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Welcome to our Presentation! We are team AUC TURKEY, a group of 9 students from Ankara. We as Ahmet Ulusoy College are proud to be here in iGEM and in front of you all!

Human Introduction Project Practices

Our ¡Project: ¡

Finding ¡an ¡issue: ¡ ¡ Cooling ¡ ¡ • A ¡synthe0c ¡solu0on ¡to ¡the ¡cooling ¡problem ¡ • Breakdown ¡of ¡urea ¡ for ¡cooling ¡ • Synthesis ¡of ¡ urease ¡ Finding ¡a ¡synthe6c ¡ solu6on: ¡ • Efficient ¡and ¡ organic ¡reac6on ¡ Urease ¡Enzyme ¡ • RNA ¡Thermometer ¡ as ¡ control ¡mechanism ¡ • Preventa0on ¡of ¡cooldown ¡ in ¡low ¡temperatures ¡ • Controlled ¡and ¡ efficient ¡system ¡ Control ¡Mechanism: ¡ RNA ¡Thermometer ¡ ¡

RNA Thermometers • RNA ¡Thermometers ¡are ¡ thermosensors ¡ ¡ • They ¡ regulate ¡ gene ¡ expression ¡ by ¡ temperature-­‑ induced ¡changes ¡ • They ¡take ¡part ¡in ¡ heat ¡or ¡cold ¡shock ¡ but ¡also ¡take ¡part ¡ in ¡other ¡roles ¡ They ¡ consist ¡ of ¡ a ¡ temperature-­‑sensi6ve ¡ secondary ¡ structure ¡which ¡contains ¡the ¡ribosome-­‑binding ¡site. ¡The ¡ ribosome-­‑binding ¡site ¡can ¡be ¡masked ¡or ¡unmasked ¡by ¡a ¡ simple ¡ temperature ¡ shiE, ¡ thereby ¡ repressing ¡ or ¡ inducing ¡transla0on. ¡

Urease Urease ¡ is ¡ a ¡ nickel-­‑containing ¡ enzyme ¡ that ¡ catalyses ¡ the ¡ hydrolysis ¡of ¡urea ¡ into ¡ammonia ¡and ¡carbon ¡dioxide. ¡ Our ¡urease ¡originates ¡from ¡the ¡ Sporosarcina ¡pasteurii . ¡As ¡all ¡ bacterial ¡ ureases, ¡ our ¡ part ¡ is ¡ also ¡ composed ¡ of ¡ three ¡ ¡ subunits ¡we ¡named ¡as ¡ Urease ¡A, ¡B ¡and ¡C . ¡ ¡ Urease A B C Urea + H 2 O Urease ¡ Ammonia + CO 2

Mechanism In ¡ our ¡ system, ¡ we ¡ aKached ¡ Urease ¡ at ¡ the ¡ end ¡ of ¡ the ¡ RNA ¡ Thermometer. ¡ This ¡ mechanism ¡prevents ¡urease ¡synthesis ¡in ¡low ¡temperatures ¡and ¡allows ¡temperature ¡ in ¡higher ¡temperatures. ¡This ¡way, ¡cooling ¡is ¡done ¡effec6vely ¡and ¡when ¡necessary. ¡ Over Under RNA 32 ° C 32 ° C Thermometer Shine- Ribosome Dalgarno binds to Sequence SD Urease Urease Ribosome At Elevated Temperatures Urease Production At Low Temperatures No Translation

P A R T S In ¡our ¡project, ¡we ¡used ¡a ¡total ¡of ¡3 ¡parts. ¡ ¡ 1 ¡of ¡them ¡is ¡the ¡backbone ¡of ¡our ¡main ¡system ¡and ¡the ¡last ¡2 ¡parts ¡were ¡used ¡as ¡ control. ¡ ROSE ¡– ¡Urease ¡A, ¡B, ¡C ¡Composite ¡Part: ¡ The ¡conversion ¡of ¡urea ¡ into ¡ammonia ¡and ¡CO 2 ¡involves ¡3 ¡different ¡enzymes ¡which ¡are ¡ named ¡as ¡Urease ¡A, ¡B ¡and ¡C. ¡In ¡our ¡part, ¡there ¡is ¡an ¡insulator ¡ and ¡ an ¡ RBS ¡ in ¡ between ¡ every ¡ Urease ¡ subunit ¡ in ¡ order ¡ to ¡ relieve ¡the ¡bacteria ¡of ¡synthesis ¡even ¡in ¡low ¡temperatures. ¡ RBS ¡ RBS ¡ Promoter ¡ Urease ¡A ¡ Urease ¡B ¡ Urease ¡C ¡ ROSE ¡ Insulator ¡ Insulator ¡ Thermometer ¡

ROSE Promoter RFP Thermometer IbpB Promoter RFP Thermometer

Results ¡ For ¡us ¡to ¡show ¡that ¡our ¡Project ¡is ¡working, ¡we ¡ primarily ¡ are ¡ required ¡ to ¡ show ¡ that ¡ the ¡ RNA ¡ Thermometers ¡are ¡showing ¡the ¡necessary ¡RBS ¡ property. ¡ Our ¡ studies ¡ and ¡ experiments ¡ were ¡ focused ¡on ¡proving ¡that ¡the ¡RNA ¡Thermometer ¡ works ¡and ¡for ¡that ¡we ¡tested ¡the ¡RFP ¡aKached ¡ RNA ¡Thermometer ¡parts. ¡So ¡let’s ¡take ¡a ¡look… ¡ ¡

Step ¡1: ¡Cloning ¡ We ¡started ¡off ¡by ¡transforma6ng ¡with ¡ our ¡IbpB ¡– ¡RFP ¡and ¡ROSE ¡– ¡RFP ¡parts ¡to ¡ our ¡TOP10 ¡E. ¡coli. ¡The ¡plate ¡of ¡IbpB ¡– ¡RFP ¡ had ¡red ¡colonies ¡but ¡plate ¡of ¡ROSE ¡– ¡RFP ¡ had ¡only ¡white ¡colonies. ¡ The ¡electrophoresis ¡results ¡showed ¡that ¡both ¡ of ¡our ¡parts ¡are ¡the ¡right ¡base ¡length. ¡ According ¡to ¡the ¡results, ¡the ¡cloning ¡was ¡ successful. ¡ ¡

Step ¡2: ¡Liquid ¡Culture ¡Examina0on ¡ Before ¡experimen6ng ¡in ¡different ¡temperatures, ¡we ¡were ¡required ¡to ¡check ¡if ¡the ¡RNA ¡ Thermometers ¡ showed ¡ RBS ¡ func6onality. ¡ In ¡ this ¡ measurement, ¡ we ¡ cul6vated ¡ our ¡ IbpB-­‑RFP ¡and ¡ROSE-­‑RFP ¡parts ¡plus ¡RFP ¡part ¡in ¡37 ¡C ¡for ¡conforma6on. ¡ ¡ We ¡centrifuged ¡the ¡cultures ¡at ¡14,000 ¡rpm ¡and ¡acquired ¡the ¡result ¡as ¡you ¡can ¡see ¡ below. ¡ ¡ In ¡this, ¡the ¡IbpB ¡and ¡RFP ¡came ¡out ¡as ¡red ¡however ¡the ¡ROSE ¡part ¡didn’t ¡turn ¡out ¡red. ¡ ¡

Step ¡3: ¡Examina0on ¡in ¡Variable ¡Temperatures ¡ For ¡us ¡to ¡find ¡out ¡if ¡there ¡is ¡RFP ¡produced, ¡we ¡prepared ¡several ¡liquid ¡culture ¡ specimen. ¡ ¡ To ¡examine ¡if ¡the ¡RNA ¡Thermometer ¡works ¡in ¡different ¡temperature ¡condi6ons, ¡ we ¡ini6ally ¡used ¡2 ¡different ¡temperatures ¡to ¡cul6vate ¡our ¡bacteria. ¡We ¡selected ¡ the ¡temperatures ¡as ¡42 ¡and ¡25 ¡C. ¡ Using ¡the ¡spectrophotometer, ¡we ¡brought ¡our ¡bacteria ¡to ¡0.3 ¡OD. ¡ Then ¡we ¡seperated ¡our ¡E. ¡coli ¡into ¡two ¡samples. ¡The ¡first ¡sample ¡was ¡incubated ¡ in ¡42 ¡C ¡for ¡24 ¡hours ¡and ¡the ¡second ¡was ¡incubated ¡in ¡25 ¡C ¡for ¡36 ¡hours. ¡ AEerwards ¡we ¡examined ¡the ¡pellets. ¡

Step ¡4: ¡Cultures ¡Under ¡Microplate ¡ Fluorescense ¡Spectrophotometer ¡ We ¡transferred ¡the ¡cultures ¡to ¡96-­‑well ¡plate. ¡We ¡did ¡a ¡measurement ¡with ¡ ¡ Biorad ¡and ¡the ¡result ¡was ¡the ¡same ¡as ¡our ¡expecta6ons ¡and ¡wishes. ¡We ¡used ¡ 8 ¡different ¡samples ¡with ¡1 ¡of ¡IbpB ¡and ¡1 ¡of ¡RFP ¡in ¡4 ¡different ¡temperatures. ¡ 17 ¡ºC ¡ 27 ¡ºC ¡ 37 ¡ºC ¡ 42 ¡ºC ¡ All ¡these ¡steps ¡lead ¡to ¡the ¡following ¡ideas: ¡ ¡ • IbpB ¡shows ¡ RBS ¡property . ¡ ¡ • IbpB ¡also ¡shows ¡ thermosensing ¡capability ¡ and ¡works ¡as ¡an ¡RNA ¡Thermometer. ¡ • The ¡IbpB ¡Thermometer ¡is ¡a ¡ weaker ¡RBS ¡ than ¡B0034. ¡ ¡

Step ¡5: ¡Fluorescent ¡Microscope ¡ The ¡fluorescent ¡microscope ¡was ¡elected ¡to ¡measure ¡the ¡RFP ¡concentra6on. ¡ ¡ Through ¡ taking ¡ advantage ¡ of ¡ the ¡ fact ¡ that ¡ there ¡ is ¡ extra ¡ glowing ¡ in ¡ RFP ¡ containing ¡ bacteria, ¡ we ¡ calculated ¡ the ¡ difference ¡ in ¡ red ¡ light ¡ exposure ¡ and ¡ analyzed ¡the ¡concentra6on ¡through ¡the ¡use ¡of ¡computer ¡programs. ¡ ¡ RFP ¡42 ¡C ¡% ¡40.39 ¡ RFP ¡25 ¡C ¡% ¡34.67 ¡ IbpB ¡42 ¡C ¡% ¡35.22 ¡ IbpB ¡25 ¡C ¡% ¡16.71 ¡

Let’s ¡look ¡at ¡our ¡

Introducing ¡People ¡iGEM ¡ This ¡year, ¡we ¡did ¡many ¡ac6vi6es ¡in ¡order ¡to ¡introduce ¡people ¡iGEM. ¡ We ¡visited ¡several ¡organiza6ons ¡and ¡ins6tu6ons. ¡ Turkish ¡Olympiads ¡ Ankara ¡Büyükşehir ¡Belediyesi ¡ (Ankara ¡Municipality) ¡ Yüzüncü ¡Yıl ¡Hospital ¡ Bank ¡Asya ¡

Introducing ¡People ¡iGEM ¡ E-­‑Biko ¡ Dreamline ¡ TUBITAK ¡Girişimcilik ¡ve ¡Yenilikçilik ¡Yarışması ¡ ¡ Atlan0k ¡Awards ¡Ceremony ¡ (The ¡Scien5fic ¡and ¡Technological ¡Research ¡Council ¡of ¡ Turkey ¡Entrepreneurship ¡and ¡Innova5on ¡Compe55on) ¡