DOLORS: Versatile Strategy for Internal Labeling and Domain - PowerPoint PPT Presentation

DOLORS: Versatile Strategy for Internal Labeling and Domain Localization in Electron Microscopy Ian J. MacRae The Scripps Research Institute November 2012 1

dsRNA triggers the RNAi pathway dsRNA Dicer dicing siRNA Ago loading RISC target mRNA recognition slicing 2

3 steps in dsRNA processing by Dicer Dicer dsRNA 1) dsRNA binding 2) dsRNA cleavage 3) translocation 3

Dicer is a 220 kDa, multi-doman protein N C RNase RNase platform DUF TRBP DEXDc HELICc PAZ ? dsRBD IIIa IIIb 283 BD 4

Previous studies have ascribed specific activities to discrete domains N C RNase RNase platform DUF TRBP DEXDc HELICc PAZ ? dsRBD IIIa IIIb 283 BD binds cleaves translocates dsRNA dsRNA on dsRNA ends 5

Crystal structures of many domains (or homologous domains) have been established N C RNase RNase platform DUF TRBP DEXDc HELICc PAZ ? dsRBD IIIa IIIb 283 BD binds cleaves translocates dsRNA dsRNA on dsRNA ends 6

How do these domains assemble in 3D to make a functional dicing machine? N C RNase RNase platform DUF TRBP DEXDc HELICc PAZ ? dsRBD IIIa IIIb 283 BD binds cleaves translocates dsRNA dsRNA on dsRNA ends 7

Negatively Stained Dicer-TRBP Complex Negatively Stained Dicer-TRBP Complex 8

3D ¡reconstruc,on ¡of ¡Human ¡Dicer-­‑TRBP ¡ (20 ¡Å ¡resolu,on) ¡ 150 Å 150 ¡Å 9 9

3D ¡reconstruc,on ¡of ¡Human ¡Dicer-­‑TRBP ¡ (20 ¡Å ¡resolu,on) ¡ head back arm base 10 10

11 11

N C RNase RNase platform DUF TRBP DEXDc HELICc PAZ ? dsRBD IIIa IIIb 283 BD ? 12 12

Negatively Stained Dicer-TRBP Complex 13

A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site Mark Howarth 1 , Daniel J-F Chinnapen 1,4 , Kimberly Gerrow 2,4 , Pieter C Dorrestein 3 , Melanie R Grandy 1 , Neil L Kelleher 3 , Alaa El-Husseini 2 & Alice Y Ting 1 | VOL.3 NO.4 | APRIL 2006 | NATURE METHODS streptavadin X X X biotin ligase biotin biotin (BirA ) LNDILEAQKIEWHE LNDILEAQKIEWHE + streptavadin LNDILEAQKIEWHE Your Your Your “Avi Tag” Protein Protein Protein biotinylated protein streptavadin-labeled protein 14

Label ¡PAZ ¡domain ¡with ¡streptavadin DEXDc platform RNase RNase TRBP HELICc DUF PAZ IIIa IIIb BD dsRBD 283 ? C N streptavadin 15

Labeling Dicer with Streptavidin partially purified AviTagged Dicer 16

Labeling Dicer with Streptavidin partially purified AviTagged Dicer * biotinylate * 17

Labeling Dicer with Streptavidin partially purified AviTagged Dicer * biotinylate * * Add streptavidin (His 6 -tagged) * 18

Labeling Dicer with Streptavidin partially purified AviTagged Dicer * biotinylate * * Add streptavidin (His 6 -tagged) * * Select for streptavidin-Dicer (Ni-chelate) * 19

Labeling Dicer with Streptavidin partially purified AviTagged Dicer * biotinylate * * Add streptavidin (His 6 -tagged) * * Select for streptavidin-Dicer (Ni-chelate) * * Purify from free streptavidin (size exclusion) * 20

2D ¡Class ¡averages ¡have ¡round ¡ density ¡extending ¡from ¡the ¡head ¡ 21

3D ¡reconstruc,ons ¡overlaid ¡on ¡ the ¡unlabeled ¡structure 22

ANachment ¡points ¡map ¡to ¡front ¡ of ¡the ¡head 23

PAZ ¡domain ¡is ¡in ¡the ¡front ¡of ¡the ¡ ¡ head PAZ ¡domain (dsRNA ¡end ¡recogni,on) 24

Label ¡plaPorm ¡domain ¡with ¡streptavadin platform DEXDc RNase RNase TRBP HELICc PAZ DUF IIIa IIIb BD dsRBD 283 ? C N streptavadin 25

2D ¡Class ¡averages ¡have ¡density ¡ extending ¡from ¡the ¡back ¡of ¡the ¡head ¡ 26

Overlay ¡3D ¡reconstruc,ons ¡on ¡the ¡ unlabeled ¡map 27

PlaPorm ¡domain ¡maps ¡to ¡the ¡back ¡of ¡ the ¡head 28

Dock ¡plaPorm-­‑PAZ ¡structure ¡into ¡EM ¡map PAZ label sites platform label sites PAZ platform 29

Dock ¡plaPorm-­‑PAZ ¡structure ¡into ¡EM ¡map biotinylated loops PAZ label sites platform label sites PAZ platform 30

Dock ¡plaPorm-­‑PAZ ¡structure ¡into ¡EM ¡map 31

Dock ¡plaPorm-­‑PAZ ¡structure ¡into ¡EM ¡map 32

Label ¡RNase ¡IIIb ¡domain ¡with ¡streptavadin DEXDc platform RNase RNase TRBP HELICc DUF PAZ IIIa IIIb BD dsRBD 283 ? C N streptavadin 33

Long ¡loop ¡(45 ¡residue) ¡allows ¡a ¡lot ¡of ¡mobility 34

Long ¡loop ¡(45 ¡residue) ¡allows ¡a ¡lot ¡of ¡mobility 35

Shorter ¡loop ¡(25 ¡residue) ¡displays ¡less ¡movement 36

Shorter ¡loop ¡(25 ¡residue) ¡displays ¡less ¡movement 37

Map ¡many ¡posi,ons 38

Helicase PAZ RNase Ruler 39

dsRNA dsRNA end cleavage binding Helicase PAZ RNase Ruler 40

dsRNA dsRNA end cleavage binding Helicase ~60 Å = 21 bp PAZ RNase Ruler 41

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Acknowledgments Bridget Carragher Clint Potter Pick-Wei Lau Keelan Guiley Novartis Research Foundation Pew Scholars Program in Biomedical Sciences Baxter Foundation National Institute of Health 44