Trea1ng Type I Diabetes A SYNTHETIC BIOLOGY APPROACH iGEM - - PowerPoint PPT Presentation

LETHBRIDGE ¡CANADA ¡

Trea1ng ¡Type ¡I ¡Diabetes ¡

A ¡SYNTHETIC ¡BIOLOGY ¡APPROACH ¡

iGEM ¡High ¡School ¡Jamboree ¡– ¡June ¡30th, ¡2012 ¡

Type ¡I ¡Diabetes ¡ ¡

• Type ¡1 ¡diabetes ¡mellitus ¡-­‑ ¡a ¡disease ¡

characterized ¡by ¡abnormally ¡high ¡blood ¡ glucose ¡concentra1ons ¡ ¡

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hOp://www.dreams1me.com/stock-­‑photo-­‑stock-­‑photo-­‑glucose-­‑molecule-­‑image11063520 ¡

Type ¡I ¡Diabetes ¡ ¡

So ¡what’s ¡the ¡deal? ¡

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25 ¡

12 ¡ 1.4 ¡ 500 ¡ Prevalence ¡(%) ¡ Prevalence ¡ ¡(%) ¡ Per ¡1.000 ¡people ¡(aged ¡20-­‑79) ¡ Expendeture ¡(USD$ ¡Billions) ¡ Prevalence ¡of ¡ Diabetes ¡among ¡ adults ¡(Aged ¡20 ¡– ¡79) ¡ Prevalence ¡of ¡ Diabetes ¡in ¡adults ¡ (Aged ¡20 ¡– ¡79) ¡ Mortality ¡rates ¡ ¡ in ¡adults ¡ ¡ Total ¡healthcare ¡ expenditure ¡ (2011) ¡

20 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡80 ¡

0 ¡ 0 ¡ 0 ¡ 0 ¡

High ¡Income ¡ Upper ¡– ¡Middle ¡ Middle ¡– ¡Lower ¡ Lower ¡Income ¡

Type ¡I ¡Diabetes ¡ ¡

Numbers ¡

hOp://www.nature.com/nature/journal/v485/n7398_supp/full/485S2a.html#/f2 ¡

LETHBRIDGE ¡CANADA ¡ 146 ¡ Million ¡ People ¡ ¡

High ¡Income ¡ Upper ¡– ¡Middle ¡ Lower ¡-­‑ ¡Middle ¡ Low ¡Income ¡

Insulin ¡

hOp://health.howstuffworks.com/diseases-­‑condi1ons/diabetes/diabetes1.htm ¡

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Raises ¡Blood ¡ Sugar ¡ High ¡Blood ¡ Sugar ¡ Lowers ¡ Blood ¡Sugar ¡ Low ¡Blood ¡ Sugar ¡

Our ¡Project ¡

Ribosomal ¡ ¡ Binding ¡Site ¡ Double ¡ Terminator ¡ Promoter ¡ Mlc ¡Binding ¡Site ¡

Glucose ¡Detec1on ¡Construct: ¡

Red ¡ Fluorescent ¡ Protein ¡

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Our ¡Project ¡

Ribosomal ¡ Binding ¡Site ¡ Signal ¡ Sequence ¡ Red ¡ Fluorescent ¡ Protein ¡ Double ¡ Terminator ¡ pLac ¡Promoter ¡

Insulin ¡Construct: ¡

LETHBRIDGE ¡CANADA ¡

Our ¡Project ¡

Ribosomal ¡ ¡ Binding ¡Site ¡ Signal ¡ Sequence ¡ Double ¡ Terminator ¡ Promoter ¡ Mlc ¡Binding ¡ Site ¡ Red ¡ Fluorescent ¡ Protein ¡

Full ¡Construct: ¡

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Glucose ¡Sensing ¡ ¡ Sensory ¡Transduc1on ¡

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Glc

P EIICBGlc Mlc ¡ Cytoplasmic ¡Membrane ¡

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P

Glc

EIICBGlc Mlc ¡

Glucose ¡Sensing ¡ Sensory ¡Transduc1on ¡

Cytoplasmic ¡Membrane ¡

Transcription

Gel ¡confirma1on ¡of ¡ ¡ J23100-­‑Mlc ¡

Gel ¡of ¡promoter ¡J23100 ¡ with ¡Mlc ¡protein ¡binding ¡ site ¡ ¡ ¡ Plasmid: ¡pSB1C3 ¡ Removed ¡by ¡PCR ¡with ¡ prefix ¡and ¡suffix ¡ expected ¡size ¡=100bps ¡

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J23100-­‑Mlc ¡

Gel ¡conforma1on ¡of ¡ ¡ J23100-­‑Mlc ¡with ¡rbs-­‑RFP-­‑dt ¡

PCR ¡of ¡samples ¡ to ¡determine ¡if ¡ I13507 ¡was ¡ inserted ¡with ¡ J23100-­‑Mlc ¡in ¡ pSB1C3 ¡(also ¡ confirmed ¡by ¡ restric1on ¡ diges1on) ¡ ¡

1C ¡ ¡ ¡ ¡ ¡1C ¡ ¡ ¡ ¡2C ¡ ¡ ¡ ¡2C ¡ ¡ ¡ ¡3C ¡ ¡ ¡ ¡3C ¡ ¡ ¡ ¡4C ¡ ¡ ¡4C ¡ ¡ ¡ ¡ ¡5C ¡ ¡ ¡ ¡5C ¡ ¡ ¡ ¡6C ¡ ¡ ¡6C ¡ ¡ ¡ ¡100bp ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ladder ¡

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J23100-­‑Mlc-­‑RBS-­‑RFP-­‑DT ¡ J230100-­‑Mlc ¡

Glucose ¡Sensing ¡Assay ¡

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Cells ¡with ¡cons1tu1vely ¡ ac1vated ¡ ¡promoter ¡ expressing ¡RFP ¡(posi1ve ¡ control) ¡ Cells ¡with ¡ glucose ¡sensing ¡ construct ¡

Glucose ¡Sensing ¡Assay ¡– ¡Red ¡ Fluorescent ¡Protein ¡

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Insulin ¡Secre1on ¡Construct ¡

pLac ¡Promoter ¡ Ribosomal ¡ Binding ¡Site ¡ Signal ¡ Sequence ¡ Red ¡ Fluorescent ¡ Protein ¡ Double ¡ Terminator ¡

Construct ¡1: ¡K331009 ¡E1010 ¡(RFP) ¡Fusion ¡ Construct ¡2: ¡TAT ¡E1010 ¡(RFP) ¡

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TAT ¡ABC ¡Protein ¡

What ¡is ¡it? ¡

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• ¡Three ¡

Transmembrane ¡ Proteins ¡

• Transport ¡

directed ¡proteins ¡ with ¡the ¡Twin ¡ Arginine ¡signal ¡ sequence ¡

TAT ¡A ¡ TAT ¡C ¡ TAT ¡B ¡ TAT ¡RFP ¡ PP ¡ PP ¡ PP ¡ CM ¡ CM ¡ CM ¡ CP ¡ CP ¡ CP ¡

Image ¡refrenced ¡from: ¡DeBuck, ¡E., ¡Lammertyn, ¡E. ¡and ¡Anne, ¡J ¡(2008) ¡The ¡Importance ¡of ¡the ¡Twin ¡Arginine ¡Transloca1on ¡pathway ¡for ¡bacterial ¡virulence. ¡Trends ¡Microbiol ¡

What ¡We ¡Expected ¡

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Grow ¡Cells ¡ Put ¡Culture ¡in ¡ microcentrifuge ¡ tube ¡and ¡spin. ¡ Spun ¡down ¡ cells, ¡extract ¡ supernatant ¡ Use ¡spectrophotometer ¡

• n ¡supernatant ¡

What ¡Happened ¡

Grow ¡Cells ¡ Put ¡Culture ¡in ¡ microcentrifuge ¡ tube ¡and ¡spin. ¡ Spun ¡down ¡cells, ¡ extracted ¡ supernatant ¡to ¡test ¡ for ¡florescence ¡ ¡ Use ¡spectrophotometer ¡

• n ¡supernatant ¡

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Our ¡Tubes ¡

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Control ¡ Control ¡ Experimental ¡ Experimental ¡

Hypothesis ¡

We ¡Believe… ¡

• TAT ¡E1010 ¡transported ¡across ¡the ¡Cytoplasmic ¡

Membrane ¡via ¡TAT ¡ABC ¡proteins ¡

• Accumulates ¡within ¡the ¡Periplasmic ¡Space ¡with ¡no ¡way ¡

through ¡the ¡Periplasmic ¡Membrane ¡ ¡

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Cytoplasmic ¡Membrane ¡ Periplasmic ¡Space ¡ TAT ¡ RFP ¡ TAT ¡ RFP ¡ TAT ¡ RFP ¡ Periplasmic ¡Membrane ¡

Insulin ¡ ¡ Overexpression ¡

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Future ¡Direc1ons ¡

• Confirm ¡Hypothesis ¡
• Find ¡a ¡way ¡to ¡direct ¡

the ¡Insulin ¡Construct ¡ through ¡the ¡ Periplasmic ¡ Membrane ¡

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Parts ¡Contributed ¡

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hOp://6keysop1malhealth.blogspot.ca/2012/01/share-­‑no-­‑insulin-­‑pens.html ¡ hOp://depositphotos.com/4748799/stock-­‑photo-­‑Diabe1c-­‑Glucometer-­‑Blood-­‑sugar-­‑level-­‑tes1ng-­‑kit.html ¡ hOp://www.natural-­‑weight-­‑loss-­‑health.com/diabetes-­‑and-­‑nutri1on.html ¡ hOp://da.wikipedia.org/wiki/Fil:Diverse_e_Coli.png ¡

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Delivery ¡

The ¡biocapsule ¡is ¡comprised ¡

• f ¡carbon ¡nanotubes. ¡It ¡

would ¡contain ¡par1cular ¡cells ¡ and ¡even ¡medicinal ¡

• substances. ¡ ¡It’s ¡1ny, ¡inserted ¡

into ¡the ¡skin, ¡non-­‑reac1ve, ¡ fast-­‑ac1ng ¡and ¡virtually ¡

• indestruc1ble. ¡

hOp://www.spacefacts.de/groups/p_large/english/nasa.htm ¡ hOp://www.windingroad.com/ar1cles/blogs/the-­‑hot-­‑list-­‑volume-­‑25/ ¡

Biocapsule ¡

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hOp://www.nanoscience.ch/nccr/nanoscience/pictures/gallery_01/gallery_01_03 ¡ hOp://www.spacefacts.de/groups/p_large/english/nasa.htm ¡ hOp://spacebiosciences.arc.nasa.gov/staff/david-­‑loqus ¡

• Dr. ¡David ¡Loqus ¡

Title: ¡Scien1st ¡ Organiza1on: ¡ ¡Space ¡Biosciences ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡Research ¡Branch ¡

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Human ¡Prac1ces ¡

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• Newspaper ¡Ar1cle ¡
• Poster ¡Distribu1on ¡
• Survey ¡
• Interview/Teacher ¡Dialogue ¡

Human ¡Prac1ces ¡

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Newspaper ¡

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“We ¡started ¡discussing ¡ different ¡projects,” ¡ “Now ¡we’ve ¡ decided ¡on ¡using ¡

• E. ¡coli ¡to ¡fight ¡

diabetes.” ¡ “Synthe1c ¡ biology ¡brings ¡ together ¡science, ¡ engineering, ¡ technology ¡and ¡ mathema1cs.” ¡ Zentner, ¡C. ¡(2012, ¡June ¡30) ¡Young ¡science ¡dream ¡team. ¡Lethbridge ¡Herald. ¡

Posters ¡

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Survey ¡

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What ¡is ¡your ¡age? ¡

R e s u l t s ¡

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80% ¡ 16-­‑18 ¡ 15% ¡ 18+ ¡ 5% ¡ 13-­‑15 ¡ 50% ¡ Female ¡ 50% ¡ Male ¡

What ¡is ¡your ¡gender? ¡

Survey ¡

How ¡well-­‑informed ¡about ¡synthe1c ¡ biology ¡do ¡you ¡feel? ¡

R e s u l t s ¡

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38.9% ¡ Agree ¡ 48.1% ¡ Disagree ¡ 13% ¡ Neutral ¡

Survey ¡

How ¡do ¡you ¡feel ¡about ¡E. ¡coli? ¡

Survey ¡

R e s u l t s ¡

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32% ¡ Neutral ¡ 33% ¡ Nega1ve ¡ 35% ¡ Posi1ve ¡

Is ¡type-­‑one ¡diabetes ¡an ¡illness ¡we ¡should ¡ look ¡toward ¡curing? ¡

Survey ¡

R e s u l t s ¡

LETHBRIDGE ¡CANADA ¡

3.8% ¡ Disagree ¡ 87% ¡ Agree ¡ 9.3% ¡ Neutral ¡

Do ¡you ¡feel ¡it ¡is ¡acceptable ¡to ¡manipulate ¡ bacterial ¡DNA ¡for ¡human ¡benefit? ¡

Survey ¡

R e s u l t s ¡

LETHBRIDGE ¡CANADA ¡

85.1% ¡ Agree ¡ 9.3% ¡ Disagree ¡ 5.6% ¡ Neutral ¡

Is ¡it ¡ethically ¡and ¡morally ¡okay ¡to ¡inject ¡ gene1cally ¡modified ¡bacteria ¡into ¡our ¡ body ¡for ¡our ¡benefit? ¡

Survey ¡

R e s u l t s ¡

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62.9% ¡ Agree ¡ 14.8% ¡ Disagree ¡ 22.2% ¡ Neutral ¡

Would ¡you ¡allow ¡gene1cally ¡modified ¡ bacteria ¡to ¡be ¡introduced ¡to ¡your ¡body? ¡

Survey ¡

R e s u l t s ¡

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50% ¡ Agree ¡ 35.2% ¡ Neutral ¡ 14.8% ¡ Disagree ¡

Interviews ¡

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When ¡I ¡say ¡“synthe1c ¡biology” ¡what ¡comes ¡to ¡ mind? ¡

• “…manipula1ng ¡things ¡in ¡the ¡lab ¡to ¡get ¡things ¡

that ¡don't ¡exist ¡naturally ¡in ¡nature.” ¡

• “…engineering ¡life ¡forms ¡from ¡scratch ¡or ¡

engineering ¡the ¡genome ¡of ¡a[n ¡organism]...” ¡

• “…crea1ng ¡or ¡changing ¡living ¡organisms ¡in ¡the ¡

laboratory.” ¡

Interviews ¡

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What ¡comes ¡to ¡mind ¡when ¡I ¡say ¡“E. ¡coli?” ¡

• “Raw ¡chicken.” ¡
• “…There ¡are ¡many ¡strains ¡of ¡it ¡but ¡there ¡is ¡
• nly ¡one ¡strain ¡that ¡is ¡harmful.” ¡
• “…food ¡poisoning, ¡but ¡I ¡also ¡know ¡that ¡E. ¡coli ¡

is ¡a ¡natural ¡part ¡of ¡the ¡flora ¡of ¡the ¡human ¡ diges1ve ¡system.” ¡

Interviews ¡

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Do ¡you ¡think ¡that ¡engineering ¡bacteria ¡is ¡ ethical? ¡

• “Yes.” ¡
• “…The ¡only ¡problem ¡I ¡have ¡with ¡engineering ¡

the ¡bacteria ¡is ¡when ¡people ¡use ¡it ¡for ¡… biological ¡warfare.” ¡

• “…as ¡long ¡as ¡it ¡is ¡in ¡a ¡controlled ¡environment ¡

where ¡they ¡can ¡be ¡studied...” ¡

Interviews ¡

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Would ¡you ¡allow ¡gene1cally ¡engineered ¡ bacteria ¡to ¡be ¡introduced ¡into ¡your ¡body? ¡ ¡

• “It ¡would ¡depend ¡on ¡the ¡type ¡of ¡organism ¡

and ¡the ¡type ¡of ¡effect ¡it ¡would ¡have ¡on ¡my ¡ body...” ¡

• “…depend ¡on ¡the ¡circumstances... ¡But ¡if ¡it ¡

was ¡for ¡tes1ng ¡or ¡just ¡because ¡then ¡I ¡ wouldn't ¡allow ¡it.” ¡

• “…if ¡it ¡was ¡for ¡a ¡necessary ¡purpose…” ¡

Interviews ¡

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Rela1onship ¡

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hOp://cae2k.com/photos-­‑rammstein-­‑0/blooming-­‑flower-­‑pictures.html ¡

Sponsors ¡

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AOribu1ons ¡

• Kim ¡Orr ¡– ¡advising, ¡organizing, ¡trip ¡

planning ¡

• Dr. ¡Hans-­‑Joachim ¡Wieden ¡– ¡advising, ¡

arranging ¡funding, ¡administra1on ¡ ¡

• Dr. ¡Ute ¡Kothe ¡– ¡communica1on ¡with ¡high ¡

school ¡teachers ¡

• Nathan ¡Dawson ¡– ¡help ¡making ¡M9 ¡Media ¡
• Sutherland ¡Dube ¡– ¡advising, ¡guidance, ¡

arranging ¡lab ¡1me, ¡keeping ¡everyone ¡ together ¡

Thanks ¡to ¡all ¡those ¡who ¡made ¡the ¡project ¡ a ¡great ¡success. ¡

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AOribu1ons ¡

• Alvin ¡Lee ¡– ¡access ¡to ¡research ¡materials ¡
• Jus1n ¡Luu ¡– ¡answering ¡ques1ons ¡ ¡
• Anthony ¡Vuong ¡– ¡answering ¡ques1ons ¡
• Ben ¡Vuong ¡– ¡help ¡with ¡glucose ¡assay ¡
• Isaac ¡Ward ¡– ¡advising, ¡teaching ¡proper ¡

use ¡of ¡spectrophotometer ¡ Thanks ¡to ¡all ¡those ¡who ¡made ¡the ¡project ¡ a ¡great ¡success. ¡

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Thank ¡You ¡

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