Assessing Differential Gene Expression from RNA-Seq Data Yanming Di - - PowerPoint PPT Presentation

Assessing Differential Gene Expression from RNA-Seq Data

Yanming Di

Department of Statistics Oregon State University

June 15, 2011, OSU, Corvallis

with acknowledgement to Dan Schafer, Jason Cumbie and Jeff Chang

Y Di (OSU) Assessing DE from RNA-Seq June 15, 2011, OSU, Corvallis 1 / 23

RNA-Seq Data

RNA-Seq Work Flow

1 Biological question 2 Experimental design 3 RNA-Sequencing: sample preparation, sequencing 4 Alignment, assignment to features (genes, exomes, etc.) 5 Exploratory statistical analyses: 1 Testing for differential gene expression 2 Regression analysis (to deal with covariates) 3 Gene enrichment tests and gene oncology analysis 4 Integration with proteomic and metabolomic data 6 Experimental verification/Biological confirmation

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RNA-Seq Data

RNA-Seq Data Structure (two-group comparison)

Group A A A B B B Replicates A1 A2 A3 B1 B2 B3 AT1G01010 46 64 60 35 77 40 AT1G01020 43 39 49 43 45 32 AT1G01030 27 35 20 16 24 26 AT1G01040 66 25 90 72 43 64 AT1G01050 67 45 60 49 78 90 AT1G01060 21 8 15 2 AT1G01070 9 20 1 16 34 6 AT1G01080 127 98 184 170 191 382 AT1G01090 171 116 453 291 346 563 . . . Total 2.1M 1.3M 3.5M 1.9M 1.9M 3.3M

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RNA-Seq Data

Naive Statistical Tests for Differential Gene Expression

1 Two-sample t-test:

• Estimate the group means.
• Estimate the variance.
• The result is significant if the mean difference is large relative to the

variance.

Underlying assumptions: 1) the distribution is normal or 2) the sample size is large.

2 Test based on Poisson distribution for count data.

Assumption: 3) the variance is the same as the mean. None of 1), 2) or 3) is appropriate for RNA-Seq data with biological replicates.

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RNA-Seq Data

Challenges

1 A very large number of genes to be tested (26, 222 in the

Arabidopsis example):

• Need to control for multiple testing.

2 Count variability that cannot be modeled with commonly-used

probability distributions, such as binomial and Poisson:

• Test based on Poisson model will give too many false positive

results.

3 A necessarily small number (2 or 3 in each group) of biological

replicates due to resource constraints (cost, labor, . . . ):

• Normal approximation (two sample t-test) will not work.
• Permutation test will not work (no power).
• Difficult to estimate the model parameter for each gene

separately.

4 A wide range of expression levels:

• Mean-variance relationship will change with mean level.

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Overdispersion and Negative Binomial Model

Mean-Variance Plot of the Arabidopsis Data

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 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Y Di (OSU) Assessing DE from RNA-Seq June 15, 2011, OSU, Corvallis 6 / 23

Poisson

Overdispersion and Negative Binomial Model

Negative Binomial(NB) Model

NB is a commonly-used distribution for modeling extra-Poisson variation: Poisson distribution: Var(Yj) =µ. NB distribution: Var(Yj) = µ + φµ2. Yj: RNA-Seq read count mapped to the gene in replicate sample j. For each gene, the NB model use a dispersion parameter, φ, to model the extra-Poisson variation between biological replicates j = 1, . . . , J.

Y Di (OSU) Assessing DE from RNA-Seq June 15, 2011, OSU, Corvallis 7 / 23

Overdispersion and Negative Binomial Model

Negative Binomial: Gamma Mixture of Poisson

Yj: RNA-Seq read count mapped to the gene in replicate sample j. If

1 Yj from each sample can be model as Poisson (technical

variability): Yj|Zj ∼ Poisson(Zj),

2 but the Poisson mean Zj varies between biological replicates

(biological variability): Zj ∼ Gamma(µ, shape = 1 φ). then Yj is NB with mean µ and dispersion φ: Yj ∼ NB(µ, φ). and Var(Yj) = µ + φµ2.

Y Di (OSU) Assessing DE from RNA-Seq June 15, 2011, OSU, Corvallis 8 / 23

Overdispersion and Negative Binomial Model

Mean-variance Plot of the Arabidopsis Data and Simulated NB Data

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 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1 10 100 10000 1e+00 1e+02 1e+04 1e+06 1e+08 (c) mean variance Y Di (OSU) Assessing DE from RNA-Seq June 15, 2011, OSU, Corvallis 9 / 23

Overdispersion and Negative Binomial Model

Exact NB Test

The NB model allows an exact test (does not rely on large-sample asymptotics) for comparing two group means. If the library sizes (column sums) are the same, the exact test is based

• n the total read counts s1 and s2 in each group:

Among all possible pairs of counts (a, b) with the same total count (a + b = s1 + s2), which pairs are as or more extreme than the observed pair (s1, s2)? The p-value of the exact test is the total probability of all such pairs and can be computed exactly.

Y Di (OSU) Assessing DE from RNA-Seq June 15, 2011, OSU, Corvallis 10 / 23

Models for the Dispersion Parameter

Two Types of Errors

Causes of excess Type I Errors (false positives higher than specified level): Cause Solution Inadequate model (e.g. normal

• r Poisson).

NB distribution. Fail to adjust for multiple testing. Report false discovery rate (FDR).

Y Di (OSU) Assessing DE from RNA-Seq June 15, 2011, OSU, Corvallis 11 / 23

Models for the Dispersion Parameter

Two Types of Errors

Causes of Type II Errors (lack of power): Cause Solution Suboptimal test (e.g. permuta- tion test). Exact NB test. Noisy data. Do better experiments. To a certain degree, no solution. Small sample size ? Solution to ?: pull information across genes. Assumption: Genes with similar mean expression have similar dispersion.

Y Di (OSU) Assessing DE from RNA-Seq June 15, 2011, OSU, Corvallis 12 / 23

Models for the Dispersion Parameter

Mean-Dispersion Plot

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 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Y Di (OSU) Assessing DE from RNA-Seq June 15, 2011, OSU, Corvallis 13 / 23

Models for the Dispersion Parameter

Models for the Dispersion Parameter

i: indexes genes with a wide range of expression levels. Native models:

• Poisson. Dispersion is 0 (not adequate).
• edgeR (default). Dispersion is constant (not adequate).

More realistic models:

• NBP

. log(φi) is a linear function of log(µi): log(φi) = α0 + α1 log(µi).

• DESeq. φi is a smooth function of µi (estimated using

nonparametric smoothing).

• edgeR (trend). φi is an weighted average of genewise dispersion

estimate and nonparametric smoothing estimate.

Y Di (OSU) Assessing DE from RNA-Seq June 15, 2011, OSU, Corvallis 14 / 23

Simulations and Case Study

Simulation Setup

Compare tests procedures for assessing DE:

• Mimic Arabidopsis data and assume a NBP model for the

dispersion: log(φi) = log 1.5 − 0.5 log µi.

• r equivalently

σ2

i = µi + 1.5µ1.5 i

.

• Simulate 1000 data sets.
• For each data set, ran tests, compute p-values, call DE based on

a specified FDR (0.05).

• Record the actual FDR (false positive / detected) and TDR

(detected true DE / total true DE). Want FDR less than 0.05 and TDR as high as possible.

Y Di (OSU) Assessing DE from RNA-Seq June 15, 2011, OSU, Corvallis 15 / 23

Simulations and Case Study

Results

Test FDR TDR Poisson 0.937 0.999 t (log) 0.180 0.008 Welch t (log) 0.034 0.000 limma t (log) 0.237 0.073 edgeR (common) 0.119 0.293 edgeR (moderated) 0.099 0.335 edgeR (trend) 0.023 0.540 DESeq 0.038 0.816 NBP 0.030 0.812

Y Di (OSU) Assessing DE from RNA-Seq June 15, 2011, OSU, Corvallis 16 / 23

Simulations and Case Study

The Arabidopsis Example

• A pilot RNA-Seq data set to study the defense response of

Arabidopsis to infection by bacteria.

• Treatment: We challenged leaves of Arabidopsis with the

defense-eliciting ∆hrcC mutant of Pseudomonas syringae pathovar tomato DC3000.

• Control: We also infiltrated leaves of Arabidopsis with 10 mM

MgCl2 as a mock inoculation.

• Alignment and mapping: GENE-counter.
• Three biological replicates in each group and ∼ 26000 genes.

Y Di (OSU) Assessing DE from RNA-Seq June 15, 2011, OSU, Corvallis 17 / 23

Simulations and Case Study

MA Plot

+ + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 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Y Di (OSU) Assessing DE from RNA-Seq June 15, 2011, OSU, Corvallis 18 / 23

Simulations and Case Study

Mean-variance Plot

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Y Di (OSU) Assessing DE from RNA-Seq June 15, 2011, OSU, Corvallis 19 / 23

Simulations and Case Study

Mean-Dispersion Plot

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10000 1e−04 1e−03 1e−02 1e−01 1e+00 Average Gene Counts Estimate of NB2 Dispersion Parameter edgeR, trend DESeq, default DESeq, nn=0.5 DESeq, deg=1 NBP

Y Di (OSU) Assessing DE from RNA-Seq June 15, 2011, OSU, Corvallis 20 / 23

Conclusions

• Poisson model is NOT adequate for RNA-Seq data.
• For a single gene, NB distribution capture the extra-Poisson

variation in RNA-Seq data using a dispersion parameter.

• For genes with a wide range of expression levels, the genewise

dispersion will vary with the mean.

• With a large number of genes, we can gain statistical power by

modeling the mean-dispersion dependency (pulling information across genes).

• NBP

, DESeq, edgeR (trend) model the dispersion parameter as functions of the mean.

• DE Tests based on NBP

, DESeq, or edgeR (trend) models are powerful and have the FDR under control.

• The NBP method is implemented in the R package NBPSeq.

Comments and feedback are welcome!

Y Di (OSU) Assessing DE from RNA-Seq June 15, 2011, OSU, Corvallis 21 / 23

Future Work

• Regression models for multi-group comparison and incorporating

covariates.

• Goodness-of-fit tests.
• High-level analyses (clustering, etc.)
• Integrate other omics data.
• Other things that biologists need.

Y Di (OSU) Assessing DE from RNA-Seq June 15, 2011, OSU, Corvallis 22 / 23

Future Work

Thanks to Brian and all of you! Questions?

Y Di (OSU) Assessing DE from RNA-Seq June 15, 2011, OSU, Corvallis 23 / 23