Members: Laura Carman, Michael Coghlan, Sarah Dowie, Rathu - PowerPoint PPT Presentation

Members: ¡Laura ¡Carman, ¡Michael ¡Coghlan, ¡Sarah ¡Dowie, ¡Rathu ¡Guna, ¡David ¡Hanly ¡and ¡Kara ¡ Stubbs ¡ Instructors: ¡Dr. ¡Mark ¡Shepherd, ¡Dr. ¡Wei-­‑Feng ¡Xue ¡

Kara, ¡David, ¡Laura, ¡Sarah, ¡Michael ¡and ¡Rathu ¡ Canterbury ¡Cathedral ¡from ¡our ¡campus. ¡ Supervisors: ¡Wei-­‑Feng ¡Xue ¡and ¡Mark ¡Shepherd ¡

Nitric ¡oxide ¡is ¡a ¡potent ¡greenhouse ¡ gas ¡that ¡is ¡a ¡factor ¡in ¡causing ¡global ¡ warming. ¡ We ¡planned ¡to ¡uKlise ¡systems ¡such ¡ as ¡NrfA ¡and ¡NorR ¡in ¡our ¡ experiments. ¡ hMp://labspiro.wordpress.com/research/nitric-­‑oxide-­‑in-­‑ escerichia-­‑coli/ ¡

• Chose ¡this ¡project ¡idea ¡because ¡addresses ¡a ¡serious ¡issue: ¡ global ¡warming. ¡ • NO ¡is ¡a ¡greenhouse ¡gas. ¡ • Aimed ¡to ¡take ¡a ¡new ¡approach ¡to ¡reducing ¡the ¡amount ¡of ¡ NO ¡formed ¡in ¡waste ¡water. ¡ • Engineering ¡TOP10 ¡ E.coli ¡to ¡increase ¡their ¡capacity ¡to ¡ convert ¡excess ¡NO ¡to ¡ammonia. ¡ ¡ • Our ¡BioBricks ¡have ¡been ¡designed ¡to ¡enable ¡the ¡detecKon ¡ of ¡NO ¡via ¡the ¡ norV ¡promoter ¡to ¡induce ¡expression ¡of ¡NrfA ¡

SelecKve ¡ Wet ¡ catalyKc ¡ Scrubbing ¡ reducKon ¡(SCR) ¡ system ¡ system ¡ hMp:// www.minerals.co.nz /html/main_topics/ hMp:// resources_for_scho en.wikipedia.org/ ols/ironsands/ wiki/ ironsands_index.ht SelecKve_catalyKc_r ml ¡ Although ¡SCR ¡provides ¡an ¡efficient ¡means ¡of ¡ educKon ¡ converKng ¡nitric ¡oxide ¡into ¡diatomic ¡nitrogen, ¡ The ¡wet ¡scrubbing ¡system ¡provides ¡60-­‑70% ¡ the ¡process ¡is ¡costly ¡and ¡the ¡system ¡is ¡sensiKve ¡ removal ¡of ¡nitric ¡oxides ¡and ¡provides ¡a ¡low ¡iniKal ¡ cost. ¡ ¡ to ¡contaminaKon. ¡ ¡

nrfA ¡encodes ¡a ¡nitrite ¡ reductase ¡enzyme ¡that ¡ has ¡the ¡ability ¡to ¡reduce ¡ nitrite ¡and ¡NO ¡to ¡ ammonia ¡under ¡ anaerobic ¡condiKons. ¡ ¡

-­‑ ¡NorR ¡is ¡the ¡transcripKonal ¡regulator ¡of ¡the ¡ norVW ¡operon ¡in ¡ E.coli . ¡ -­‑ ¡It ¡is ¡an ¡NO-­‑sensing, ¡σ 54 ¡– ¡dependent ¡regulator ¡that ¡binds ¡to ¡the ¡ norVW ¡ promoter ¡prior ¡to ¡NO ¡signalling, ¡priming ¡it ¡for ¡a ¡rapid ¡ response ¡to ¡NO. ¡

-­‑ ¡Its ¡regulatory ¡domain ¡represses ¡the ¡acKve ¡domain, ¡but ¡NO ¡ binding ¡to ¡the ¡regulatory ¡domain ¡relieves ¡this ¡repression. ¡ -­‑ ¡Powered ¡by ¡ATP ¡hydrolysis, ¡the ¡acKve ¡domain ¡relocates ¡the ¡σ 54 ¡ holoenzyme ¡to ¡induce ¡open ¡promoter ¡complex ¡formaKon. ¡

-­‑ ¡No ¡need ¡for ¡expensive ¡metal ¡catalysts ¡and ¡eliminaKon ¡of ¡ potenKal ¡toxicity ¡from ¡metal ¡by-­‑products. ¡ -­‑The ¡modified ¡NrfA ¡system ¡can ¡be ¡introduced ¡in ¡other ¡ bacteria ¡as ¡well ¡as ¡ E. ¡coli . ¡ -­‑ ¡Results ¡in ¡the ¡producKon ¡of ¡ammonia ¡which ¡has ¡a ¡wide ¡ range ¡of ¡applicaKons ¡in ¡industry. ¡ ¡

norV ¡and ¡ nrfA ¡from ¡ E.coli ¡to ¡form ¡BioBrick ¡construct: ¡ Purify ¡successful ¡PCR ¡ Colony ¡PCR ¡ ¡ PCR ¡diagnosKc ¡ product ¡ gel ¡ ¡ DiagnosKc ¡gel ¡for ¡ LigaKon ¡of ¡ norV ¡and ¡ 30µl ¡digest ¡of ¡PCR ¡ concentraKon ¡ product ¡ nrfA ¡into ¡plasmid ¡ Overnights ¡ DiagnosKc ¡ TransformaKon ¡of ¡ and ¡Miniprep ¡ restricKon ¡ ligaKon ¡product ¡ of ¡colonies ¡ digest ¡and ¡gel ¡ into ¡cells ¡

norV F EcoRI NotI XbaI 5’-CGC GAATTCGCGGCCGCTTCTAGA GAACGGAAAAACTCATCTTTGCCTCAC-3’ BioBrick Prefix (non-coding) norV R PstI NotI SpeI RBS 5’-CGCCTGCAGCGGCCGCTACTAGTAACACCTCCTAGCAACCTCAATTTATTCAGCGTGT-3’ BioBrick Suffix (reverse) nrfA F EcoRI NotI XbaI 5’-CGC GAATTCGCGGCCGCTTCTAG A TG ACAAGGATAAAAATAAACGCACGCC-3’ BioBrick Prefix (coding) nrfA R PstI NotI SpeI stop 5’-CGC CTGCAGCGGCCGCTACTAGTTTA ¡ TTGGCTTAACAGACCGTTTTTA-3’ BioBrick Suffix (reverse)

Image: ¡diagnosKc ¡gel ¡of ¡colony ¡PCR, ¡ showing ¡a ¡succesful ¡PCR ¡process ¡for ¡ both ¡ norV ¡and ¡ nrfA ¡ nrfA ¡approx. ¡ 1.5 ¡kbp ¡ norV ¡approx. ¡ 0.2 ¡kbp ¡ ¡

Image: ¡successful ¡ligaKons ¡of ¡norV ¡ and ¡ nrfA ¡into ¡plasmid ¡pSB1C3. ¡Colonies ¡of ¡Cm ¡ agar ¡plates. ¡ ¡

Image: ¡diagnosKc ¡gel ¡of ¡ligaKons, ¡ showing ¡successful ¡ norV ¡plasmid ¡ and ¡insert. ¡Cut ¡with ¡EcoR1 ¡and ¡Pst1. ¡ ¡ Plasmid ¡band ¡ approx. ¡2.0 ¡kbp ¡ norV ¡insert ¡ approx. ¡0.2 ¡ kbp ¡

Plasmid ¡band ¡ approx. ¡2.0 ¡kbp ¡ nrfA ¡insert ¡ approx. ¡ 1.5 ¡kbp ¡ Image: ¡diagnosKc ¡gel ¡of ¡ ligaKons, ¡showing ¡successful ¡ nrfA ¡plasmid ¡and ¡insert. ¡Cut ¡ with ¡EcoR1 ¡and ¡Pst1. ¡ ¡

• We ¡hope ¡we ¡have ¡provided ¡a ¡clear ¡path ¡for ¡conKnuaKon ¡should ¡next ¡years ¡ Kent ¡iGEM ¡parKcipants ¡wish ¡to ¡take ¡this ¡project ¡further. ¡ • We ¡would ¡have ¡joined ¡both ¡of ¡our ¡BioBricks ¡together, ¡allowing ¡us ¡to ¡test ¡ them ¡ • We ¡would ¡also ¡have ¡joined ¡the ¡ norV ¡ promoter ¡to ¡ gfp ¡ in ¡order ¡to ¡obtain ¡ visual ¡GFP ¡fluorescence ¡data ¡measuring ¡ norV ¡ promoter ¡acKvity. ¡ • We ¡would ¡like ¡to ¡test ¡operaKon ¡of ¡the ¡modified ¡plasmid ¡in ¡other ¡organisms ¡ to ¡see ¡if ¡they ¡could ¡be ¡used ¡to ¡apply ¡our ¡system ¡other ¡microenvironments. ¡

Pseudomoas ¡aeruginosa ¡ hMp://www.thesilveredge.com/pseudomonas.shtml ¡ 3707 ¡bp ¡ hMp://www.astrobio.net/exclusive/3866/mutant-­‑ microbes-­‑test-­‑radiaKon-­‑resistance ¡ Bacillus ¡sub9lis ¡ Various ¡E. ¡coli ¡ strains ¡ By ¡transforming ¡our ¡plasmid ¡into ¡different ¡ bacteria, ¡we ¡may ¡have ¡been ¡able ¡to ¡idenKfy ¡if ¡ any ¡other ¡bacteria ¡would ¡have ¡been ¡more ¡ suitable ¡to ¡a ¡microenvironment ¡in ¡different ¡ waste ¡water ¡treatment ¡ ¡

• ¡Grow ¡bacteria ¡with ¡the ¡modified ¡system ¡in ¡the ¡biological ¡phase ¡of ¡the ¡water ¡ treatment ¡process ¡alongside ¡exisKng ¡waste ¡removal ¡organisms ¡so ¡that ¡they ¡can ¡ remove ¡excess ¡NO ¡at ¡this ¡phase. ¡ • ¡Sequester ¡some ¡of ¡the ¡increased ¡ammonia ¡output, ¡either ¡by ¡precipitaKng ¡it ¡ with ¡nitrate, ¡or ¡through ¡the ¡ammonia ¡transport ¡systems ¡of ¡ E.coli . ¡ ¡ • ¡This ¡could ¡provide ¡a ¡novel ¡means ¡of ¡ammonia ¡producKon ¡that ¡could ¡yield ¡ more ¡ammonia ¡than ¡exisKng ¡processes ¡such ¡as ¡the ¡Haber ¡process, ¡with ¡ substanKally ¡lower ¡costs. ¡ ¡

-­‑ ¡ Instructors ¡– ¡Dr. ¡Mark ¡Shepherd ¡and ¡Dr. ¡Wei-­‑Feng ¡Xue ¡ ¡as ¡well ¡as ¡ both ¡of ¡their ¡labs. ¡ ¡ -­‑ ¡School ¡of ¡Biosciences ¡ ¡ -­‑ ¡University ¡of ¡Kent ¡