Genome Assembly Sample Prepara1on Fragments Sequencing - PowerPoint PPT Presentation

Genome ¡Assembly ¡

Sample ¡Prepara1on ¡ Fragments ¡ Sequencing ¡ Reads ¡ ACGTAGAATACGTAGAA Assembly ¡ ACGTAGAATCGACCATG GGGACGTAGAATACGAC ACGTAGAATACGTAGAAACAGATTAGAGAG… Con1gs ¡

Paired-­‑End ¡Reads ¡ Genomic ¡segment ¡ Genome fragments Get ¡two ¡reads ¡from ¡ each ¡segment ¡ ~100 bp ~100 bp

Read ¡Coverage ¡ C • Length ¡of ¡genomic ¡segment: ¡L ¡ • Number ¡of ¡reads: ¡n ¡ • Length ¡of ¡each ¡read: ¡l ¡ Coverage ¡ ¡C ¡= ¡n ¡l ¡/ ¡L ¡

Fragment ¡Assembly ¡ • Cover ¡region ¡with ¡~7-­‑fold ¡redundancy ¡ • Overlap ¡reads ¡and ¡extend ¡to ¡reconstruct ¡the ¡ original ¡genomic ¡region ¡ ¡

Challenges ¡in ¡Fragment ¡Assembly ¡ • Repeats: ¡a ¡ major ¡problem ¡for ¡fragment ¡assembly ¡ • > ¡50% ¡of ¡human ¡genome ¡are ¡repeats: ¡ ¡ ¡-­‑ ¡over ¡1 ¡million ¡ Alu ¡repeats ¡(about ¡300 ¡bp) ¡ ¡ ¡-­‑ ¡about ¡200,000 ¡LINE ¡repeats ¡(1000 ¡bp ¡and ¡longer) ¡ Repeat Repeat Repeat Green ¡and ¡blue ¡fragments ¡are ¡interchangeable ¡when ¡ ¡ assembling ¡repe11ve ¡DNA ¡

Triazzle: ¡A ¡Fun ¡Example ¡ The ¡puzzle ¡looks ¡simple ¡ ¡ BUT ¡there ¡are ¡repeats!!! ¡ ¡ The ¡repeats ¡make ¡it ¡very ¡ difficult. ¡ ¡ Try ¡it ¡– ¡only ¡$7.99 ¡at ¡ www.triazzle.com ¡

Repeat ¡Types ¡ • Low-­‑Complexity ¡DNA ¡(e.g. ¡ATATATATACATA…) ¡ • Microsatellite ¡repeats ¡ ¡ ¡ ¡ ¡(a 1 …a k ) N ¡where ¡k ¡~ ¡3-­‑6 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡(e.g. ¡CAGCAGTAGCAGCACCAG) ¡ • Transposons/retrotransposons ¡ ¡ ¡ ¡ – SINE ¡ ¡ ¡ ¡Short ¡Interspersed ¡Nuclear ¡Elements ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡(e.g., ¡ Alu : ¡~300 ¡bp ¡long, ¡10 6 ¡copies) ¡ – LINE ¡ ¡ ¡ ¡Long ¡Interspersed ¡Nuclear ¡Elements ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡~500 ¡-­‑ ¡5,000 ¡bp ¡long, ¡200,000 ¡copies ¡ ¡ • Gene ¡Families ¡ ¡ ¡genes ¡duplicate ¡& ¡then ¡diverge ¡ • Segmental ¡duplicaCons ¡ ¡~very ¡long, ¡very ¡similar ¡copies ¡

Fragment ¡Assembly ¡ • ComputaConal ¡Challenge: ¡ assemble ¡ individual ¡short ¡fragments ¡(reads) ¡into ¡a ¡single ¡ genomic ¡sequence ¡( “ superstring ” ) ¡ ¡ • Un1l ¡late ¡1990s ¡the ¡shotgun ¡fragment ¡ assembly ¡of ¡human ¡genome ¡was ¡viewed ¡as ¡ intractable ¡problem ¡ ¡ ¡ ¡

Shortest ¡Superstring ¡Problem ¡ • Problem: ¡Given ¡a ¡set ¡of ¡strings, ¡find ¡a ¡shortest ¡ string ¡that ¡contains ¡all ¡of ¡them ¡ • Input: ¡ ¡Strings ¡ s 1 , ¡s 2 ,…., ¡s n ¡ • Output: ¡ ¡A ¡string ¡ s ¡that ¡contains ¡all ¡strings ¡ ¡ ¡ ¡ ¡s 1 , ¡s 2 ,…., ¡s n ¡as ¡substrings, ¡such ¡that ¡the ¡length ¡ of ¡ s ¡is ¡minimized ¡ ¡ • Complexity: ¡ ¡NP-­‑complete ¡ ¡ • Note: ¡ ¡this ¡formula1on ¡does ¡not ¡take ¡into ¡account ¡ sequencing ¡errors ¡

Whole ¡Genome ¡Shotgun ¡Sequencing ¡ Genome ¡ Genome ¡amplified ¡and ¡sliced ¡into ¡ smaller ¡fragments ¡(>=600bp) ¡ Build ¡consensus ¡sequence ¡from ¡overlap ¡

Overlap-­‑Layout-­‑Consensus ¡ ¡ Assemblers: ¡ARACHNE, ¡PHRAP, ¡CAP, ¡TIGR, ¡CELERA ¡ Overlap: ¡ ¡find ¡poten1ally ¡overlapping ¡reads ¡ Layout: ¡ ¡merge ¡reads ¡into ¡con1gs ¡and ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡con1gs ¡into ¡supercon1gs ¡ Consensus: ¡ ¡derive ¡the ¡DNA ¡sequence ¡ ..ACGATTACAATAGGTT.. and ¡correct ¡read ¡errors ¡

Overlap ¡ • Each ¡read ¡is ¡compared ¡to ¡that ¡of ¡every ¡other ¡read, ¡in ¡both ¡the ¡ forward ¡and ¡reverse ¡complement ¡orienta1ons. ¡ ¡ • As ¡such, ¡the ¡overlap ¡computa1on ¡step ¡is ¡a ¡very ¡1me ¡intensive ¡ step ¡– ¡especially ¡if ¡the ¡set ¡of ¡reads ¡is ¡very ¡large. ¡ • For ¡example, ¡the ¡whole ¡genome ¡shotgun ¡assembly ¡of ¡ Drosophila ¡had ¡about ¡3 ¡x ¡10^6 ¡reads ¡of ¡500 ¡bases, ¡requiring ¡ roughly ¡10^13 ¡comparisons ¡(Deonier ¡ et ¡al., ¡ 2010). ¡ • Even ¡on ¡today's ¡computers, ¡running ¡that ¡many ¡comparisons ¡is ¡ imprac1cal, ¡so ¡seeded ¡algorithm ¡are ¡used ¡

Overlapping ¡Reads ¡ • Sort ¡all ¡k-­‑mers ¡in ¡reads ¡ • Find ¡pairs ¡of ¡reads ¡sharing ¡a ¡k-­‑mer ¡ • Extend ¡to ¡full ¡alignment ¡– ¡throw ¡away ¡if ¡not ¡>95% ¡ similar ¡ TACA TAGATTACACAGATTAC T GA || ||||||||||||||||| | || TAGT TAGATTACACAGATTAC TAGA

Finding ¡Overlapping ¡Reads ¡ Create ¡local ¡mul1ple ¡alignments ¡from ¡the ¡ overlapping ¡reads. ¡ TAGATTACACAGATTACTGA TAGATTACACAGATTACTGA TAG TTACACAGATTATTGA TAGATTACACAGATTACTGA TAGATTACACAGATTACTGA TAGATTACACAGATTACTGA TAG TTACACAGATTATTGA TAGATTACACAGATTACTGA

Finding ¡Overlapping ¡Reads ¡ ¡ Correct ¡errors ¡using ¡mul1ple ¡alignment. ¡ • Find ¡loca1ons ¡where ¡there ¡is ¡a ¡devia1on ¡in ¡ which ¡1% ¡of ¡the ¡data ¡diverge ¡from ¡the ¡rest. ¡ • Make ¡those ¡posi1ons ¡agree ¡with ¡the ¡rest. ¡ TAGATTACACAGATTACTGA TAGATTACACAGATTACTGA TAG TTACACAGATTATTGA TAGATTACACAGATTACTGA TAGATTACACAGATTACTGA

Build ¡the ¡Overlap ¡Graph ¡ • Overlap ¡graph: ¡the ¡nodes ¡represent ¡actual ¡ reads, ¡and ¡edges ¡represent ¡overlaps ¡between ¡ these ¡reads. ¡ ¡ • Thus, ¡the ¡genome ¡assembly ¡becomes ¡ equivalent ¡to ¡finding ¡a ¡path ¡through ¡the ¡graph ¡ that ¡visits ¡each ¡node ¡exactly ¡once ¡( i.e., ¡ a ¡ Hamiltonian ¡path ). ¡ 17 ¡

An ¡overlap ¡graph. ¡Nodes ¡are ¡complete ¡reads ¡and ¡ edges ¡connect ¡reads ¡that ¡overlap. ¡Note ¡that ¡in ¡an ¡ actual ¡graph, ¡reads ¡and ¡overlaps ¡would ¡be ¡much ¡ larger. ¡ ¡ 18 ¡

Layout ¡ • Finding ¡a ¡Hamiltonian ¡path ¡through ¡the ¡ overlap ¡graph ¡is ¡not ¡a ¡trivial ¡task. ¡ ¡ • In ¡order ¡to ¡decrease ¡the ¡size ¡of ¡the ¡graph, ¡the ¡ OLC ¡assembly ¡graph ¡is ¡simplified ¡in ¡the ¡layout ¡ stage, ¡where ¡segments ¡of ¡the ¡graph ¡are ¡ compressed ¡into ¡con1gs ¡ • Thus, ¡we ¡have ¡to ¡find ¡a ¡manner ¡to ¡decrease ¡ the ¡complexity ¡of ¡the ¡graph ¡

Graph ¡Reduc1on ¡ • A ¡con1g ¡would ¡be ¡a ¡subgraph, ¡or ¡a ¡group ¡of ¡ nodes, ¡with ¡many ¡connec1ons ¡among ¡each ¡ other, ¡as ¡they ¡all ¡overlap ¡with ¡each ¡other ¡and ¡ refer ¡to ¡the ¡same ¡sequence ¡(A ¡and ¡B). ¡ ¡ • Once ¡a ¡subgraph ¡has ¡been ¡iden1fied, ¡these ¡ nodes ¡and ¡edges ¡are ¡compressed ¡into ¡one ¡ node, ¡or ¡a ¡con1g, ¡thereby ¡simplifying ¡the ¡ graph ¡(C) ¡ ¡ 20 ¡

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Separa1ng ¡Con1gs ¡ • There ¡are ¡two ¡classes ¡of ¡con1gs, ¡ unique ¡ conCgs ¡and ¡ repeat ¡conCgs . ¡ ¡ • Unique ¡con1gs ¡are ¡composed ¡of ¡reads ¡that ¡ can ¡be ¡unambiguously ¡assembled. ¡ ¡ • Repeat ¡con1gs ¡are ¡con1gs ¡with ¡an ¡abnormally ¡ high ¡read ¡coverage ¡or ¡connected ¡to ¡an ¡ abnormally ¡large ¡number ¡of ¡other ¡con1gs ¡ 22 ¡

Separa1ng ¡Con1gs ¡ Normal density Too dense: Overcollapsed? Inconsistent links: Overcollapsed?

Crea1ng ¡Scaffolds ¡ • Unique ¡con1gs ¡are ¡joined ¡into ¡larger ¡sequences, ¡ called ¡ scaffolds . ¡ ¡ • The ¡most ¡common ¡way ¡to ¡piece ¡con1gs ¡into ¡ scaffolds ¡is ¡through ¡ mate-­‑pair ¡informaCon . ¡ ¡ • With ¡mate-­‑pair ¡informa1on, ¡assemblers ¡can ¡ iden1fy ¡how ¡far ¡reads ¡and ¡unique ¡con1gs ¡should ¡ be ¡apart ¡from ¡each ¡other. ¡ ¡ – e.g. ¡if ¡a ¡2kb ¡fragment ¡of ¡a ¡genome ¡were ¡sequenced ¡ 100bp ¡on ¡each ¡end, ¡then ¡we ¡know ¡these ¡reads ¡and ¡ the ¡unique ¡con1gs ¡they ¡are ¡in ¡should ¡be ¡roughly ¡2kb ¡ apart. ¡ ¡ 24 ¡