clb2 RFP tyb-1 nucleus RFP+PEST2 Met16 ECFP tyb-1 ScSac3 ECFP+PEST3 Clb5 GFP tyb-1 intron vdac1 D-box+GFP MBF SBF
  • GAL
  • Clb5/6
Cdc28 ADH1 ADH1 GAL dCAS9 Spliceosome D-box+GFP+intron+vadc1 D-box+GFP gal gal gal gal gal gal HUB1 ADH1 snr52 sgRNA ADH1 sgRNA HUB1 dCas9
  • Figure. Synchronizing

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SLIDE 64

Final Construction

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SLIDE 65

Final Construction

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SLIDE 66

Final Construction

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SLIDE 67

Final Construction

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SLIDE 68

Devices

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SLIDE 69

Devices

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SLIDE 70

Experimental Achievements

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SLIDE 72

Part Standardization

RFC[23]

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SLIDE 73

Fluorescent Proteins

  • Figure. Fluorescent proteins: GFP, RFP, mOrange

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SLIDE 74

Fluorescent Proteins

  • Figure. Fluorescent proteins have be modified to RFC[23], and stop codons have

been removed for fusion protein purpose

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SLIDE 75

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SLIDE 76

Promoters

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SLIDE 77

clb6 Promoter

  • Figure. Bright field of budding yeast

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SLIDE 78

clb6 Promoter

  • Figure. Bright field of budding yeast

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SLIDE 79

clb6 Promoter

  • Figure. Bright field of budding yeast

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SLIDE 80
  • Figure. Clb6 promoter for G1 phase has been verified

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SLIDE 81

cln3 Promoter

  • Figure. Flow cytometry to verify S phase promoter cln3

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SLIDE 82

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SLIDE 83

Targeting Peptides

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SLIDE 84
  • Figure. Test for targeting peptides to mitochondria, nucleus and vacuolar

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SLIDE 85

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SLIDE 86

Degradation Tags

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SLIDE 87

Growth Curve

  • Figure. Growing curve of budding yeast
  • Figure. Growing curve of E. coli

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SLIDE 88

Degradation Tag

E.coli

  • Figure. Fluorescence ladder for degradation test devices

Positive Control Negative Control Moderate Fast Very Fast

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SLIDE 89
  • Figure. The test results for degradation tags

Positive Control K1051257 K1051258 K1051259

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SLIDE 90

Degradation Tag

E.coli

  • Figure. Fluorescence intensity calculated by ImageJ and degradation rates

calculation.

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SLIDE 91

Dynamic Measurement

  • Figure. Genetic circuit of K1051258
  • Figure. Microfluidics

Input1: LB Input2: LB +1mM IPTG Output

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SLIDE 92

Degradation Tag

E.coli

  • Figure. The test results of BBa_K1051258 in chip.

A,LB medium,0 minute; B, IPTG medium,9minutes; C, IPTG medium, 15 minutes.

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SLIDE 93

Degradation Tag

E.coli

  • Figure. Average fluorescence intensity of K1051258 measurement

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SLIDE 94

Measurement

  • Figure. RFP with degradation tag’s half life tested by microfluidics and calculated by model

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SLIDE 95

Data Match

  • Figure. Degradation rate result comparison

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SLIDE 96

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SLIDE 97

Synchronization Device

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SLIDE 98

Mutant Work of SIC1

Problems in SOE-PCR so up to now

249bp 628bp Overlap: 22bp

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SLIDE 99

Mutant Work of SIC1

Problems in SOE-PCR so up to now

累觉不爱。。。 249bp 628bp Overlap: 22bp

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SLIDE 100

Synchronization by Microfluidics

Input: YPD medium 90min Input: Dilute YDP medium 60min

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SLIDE 101

Synchronization by Microfluidics

Input: YPD medium 90min Input: Dilute YDP medium 60min

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SLIDE 102

Synchronization Result

  • Figure. All cells are synchronized to G1 phase by using the microfluidics method.

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SLIDE 103

Synchronization Result

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SLIDE 104

Synchronization Result

喜⼤夨普奔~

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SLIDE 105

Ongoing

  • 1. Natural cyclin promoters to be engineered
  • 2. Plasmid copy number issues
  • 3. CRISPRi & Alternative Splicing device

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SLIDE 106

Ongoing

  • 1. Natural cyclin promoters to be engineered
  • 2. Plasmid copy number issues
  • 3. CRISPRi & Alternative Splicing device

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SLIDE 107

Highlights

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SLIDE 108

Highlights

  • 1. v4 system works convincingly

clb6 SC d-box SC gfp tom40 SC caa SC

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SLIDE 109

Highlights

  • 2. Exquisite model
  • 1. v4 system works convincingly

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SLIDE 110

Highlights

  • 3. Perfect match of various measurements
  • 2. Exquisite model
  • 1. v4 system works convincingly

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SLIDE 111

Highlights

  • 3. Perfect match of various measurements
  • 4. Synchronization of budding yeast with microfluidics
  • 2. Exquisite model
  • 1. v4 system works convincingly

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SLIDE 112

Highlights

  • 3. Perfect match of various measurements
  • 4. Synchronization of budding yeast with microfluidics
  • 5. Amazing amount of parts and devices, sequenced and

measured

  • 2. Exquisite model
  • 1. v4 system works convincingly

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SLIDE 113

Highlights

  • 3. Perfect match of various measurements
  • 4. Synchronization of budding yeast with microfluidics
  • 5. Amazing amount of parts and devices, sequenced and

measured

  • 6. Another magic?
  • 2. Exquisite model
  • 1. v4 system works convincingly

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Human Practice

http://hu.wallpapersus.com/cell-division/

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SLIDE 115

Human Practice

  • - Another Magic As Cell Cycle
  • Incubator -- M phase
  • Guest iGEMer -- G1 phase
  • App: iGEMagic -- S phase
  • Friendship -- G2 phase

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SLIDE 116

iGEM Development World

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SLIDE 117

iGEM Development World

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SLIDE 118

iGEM Development China

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iGEM Development China

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SLIDE 120

Incubator

  • M Phase

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SLIDE 121

Guest iGEMers

  • G1 phase

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Guest iGEMers

  • G1 phase

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Guest iGEMers

  • G1 phase

⼗卂动然拒。。。

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Guest iGEMers

  • G1 phase

⼗卂动然拒。。。

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Guest iGEMers

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SLIDE 126

Guest iGEMers

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SLIDE 127

Guest iGEMers

  • Promoter Team: Lin Bohan, Hou Mingxia, Guo Zhiyi,
  • Targeting Peptide Team: Ou Zhen, Wong Hiu Lam,
  • Degradation Tags Team: Zhang

Yi,

  • Synchronization Team: Wang

Yixiong

  • Microfluidics Team: Li

Yiman,

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SLIDE 128

App: iGEMagic

  • S phase

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SLIDE 129

App: iGEMagic

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SLIDE 130

App: iGEMagic

  • Get latest news of iGEM and BGIC

pushed

  • Apply for membership of BGIC

consortium

  • Become guest iGEMer during summer
  • Get access to our summer courses
  • Afford assistance to the consortium
  • Discuss project ideas with us

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SLIDE 131

Friendship

  • G2 Phase

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SLIDE 132

Friendship

  • G2 Phase

Workshop: Shenzhen_BGIC_ATCG Shenzhen_BGIC_0101 SCUT SYSU-China SYSU-Software SCAU-China SUSTC-Shenzhen-A SUSTC-Shenzhen-B

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SLIDE 133

Friendship

  • G2 Phase

Workshop: Shenzhen_BGIC_ATCG Shenzhen_BGIC_0101 SCUT SYSU-China SYSU-Software SCAU-China SUSTC-Shenzhen-A SUSTC-Shenzhen-B Share of: Equipment Idea Material

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Friendship

  • G2 Phase

Workshop: Shenzhen_BGIC_ATCG Shenzhen_BGIC_0101 SCUT SYSU-China SYSU-Software SCAU-China SUSTC-Shenzhen-A SUSTC-Shenzhen-B Share of: Equipment Idea Material

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Acknowledgment

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Thank You! Shenzhen_BGIC_ATCG

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Supplementary

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Example of Protein-Protein Interaction NET1

  • Figure. NET1p concentration varies during cell cycle

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Phase-Specific Promoter

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Parameter Scan

  • Figure. Two splicing forms of pre-mRNA and their ratio

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Input & Output:

GFP+intron+Targeting Peptide

  • utput

input Sic1 protein CRISPRi Splice ratio Result galactose 1 1 85-15 Sync + most GFP everywhere glucose 40-60 Nosync + most GFP mitochondria

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Input & Output:

GFP+intron+mOrange

  • utput

input Sic1 protein CRISPRi Splice ratio Result galactose 1 1 85-15 Sync + Green glucose 40-60 Nosync + Yellow

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Mechanism of Targeting Peptides

  • Figure. Mitochondria import pathway
  • Figure. Peroxisom import pathway

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Contrast Unadjusted

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Targeting Peptides Parts

  • Vacuolar: 1 (K1051115)
  • Mitochondria: 10 (K1051100-K1051109)
  • Centrosome: 4 (K1051110-K1051113)
  • Nucleus: 1 (K1051114)
  • Plasma Membrane: 1 (K1051117)
  • Peroxisome: 1 (K1051118)
  • Actin: 1 (K1051116)

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Incubated Team

  • SCUT: Gong Jianhui, Zhang Junjie
  • UESTC_Life, UESTC: Deng Yang
  • BIT: Meng Zijian
  • Shenzhen_FSLS: Chen Pengxuan
  • Shenzhen_SZMS: Yu Huizhi

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Guest iGEMer

Wei Renyao: Penn University Ou Zhen: Imperial College Li Yiman: Drexel University, working in the microfluidics group Lin Bohan: University of Washington Wong Hiu Lam: Hong Kong Polytechnic University, joining in the targeting peptide group Wang Yixiong: University of Alberta Zhang Yi: Southern Medical Universtiy Seven Students from Shanxi Medical University：Guo Zhiyin, Hou Mingxia,Jiang Xinxin, Li Haiying, Lu Hong,Wang Dandan, Zhang Dawei

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Attribution

Work Design Gone Jianhui as a team leader and K2 as our instructor draft our project "Cell Magic". Experiments Conduct Li Xiang, Xu Yanhui, Wu Fanzi, Yu Yang from SCU: responsible for targeting peptide, XFP, terminators design and experiments. Chen Shihong,Gu Chenguang, Lu Yanping, Liang Jiale, from South China University of Technology, are responsible for the alternative splicing Src1 and CRISPRi design and experiments. Zhu Shuang, Lin Kequan from Wuhan University and Wei Wei, Zheng Bingwei, Lan Yi in HUST work together for the promotors. Guan Rui from SEU and He Funan, Wang Rui, Li Lin, Zhang Yaolei from UESTC made their efforts to the degradation parts. Zhou Wanling, Zhang Aiping, Li Dongdong, the undergraduates in AHMU, joined the part one Chen Yichun of SCNU, Zhong Na of JNU work for the microfulidics part. The SCNU student: Chen Chengxuan, Lin Qiongfen, Xie Qiaolin, worked for the cell cycle regulator Sic1 Modeling Liu Shuang from SEU, Zhou Yang from SCUT, Jinchun Zhang from SCU Wiki Construction Zhang Jinchun and Zhou Yang

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