DOLORS: Versatile Strategy for Internal Labeling and Domain - - PowerPoint PPT Presentation

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DOLORS: Versatile Strategy for Internal Labeling and Domain Localization in Electron Microscopy Ian J. MacRae The Scripps Research Institute November 2012 1 dsRNA triggers the RNAi pathway dsRNA Dicer dicing siRNA Ago loading RISC

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SLIDE 1

DOLORS: Versatile Strategy for Internal Labeling and Domain Localization in Electron Microscopy

Ian J. MacRae The Scripps Research Institute November 2012

1

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SLIDE 2

Dicer loading Ago target mRNA recognition dicing slicing RISC siRNA dsRNA

dsRNA triggers the RNAi pathway

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SLIDE 3

Dicer

2) dsRNA cleavage 1) dsRNA binding 3) translocation

dsRNA 3 steps in dsRNA processing by Dicer

3

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SLIDE 4

PAZ DUF 283 DEXDc RNase IIIa RNase IIIb dsRBD HELICc TRBP BD N C platform

Dicer is a 220 kDa, multi-doman protein

?

4

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SLIDE 5

PAZ DUF 283 DEXDc RNase IIIa RNase IIIb dsRBD HELICc TRBP BD N C platform

cleaves dsRNA binds dsRNA ends translocates

  • n dsRNA

Previous studies have ascribed specific activities to discrete domains

?

5

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SLIDE 6

PAZ DUF 283 DEXDc RNase IIIa RNase IIIb dsRBD HELICc TRBP BD N C platform

cleaves dsRNA binds dsRNA ends translocates

  • n dsRNA

Crystal structures of many domains (or homologous domains) have been established

?

6

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SLIDE 7

PAZ DUF 283 DEXDc RNase IIIa RNase IIIb dsRBD HELICc TRBP BD N C platform

cleaves dsRNA binds dsRNA ends translocates

  • n dsRNA

How do these domains assemble in 3D to make a functional dicing machine?

?

7

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SLIDE 8

Negatively Stained Dicer-TRBP Complex Negatively Stained Dicer-TRBP Complex

8

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SLIDE 9

3D ¡reconstruc,on ¡of ¡Human ¡Dicer-­‑TRBP ¡ (20 ¡Å ¡resolu,on) ¡

150 ¡Å

9

150 Å

9

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SLIDE 10

10

back head arm base

3D ¡reconstruc,on ¡of ¡Human ¡Dicer-­‑TRBP ¡ (20 ¡Å ¡resolu,on) ¡

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SLIDE 11

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SLIDE 12

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PAZ DUF 283 DEXDc RNase IIIa RNase IIIb dsRBD HELICc TRBP BD N C platform

?

?

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SLIDE 13

Negatively Stained Dicer-TRBP Complex

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SLIDE 14

A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site

Mark Howarth 1, Daniel J-F Chinnapen1,4, Kimberly Gerrow2,4, Pieter C Dorrestein3, Melanie R Grandy 1, Neil L Kelleher 3, Alaa El-Husseini 2 & Alice Y Ting 1

NATURE METHODS

| VOL.3 NO.4| APRIL 2006 |

LNDILEAQKIEWHE

Your Protein

“Avi Tag” biotin ligase (BirA)

LNDILEAQKIEWHE

Your Protein biotin

biotinylated protein + streptavadin

LNDILEAQKIEWHE

Your Protein biotin

X X X

streptavadin streptavadin-labeled protein 14

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SLIDE 15

PAZ DUF 283 DEXDc RNase IIIa RNase IIIb dsRBD HELICc TRBP BD N C

streptavadin

Label ¡PAZ ¡domain ¡with ¡streptavadin

platform ?

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SLIDE 16

Labeling Dicer with Streptavidin

partially purified AviTagged Dicer

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SLIDE 17

Labeling Dicer with Streptavidin

partially purified AviTagged Dicer biotinylate

* *

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SLIDE 18

Labeling Dicer with Streptavidin

partially purified AviTagged Dicer biotinylate Add streptavidin (His6-tagged)

* * * *

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SLIDE 19

Labeling Dicer with Streptavidin

partially purified AviTagged Dicer biotinylate Add streptavidin (His6-tagged) Select for streptavidin-Dicer (Ni-chelate)

* * * * * *

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SLIDE 20

Labeling Dicer with Streptavidin

partially purified AviTagged Dicer biotinylate Add streptavidin (His6-tagged) Select for streptavidin-Dicer (Ni-chelate) Purify from free streptavidin (size exclusion)

* * * * * * * *

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SLIDE 21

2D ¡Class ¡averages ¡have ¡round ¡ density ¡extending ¡from ¡the ¡head ¡

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SLIDE 22

3D ¡reconstruc,ons ¡overlaid ¡on ¡ the ¡unlabeled ¡structure

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SLIDE 23

ANachment ¡points ¡map ¡to ¡front ¡

  • f ¡the ¡head

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SLIDE 24

PAZ ¡domain ¡is ¡in ¡the ¡front ¡of ¡the ¡ ¡ head

PAZ ¡domain (dsRNA ¡end ¡recogni,on)

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SLIDE 25

PAZ DUF 283 DEXDc RNase IIIa RNase IIIb dsRBD HELICc TRBP BD N C

Label ¡plaPorm ¡domain ¡with ¡streptavadin

platform ?

streptavadin

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SLIDE 26

2D ¡Class ¡averages ¡have ¡density ¡ extending ¡from ¡the ¡back ¡of ¡the ¡head ¡

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SLIDE 27

Overlay ¡3D ¡reconstruc,ons ¡on ¡the ¡ unlabeled ¡map

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SLIDE 28

PlaPorm ¡domain ¡maps ¡to ¡the ¡back ¡of ¡ the ¡head

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SLIDE 29

Dock ¡plaPorm-­‑PAZ ¡structure ¡into ¡EM ¡map

platform label sites PAZ label sites PAZ platform

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SLIDE 30

Dock ¡plaPorm-­‑PAZ ¡structure ¡into ¡EM ¡map

biotinylated loops PAZ platform platform label sites PAZ label sites

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SLIDE 31

Dock ¡plaPorm-­‑PAZ ¡structure ¡into ¡EM ¡map

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SLIDE 32

Dock ¡plaPorm-­‑PAZ ¡structure ¡into ¡EM ¡map

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SLIDE 33

PAZ DUF 283 DEXDc RNase IIIa RNase IIIb dsRBD HELICc TRBP BD N C

Label ¡RNase ¡IIIb ¡domain ¡with ¡streptavadin

platform ?

streptavadin

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SLIDE 34

Long ¡loop ¡(45 ¡residue) ¡allows ¡a ¡lot ¡of ¡mobility

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SLIDE 35

Long ¡loop ¡(45 ¡residue) ¡allows ¡a ¡lot ¡of ¡mobility

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SLIDE 36

Shorter ¡loop ¡(25 ¡residue) ¡displays ¡less ¡movement

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SLIDE 37

Shorter ¡loop ¡(25 ¡residue) ¡displays ¡less ¡movement

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Map ¡many ¡posi,ons

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Helicase Ruler PAZ RNase

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PAZ RNase Helicase Ruler

dsRNA end binding dsRNA cleavage

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PAZ RNase Helicase Ruler

dsRNA end binding dsRNA cleavage ~60 Å = 21 bp

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Acknowledgments

Pick-Wei Lau Keelan Guiley Clint Potter Bridget Carragher

Novartis Research Foundation Pew Scholars Program in Biomedical Sciences Baxter Foundation National Institute of Health

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