Protein design Chris Bystroff Biology 12 Apr 2016 1 Protein - - PowerPoint PPT Presentation

Protein design

1

Chris Bystroff Biology 12 Apr 2016

Protein folding/ protein design

folding

sequence structure

design

Sequence space maps to structure space

Structure prediction is "many-to-one".

sequence families fold space

Sequence space maps to structure space

Design is "one-to-many". Much easier

sequence families fold space

Binary patterning in proteins

(Kamtekar et al, Science, 1993)

rational design

P/NP

Kamtekar, Satwik, et al. "Protein design by binary patterning of polar and nonpolar amino acids." Science 262.5140 (1993): 1680-1685.

Rationally designed proteins are usually unstable

energy folded unfolded folding

Computationally designed proteins are often very stable

Dantas et al., J. Mol. Biol. (2003) 332, 449–460

folded unfolded Circular dichroism spectra measure stability

Q:Why? A: Better packing.

Computational protein design using Dead-End Elimination

• 1. Select positions for mutating.
• 2. Select allowed amino acids at those positions.
• 3. For the selected amino acids, try all sidechain
• rientations (rotamers).
• 4. Chose the sequence of amino acids that gives the

lowest energy. naive design algorithm

REMINDER: Sidechain Rotamers

Sidechain conformations fall into three classes called rotational isomers, or rotamers. A random sampling of Phenylalanine sidechains, w/ backbone superimposed

Sidechain rotamers

CG H H H O=C N

CA CB

C G H H H O=C N

CA CB

C G H H H O=C N

CA CB

"m" "p" "t"

• 60° gauche

180° anti/trans +60° gauche 1-4 interactions differ greatly in energy depending on the moieties involved.

Rotamer stability is dependent

• n the backbone φψ angles

W sidechain is
 shown here lying

• ver Thr

backbone

Rotamers of W*: φ ψ P|φ=-140,ψ=160 P|φ=-60,ψ=-40 
 p-90 +60 -90 0.372 0.079 
 p90 +60 +90 0.238 0.005 
 t-105 180 -105 0.033 0.251 
 t90 180 90 0.021 0.268 
 m0

• 65 5

0.038 0.124
 m95

• 65 95

0.183 0.203

Rotamer Libraries

Rotamer libraries have been compiled by clustering the sidechains of each amino acid over the whole database. Each cluster is a representative conformation (or rotamer), and is represented in the library by the best sidechain angles (chi angles), the "centroid" angles, for that cluster.

Two commonly used rotamer libraries: *Jane & David Richardson: http://kinemage.biochem.duke.edu/databases/ rotamer.php Roland Dunbrack: http://dunbrack.fccc.edu/bbdep/index.php

sidechain prediction using a rotamer library

Desmet et al, Nature v.356, pp339-342 (1992)

Given the sequence and

• nly the backbone atom

coordinates, accurately model the positions of the sidechains.

fine lines = true structure thick lines = sidechain predictions

Theoretical complexity of sequence design

Total number of sidechain rotamers: R=193 Typical small protein length: L=100 residues Sequence complexity: 20100 = 1.3*10130 Rotamer complexity: 193100 = 3.6*10228 Complexity of DEE algorithm: O( R2L2) = 3.6*108

Energy is pairwise

16

i j

Eij = Σ(H-bonds+collisions+electrostatics+SAS)

SAS = solvent accessible surface

Dead end elimination theorem

• Each residue is numbered (i or j) and each residue has a set of

rotamers (r, s or t). So, the notation ir means "choose rotamer r for position i".

• The total energy is the sum of the three components:

NOTE: Eglobal ≥ EGMEC for any choice of rotamers. Eglobal = Etemplate + ΣiE(ir) + ΣiΣjE(ir,js)

where r and s are any choice of rotamers.

fixed-fixed fixed-movable movable-movable

Dead end elimination theorem

• If ig is in the GMEC and it is not, then we can separate the

terms that contain ig or it and re-write the inequality.

E(ir) + Σj mins E(irjs) > E(it) + Σj maxs E(it,js) EGMEC = Etemplate + E(ig) + ΣjE(ig,jg) + ΣjE(jg) + ΣjΣkE(jg,kg) EnotGMEC = Etemplate + E(it) + ΣjE(it,jg) + ΣjE(jg) + ΣjΣkE(jg,kg) ...is less than... E(ir) + Σj E(irjs) > E(ig) + Σj E(ig,js)

Canceling all terms in black, we get: So, if we find two rotamers ir and it, and: Then ir cannot possibly be in the GMEC.

Dead end elimination theorem

E(ir) + Σj mins E(irjs) > E(it) + Σj maxs E(it,js)

DEE theorem can be translated into plain English as follows:

If the "worst case scenario" for t is better than the "best case scenario" for r, then you always choose t.

DEE algorithm

E(r1)

• 1

1 1 3 5 1 5 5

• 1
• 2

2 5 5

• 1

1 12 5 4 3

• 1

3 5 1 5 5 1 1

• 1
• 2

2 5 5

• 1

12 4 5 3 1 r1

r2 E(r1,r2)

1 2 3 2 1 3

a b c a b c a b c a b c a b c a b c 5 12

5 12

E(r2)

a b c 1 2 3

Find two columns (rotamers) within the same residue, where one is always better than the other. Eliminate the rotamer that can always be

• beat. (repeat until only 1 rotamer per residue)

Eglobal = Etemplate + ΣiE(ir) + ΣiΣjE(ir,js)

x x x x x x

E(r1)

• 1

1 1 3 5 1 5 5

• 1
• 2

2 5 5

• 1

1 12 5 4 3

• 1

3 5 1 5 5 1 1

• 1
• 2

2 5 5

• 1

12 4 5 3 1 r 1

E(r 1,r 2)

1 2 3 2 1 3

a b c a b c a b c a b c a b c a b c 5 12

5 12

E(r 2) r 2

DEE algorithm

E(r1)

• 1

1 1 3 5 1 5 5

• 1
• 2

2 5 5

• 1

1 12 5 4 3

• 1

3 5 1 5 5 1 1

• 1
• 2

2 5 5

• 1

12 4 5 3 1 r1

r2 E(r1,r2)

1 2 3 2 1 3

a b c a b c a b c a b c a b c a b c 5 12

5 12

E(r2)

a b c 1 2 3

Find two columns (rotamers) within the same residue, where one is always better than the other. Eliminate the rotamer that can always be

• beat. (repeat until only 1 rotamer per residue)

Eglobal = Etemplate + ΣiE(ir) + ΣiΣjE(ir,js)

Sequence design using DEE

a b c 1 2 3

• 1

1 1 3 5 1 5 5

• 1
• 2 1 5 2

0 5 -1 2 0 0 0 3 0 0 1 1 12 5 0 -3 4 3 0 1

• 1

3 5 1 5 5 1 1

• 1
• 2

2 5 5

• 1

0
 2 2 3 12 4 5 3 1 0
 1

• 3

1 r1

r2 E(r1,r2)

1 2 3 2 1 3

a b c a b c a b a b a b c a b c a b a b 5 12 2

5 12 2

E(r2) E(r1) Asp Leu

“Rotamers” within the DEE framework can have different atoms. i.e. they can be different amino acids. Using DEE, we choose the best set of rotamers. Now we have the sequence of the lowest energy structure. In the example, we have D or L at position 3.

DEE with alternative sequences and ligands

a b c L 2 3

• 1

1 1 3 5 1 5 5

• 1
• 2 1 5 2

0 5 -1 2 0 0 0 3 0 0 1 1 12 5 0 -3 4 3 0 1

• 1

3 5 1 5 5 1 1

• 1
• 2

2 5 5

• 1

0
 2 2 3 12 4 5 3 1 0
 1

• 3

1

r2 E(r1,r2)

L 2 3 2 1 3

a b c a b c a b a b a b c a b c a b a b 5 12 2

5 12 2

E(r2) E(r1) Asp Leu

Each alternative ligand position is another “rotamer”.

Ligand conformers.

r1

Case study: designing a seratonin

• sensor. 1. find a template

Looger, L. L., Dwyer, M. A., Smith, J. J. & Hellinga, H. W. Nature 423, 185–190 (2003).

The native ligand (arabinose) is approximately the same size as the targeted ligand (seratonin).

• 2. carve out space for the ligand

Looger, L. L., Dwyer, M. A., Smith, J. J. & Hellinga, H. W. Nature 423, 185–190 (2003).

All sidechains in the binding site were truncated to alanines, and a space was defined (yellow) for the new

• ligand. Lots of possible

ligand orientations were

• made. Ligand
• rientations were

treated like rotamers in DEE!

• 3. Select/place side chains using DEE

Looger, L. L., Dwyer, M. A., Smith, J. J. & Hellinga, H. W. Nature 423, 185–190 (2003).

The most critical component of the energy function was hydrogen bonding (dotted lines). Every donor/acceptor should be satisfied.

Getting the H-bonding right is key

Note plenty of backbone-ligand H-bonds in these successful designs.

New directions for protein design

• Docking and design at the same time!
• Designing enzymes!
• Designing nano-structures!!
• Designing drugs (biologics)!!!

A B

My research: Leave-one-out biosensors

C

Green Fluorescent Protein

11-standed beta-barrel surrounding fluorescent chromophore

GFP biosensor showing bound target pepide

LOO7-GFP is circularly permuted GFP

with a C-N linker peptide (red arrow), and β-strand 7 is removed (black arrow).

Leave-one-out GFP "LOO-GFP"

Change the sequence of one strand to target sequence Design around it Make it in the lab. Test for binding.

in vivo expression/co-expression of GFP constructs

LOO7 LOO11 s7 LOO11 control

permuted 
 control

s7 s11

LOO7+ s7 LOO11 +s11 LOO11 +s7 LOO7+ s11 control

permuted 
 control

34 13 Designable Positions Wild-type residue Computational design Degenerate codon Library Colony
 HA4 Input Output

83 F AFILMVW FW TKS FLCW W 84 F AFILMVW FM WTK MILF F 161 I AFILMVW ILV VTA ILV I 163 A AFILMVW I ATC I I 164 N NST NST AVY NST T 165 F AFILMVW F TTT F F 167 V AFILMVW IMV RTN IMV V 168 R RNST NST AVY NST T 200 Y YKHR HKR MRS HKR H 201 L LFMW FM WTK MILF L 202 S SKHR HKR MRS HKR K 204 Q QNST NST AVY NST T 224 V AFILMVW IV RTK IV V

Design process for LOO7-HA4

Overnight colonies of LOO7-HA library

7 mutations

sfGFP ¡ ¡***** ¡***** ¡* ¡ ¡ ¡ ¡ ¡162 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡172 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡182 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡192 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡202 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡212 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡222 ¡ LOO7 ¡ ¡ ¡1 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡11 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡21 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡31 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡41 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡51 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡61 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡71 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡MTHHH ¡HHHSS ¡GKNGI ¡KANFT ¡VRHNV ¡EDGSV ¡QLADH ¡YQQNT ¡PIGDG ¡PVLLP ¡DNHYL ¡STQTV ¡LSKDP ¡NEKRD ¡HMVLL ¡EFVTA ¡ ¡ ¡ HA4 ¡ ¡ ¡ ¡..... ¡..... ¡..... ¡.IT.. ¡.T... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡...H. ¡K.T.. ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP1 ¡ ¡ ¡ ¡..... ¡..... ¡..... ¡.IT.. ¡.A... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡...H. ¡K.T.. ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP2-­‑1 ¡ ¡..... ¡..... ¡..... ¡.IT.. ¡.A... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡.T.H. ¡K.T.. ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP2-­‑2 ¡ ¡..... ¡..... ¡..... ¡.IT.. ¡.A... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡...H. ¡K.T.. ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP2-­‑3 ¡ ¡..... ¡..... ¡..... ¡.IT.. 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¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡...H. ¡K.T.. ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ DS2 ¡ ¡ ¡ ¡..... ¡..... ¡..... ¡.IT.. ¡.A... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡...H. ¡K.T.. ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ sfGFP ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡232 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡*** ¡*** ¡ ¡ ¡2 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡12 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡22 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡32 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡42 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡52 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ LOO7 ¡ ¡ ¡81 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡91 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡101 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡111 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡121 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡131 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡141 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡151 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡AGITH ¡GMDEL ¡YKGGT ¡GGSMA ¡SKGEE ¡LFTGV ¡VPILV ¡ELDGD ¡VNGHK ¡FSVRG ¡EGEGD ¡ATIGK ¡LTLKF ¡ICTTG ¡KLPVP ¡WPTLV ¡ ¡ HA4 ¡ ¡ ¡ ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP1 ¡ ¡ ¡ ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP2-­‑1 ¡ ¡...S. ¡...D. ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP2-­‑2 ¡ ¡..... ¡.L... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡N.... ¡..... ¡ EP2-­‑3 ¡ ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP2-­‑4 ¡ ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡.N... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP3-­‑1 ¡ ¡...S. ¡...D. ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡....A ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP3-­‑2 ¡ ¡...SP ¡...D. ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP4-­‑1 ¡ ¡....N ¡.L... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡N.... ¡..... ¡ EP4-­‑2 ¡ ¡..... ¡.L... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡.N... ¡..... ¡D.... ¡..S.. ¡ EP4-­‑3 ¡ ¡..... ¡.L... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡N.... ¡..... ¡ EP4-­‑4 ¡ ¡..... ¡.L... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP4-­‑5 ¡ ¡..... ¡.LG.. ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡.S... ¡N.... ¡..... ¡ EP4-­‑6 ¡ ¡..... ¡.L... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP4-­‑7 ¡ ¡..... ¡.L... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡N.... ¡..... ¡ EP4-­‑8 ¡ ¡..... ¡.L... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡N.... ¡..... ¡ EP4-­‑9 ¡ ¡..... ¡.L... ¡..... ¡..... ¡..... ¡...E. ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡N.... ¡..... ¡ EP4-­‑10 ¡..... ¡.L... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡....E ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡N.... ¡..... ¡ EP4-­‑11 ¡....N ¡.L... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡N.... ¡..... ¡ EP4-­‑12 ¡..... ¡.L... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡N.... ¡..... ¡ DS1 ¡ ¡ ¡ ¡..... ¡.L... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ DS2 ¡ ¡ ¡ ¡...S. ¡...D. ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡....A ¡..... ¡..... ¡..... ¡..D.. ¡..... ¡..... ¡..... ¡N.... ¡..... ¡ sfGFP ¡ ¡62 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡72 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡82 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡92 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡102 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡112 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡122 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡132 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ LOO7 ¡ ¡ ¡161 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡171 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡181 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡191 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡201 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡211 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡221 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡231 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡TTLTY ¡GVQCF ¡SRYPD ¡HMKRH ¡DFFKS ¡AMPEG ¡YVQER ¡TISFK ¡DDGKY ¡KTRAV ¡VKFEG ¡DTLVN ¡RIELK ¡GTDFK ¡EDGNI ¡LGHKL ¡ ¡ HA4 ¡ ¡ ¡ ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡.W... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP1 ¡ ¡ ¡ ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡.W... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP2-­‑1 ¡ ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡.W... ¡T.... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP2-­‑2 ¡ ¡...A. ¡..... ¡..... ¡..... ¡.W... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP2-­‑3 ¡ ¡...A. ¡..... ¡..... ¡..... ¡.W... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP2-­‑4 ¡ ¡...A. ¡..... ¡..... ¡..... ¡.W... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP3-­‑1 ¡ ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡.W... ¡T.... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP3-­‑2 ¡ ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡.W... ¡T.... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP4-­‑1 ¡ ¡...A. ¡..... ¡..... ¡..... ¡.W... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡.N... 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EP4-­‑10 ¡...A. ¡..... ¡..... ¡..... ¡.W... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ EP4-­‑11 ¡...A. ¡..... ¡..... ¡..... ¡.W... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡.N... ¡..... ¡ EP4-­‑12 ¡...A. ¡....I ¡..... ¡..... ¡.W... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ DS1 ¡ ¡ ¡ ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡.W... ¡T.... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ DS2 ¡ ¡ ¡ ¡...A. ¡..... ¡..... ¡..... ¡.W... ¡T.... ¡..... ¡....T ¡..... ¡..... ¡..... ¡....S ¡..... ¡..... ¡..... ¡..... ¡ ¡ ¡ sfGFP ¡ ¡142 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡157 ¡ LOO7 ¡ ¡ ¡241 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡256 ¡

β8 β9 β1 β1 β1 β2 β3 β4 β5 β6 α

In vitro evolution

Error-prone PCR DNA shuffling

red: computationally designed white: random

Target specificity: Biosensor t7SP incubated with target peptide s7. Fluorescence grows in proportional to s7 concentration.

Multi-analyte test strips

InteractiveROSETTA

38

Christian Schenkelberg