DTU DENMARK 09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD DTU - - PowerPoint PPT Presentation

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

Outline

Introduc)on ¡

• 1. The ¡Redoxilator: ¡Gene3c ¡Design ¡
• 2. Experimental ¡Results ¡
• 3. Perspec3ves ¡and ¡Applica3ons ¡
• 4. The ¡USER ¡Fusion ¡Assembly ¡Standard ¡
• 5. PHUSER ¡soIware ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

• ¡Iden3fy ¡and ¡study ¡parts ¡
• ¡Assembly ¡of ¡parts ¡(in ¡silico) ¡
• ¡Model ¡in ¡silico ¡– ¡make ¡adjustments ¡
• ¡Chemically ¡synthesis ¡

AD ¡ Sensor ¡ Reporter ¡

Genetic design - approach

Redoxilator ¡design ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

AD ¡ Sensor ¡ Reporter ¡

Genetic design

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

Mechanism of the Redoxilator

Redoxilator ¡design ¡

• ¡REX ¡
• ¡Bind ¡DNA ¡
• ¡Interact ¡with ¡NAD+ ¡and ¡NADH ¡
• ¡NADH ¡inhibits ¡DNA ¡binding ¡ability ¡
• ¡Ac3vate ¡transcrip3on ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

Modelling – TF activation

NAD+ ¡/NADH ¡ ¡ ¡ TF ¡ac)vity ¡ ¡

Redoxilator ¡design ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

Modelling – GFP level

NAD+ ¡/NADH ¡ ¡ ¡ GFP ¡level ¡ ¡

Redoxilator ¡design ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

! " # $ % & ' ( ) ! #!! %!! '!! )!! "!!! "#!! *+,-./010/ 23*0.456 ! " # $ % & ' ( ) ! !7& " "7& # 8."!

&

9:;./010/ 23*0.456 ! " # $ % & ' ( ) ! & 8."!

!"

,-<=./010/ 23*0.456

NAD+

Total NAD(H) = 5mM

mRNA GFP

Modelling

Redoxilator ¡design ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

! "# "! $# $! %# &'( ! )*"#

!"

*+,-.*/010/ 2340*567 ! "# "! $# $! %# # #'! " 289:;<83=23>:*?9<2>8*9<23132@ 2340*567 ! "# "! $# $! %# # " $ )*"#

!

ABC*/010/*5D7 2340*567

A B C

NAD+ ¡ ¡ TF ¡ac)vity ¡ GFP ¡level ¡ ¡

Modelling

Redoxilator ¡design ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

Results: Reporter gene

Redoxilator ¡result ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

Galactose ¡ Glucose ¡+ ¡ Galactose ¡ Glucose ¡ Ethanol ¡

Results: The Redoxilator

Redoxilator ¡result ¡

Carbon ¡source ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

Results: Redoxilator effect

Redoxilator ¡result ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

Results: Redoxilator effect

Redoxilator ¡result ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

Future perspectives

SwaI ¡USERsite ¡ Kanamycin ¡ ¡ resistance ¡gene ¡ 2 ¡mikron ¡ (yeast ¡origin ¡of ¡ ¡ replica3on) ¡ URA3 ¡ (yeast ¡marker) ¡ Redoxilator ¡ AsiSI ¡USERsite ¡ SwaI ¡USER ¡site ¡ AsiSI ¡restric3on ¡site ¡ NotI ¡USER ¡site ¡ NotI ¡restric3on ¡site ¡ PacI ¡restric3on ¡site ¡ PacI ¡restric3on ¡site ¡ Destabilized ¡GFP ¡

Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡

Redoxilator ¡ construct ¡

8851bp ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

• Fusion ¡to ¡His-­‑tag ¡to ¡characterize ¡binding ¡affinity ¡to ¡ROB ¡
• Mutagenesis ¡on ¡NAD+ ¡binding ¡site ¡and ¡characterize ¡binding ¡

affinity ¡ ¡change ¡

Future perspectives

Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

• In ¡vivo ¡redox ¡sensor ¡
• Test ¡redox ¡level ¡in ¡different ¡yeast ¡strains ¡
• Applica)ons ¡in ¡cancer ¡research ¡
• Gene ¡therapy ¡with ¡DNA ¡coding ¡for ¡the ¡Redoxilator ¡controlling ¡

the ¡transcrip)on ¡of ¡a ¡cancer ¡drug ¡

• Improved ¡product ¡forma)on ¡in ¡chemostat ¡
• High ¡produc)vity ¡can ¡be ¡maintained ¡for ¡long ¡periods ¡of ¡)me ¡
• Over ¡)me ¡chemostat ¡produc)on ¡decreases ¡and ¡the ¡en)re ¡

fermenta)on ¡needs ¡to ¡be ¡restarted. ¡

Applications

Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

USER fusion – The assembly standard

USER ¡fusion ¡ standard ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

USER cloning

USER ¡fusion ¡ standard ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

USER cloning

USER ¡fusion ¡ standard ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

The USER cassette

USER ¡fusion ¡ standard ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

USER cloning

USER ¡fusion ¡ standard ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

USER cloning

USER ¡fusion ¡ standard ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

USER fusion

USER ¡fusion ¡ standard ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

Advantages ¡using ¡USER ¡fusion ¡

Easy ¡design ¡(e.g ¡independence ¡of ¡restric)on ¡sites ¡in ¡insert) ¡ High ¡efficiency ¡ High ¡fidelity ¡ Robust ¡ Low ¡cost ¡ LiXle ¡handling ¡ Easy ¡design ¡of ¡own ¡vector ¡

USER fusion – The assembly standard

USER ¡fusion ¡ standard ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

PHUSER

• Ensuring ¡unique ¡fusion ¡tails ¡
• Op)mizing ¡Tm ¡for ¡PCR ¡
• Fusion ¡of ¡several ¡biobricks ¡in ¡one ¡reac)on ¡

hXp://2009.igem.org/Team:DTU_Denmark/USERprogram ¡

PHUSER ¡

Primer ¡Help ¡for ¡USER ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

PHUSER

PHUSER ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

PHUSER

PHUSER ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

PHUSER

PHUSER ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

PHUSER

PHUSER ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡ PHUSER ¡

USER assembly standard Save ¡)me ¡cloning ¡-­‑ ¡avoid ¡costly ¡synthesis ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡

Achievements

• 1. Designed ¡and ¡tested ¡redox ¡sensing ¡device ¡
• 2. USER ¡Assembly ¡Standard: ¡BBF ¡RFC ¡39 ¡
• 3. Constructed ¡and ¡characterized ¡4 ¡Biobricks ¡

Yeast ¡op3mized ¡GFP ¡ Fast ¡degradable ¡yGFP ¡ Fast ¡degrada3on ¡protein ¡tag ¡ USER ¡casse^e ¡biobrick ¡

DTU DENMARK ‘09 THE REDOXILATOR & THE USER FUSION STANDARD

Introduc)on ¡ ¡ Redoxilator ¡design ¡ ¡ Redoxilator ¡result ¡ Perspec)ves ¡and ¡ applica)ons ¡ USER ¡fusion ¡ standard ¡ PHUSER ¡ PHUSER ¡

QUESTIONS? Thank you for your attention

Acknowledgements Sponsors

Associate professor Kiran R. Patil Post Doc Bjarne Gram Hansen PhD student Simon Carlsen