Members: Laura Carman, Michael Coghlan, Sarah Dowie, Rathu - - PowerPoint PPT Presentation

Members: ¡Laura ¡Carman, ¡Michael ¡Coghlan, ¡Sarah ¡Dowie, ¡Rathu ¡Guna, ¡David ¡Hanly ¡and ¡Kara ¡ Stubbs ¡ Instructors: ¡Dr. ¡Mark ¡Shepherd, ¡Dr. ¡Wei-­‑Feng ¡Xue ¡

Kara, ¡David, ¡Laura, ¡Sarah, ¡Michael ¡and ¡Rathu ¡ Supervisors: ¡Wei-­‑Feng ¡Xue ¡and ¡Mark ¡Shepherd ¡ Canterbury ¡Cathedral ¡from ¡our ¡campus. ¡

Nitric ¡oxide ¡is ¡a ¡potent ¡greenhouse ¡ gas ¡that ¡is ¡a ¡factor ¡in ¡causing ¡global ¡

• warming. ¡

We ¡planned ¡to ¡uKlise ¡systems ¡such ¡ as ¡NrfA ¡and ¡NorR ¡in ¡our ¡

• experiments. ¡

hMp://labspiro.wordpress.com/research/nitric-­‑oxide-­‑in-­‑ escerichia-­‑coli/ ¡

• Chose ¡this ¡project ¡idea ¡because ¡addresses ¡a ¡serious ¡issue: ¡

global ¡warming. ¡

• NO ¡is ¡a ¡greenhouse ¡gas. ¡
• Aimed ¡to ¡take ¡a ¡new ¡approach ¡to ¡reducing ¡the ¡amount ¡of ¡

NO ¡formed ¡in ¡waste ¡water. ¡

• Engineering ¡TOP10 ¡E.coli ¡to ¡increase ¡their ¡capacity ¡to ¡

convert ¡excess ¡NO ¡to ¡ammonia. ¡ ¡

• Our ¡BioBricks ¡have ¡been ¡designed ¡to ¡enable ¡the ¡detecKon ¡
• f ¡NO ¡via ¡the ¡norV ¡promoter ¡to ¡induce ¡expression ¡of ¡NrfA ¡

SelecKve ¡ catalyKc ¡ reducKon ¡(SCR) ¡ system ¡ Wet ¡ Scrubbing ¡ system ¡

Although ¡SCR ¡provides ¡an ¡efficient ¡means ¡of ¡ converKng ¡nitric ¡oxide ¡into ¡diatomic ¡nitrogen, ¡ the ¡process ¡is ¡costly ¡and ¡the ¡system ¡is ¡sensiKve ¡ to ¡contaminaKon. ¡ ¡ The ¡wet ¡scrubbing ¡system ¡provides ¡60-­‑70% ¡ removal ¡of ¡nitric ¡oxides ¡and ¡provides ¡a ¡low ¡iniKal ¡

• cost. ¡ ¡

hMp:// en.wikipedia.org/ wiki/ SelecKve_catalyKc_r educKon ¡ hMp:// www.minerals.co.nz /html/main_topics/ resources_for_scho

• ls/ironsands/

ironsands_index.ht ml ¡

nrfA ¡encodes ¡a ¡nitrite ¡ reductase ¡enzyme ¡that ¡ has ¡the ¡ability ¡to ¡reduce ¡ nitrite ¡and ¡NO ¡to ¡ ammonia ¡under ¡ anaerobic ¡condiKons. ¡ ¡

• ­‑ ¡NorR ¡is ¡the ¡transcripKonal ¡regulator ¡of ¡the ¡norVW ¡operon ¡in ¡

E.coli. ¡

• ­‑ ¡It ¡is ¡an ¡NO-­‑sensing, ¡σ54 ¡– ¡dependent ¡regulator ¡that ¡binds ¡to ¡the ¡

norVW ¡promoter ¡prior ¡to ¡NO ¡signalling, ¡priming ¡it ¡for ¡a ¡rapid ¡ response ¡to ¡NO. ¡

• ­‑ ¡Its ¡regulatory ¡domain ¡represses ¡the ¡acKve ¡domain, ¡but ¡NO ¡

binding ¡to ¡the ¡regulatory ¡domain ¡relieves ¡this ¡repression. ¡

• ­‑ ¡Powered ¡by ¡ATP ¡hydrolysis, ¡the ¡acKve ¡domain ¡relocates ¡the ¡σ54 ¡

holoenzyme ¡to ¡induce ¡open ¡promoter ¡complex ¡formaKon. ¡

• ­‑ ¡No ¡need ¡for ¡expensive ¡metal ¡catalysts ¡and ¡eliminaKon ¡of ¡

potenKal ¡toxicity ¡from ¡metal ¡by-­‑products. ¡

• ­‑The ¡modified ¡NrfA ¡system ¡can ¡be ¡introduced ¡in ¡other ¡

bacteria ¡as ¡well ¡as ¡E. ¡coli. ¡

• ­‑ ¡Results ¡in ¡the ¡producKon ¡of ¡ammonia ¡which ¡has ¡a ¡wide ¡

range ¡of ¡applicaKons ¡in ¡industry. ¡ ¡

norV ¡and ¡nrfA ¡from ¡E.coli ¡to ¡form ¡BioBrick ¡construct: ¡

Colony ¡PCR ¡ ¡ PCR ¡diagnosKc ¡ gel ¡ ¡ Purify ¡successful ¡PCR ¡ product ¡ 30µl ¡digest ¡of ¡PCR ¡ product ¡ DiagnosKc ¡gel ¡for ¡ concentraKon ¡ LigaKon ¡of ¡norV ¡and ¡ nrfA ¡into ¡plasmid ¡ TransformaKon ¡of ¡ ligaKon ¡product ¡ into ¡cells ¡ Overnights ¡ and ¡Miniprep ¡

• f ¡colonies ¡

DiagnosKc ¡ restricKon ¡ digest ¡and ¡gel ¡

norV F EcoRI NotI XbaI 5’-CGCGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGAACGGAAAAACTCATCTTTGCCTCAC-3’ norV R PstI NotI SpeI RBS 5’-CGCCTGCAGCGGCCGCTACTAGTAACACCTCCTAGCAACCTCAATTTATTCAGCGTGT-3’ nrfA F EcoRI NotI XbaI 5’-CGCGAATTCGCGGCCGCTTCTAGATGACAAGGATAAAAATAAACGCACGCC-3’ nrfA R PstI NotI SpeI stop 5’-CGCCTGCAGCGGCCGCTACTAGTTTA ¡TTGGCTTAACAGACCGTTTTTA-3’

BioBrick Prefix (non-coding) BioBrick Suffix (reverse) BioBrick Prefix (coding) BioBrick Suffix (reverse)

nrfA ¡approx. ¡ 1.5 ¡kbp ¡ norV ¡approx. ¡ 0.2 ¡kbp ¡ ¡

Image: ¡diagnosKc ¡gel ¡of ¡colony ¡PCR, ¡ showing ¡a ¡succesful ¡PCR ¡process ¡for ¡ both ¡norV ¡and ¡nrfA ¡

Image: ¡successful ¡ligaKons ¡of ¡norV ¡and ¡ nrfA ¡into ¡plasmid ¡pSB1C3. ¡Colonies ¡of ¡Cm ¡ agar ¡plates. ¡ ¡

Plasmid ¡band ¡

• approx. ¡2.0 ¡kbp ¡

norV ¡insert ¡

• approx. ¡0.2 ¡

kbp ¡

Image: ¡diagnosKc ¡gel ¡of ¡ligaKons, ¡ showing ¡successful ¡norV ¡plasmid ¡ and ¡insert. ¡Cut ¡with ¡EcoR1 ¡and ¡Pst1. ¡ ¡

Plasmid ¡band ¡

• approx. ¡2.0 ¡kbp ¡

nrfA ¡insert ¡

• approx. ¡

1.5 ¡kbp ¡

Image: ¡diagnosKc ¡gel ¡of ¡ ligaKons, ¡showing ¡successful ¡ nrfA ¡plasmid ¡and ¡insert. ¡Cut ¡ with ¡EcoR1 ¡and ¡Pst1. ¡ ¡

• We ¡hope ¡we ¡have ¡provided ¡a ¡clear ¡path ¡for ¡conKnuaKon ¡should ¡next ¡years ¡

Kent ¡iGEM ¡parKcipants ¡wish ¡to ¡take ¡this ¡project ¡further. ¡

• We ¡would ¡have ¡joined ¡both ¡of ¡our ¡BioBricks ¡together, ¡allowing ¡us ¡to ¡test ¡

them ¡

• We ¡would ¡also ¡have ¡joined ¡the ¡norV ¡promoter ¡to ¡gfp ¡in ¡order ¡to ¡obtain ¡

visual ¡GFP ¡fluorescence ¡data ¡measuring ¡norV ¡promoter ¡acKvity. ¡

• We ¡would ¡like ¡to ¡test ¡operaKon ¡of ¡the ¡modified ¡plasmid ¡in ¡other ¡organisms ¡

to ¡see ¡if ¡they ¡could ¡be ¡used ¡to ¡apply ¡our ¡system ¡other ¡microenvironments. ¡

hMp://www.thesilveredge.com/pseudomonas.shtml ¡

Pseudomoas ¡aeruginosa ¡

Bacillus ¡sub9lis ¡

hMp://www.astrobio.net/exclusive/3866/mutant-­‑ microbes-­‑test-­‑radiaKon-­‑resistance ¡

Various ¡E. ¡coli ¡strains ¡

By ¡transforming ¡our ¡plasmid ¡into ¡different ¡ bacteria, ¡we ¡may ¡have ¡been ¡able ¡to ¡idenKfy ¡if ¡ any ¡other ¡bacteria ¡would ¡have ¡been ¡more ¡ suitable ¡to ¡a ¡microenvironment ¡in ¡different ¡ waste ¡water ¡treatment ¡ ¡

3707 ¡bp ¡

• ¡Grow ¡bacteria ¡with ¡the ¡modified ¡system ¡in ¡the ¡biological ¡phase ¡of ¡the ¡water ¡

treatment ¡process ¡alongside ¡exisKng ¡waste ¡removal ¡organisms ¡so ¡that ¡they ¡can ¡ remove ¡excess ¡NO ¡at ¡this ¡phase. ¡

• ¡Sequester ¡some ¡of ¡the ¡increased ¡ammonia ¡output, ¡either ¡by ¡precipitaKng ¡it ¡

with ¡nitrate, ¡or ¡through ¡the ¡ammonia ¡transport ¡systems ¡of ¡E.coli. ¡ ¡

• ¡This ¡could ¡provide ¡a ¡novel ¡means ¡of ¡ammonia ¡producKon ¡that ¡could ¡yield ¡

more ¡ammonia ¡than ¡exisKng ¡processes ¡such ¡as ¡the ¡Haber ¡process, ¡with ¡ substanKally ¡lower ¡costs. ¡ ¡

• ­‑ ¡Instructors ¡– ¡Dr. ¡Mark ¡Shepherd ¡and ¡Dr. ¡Wei-­‑Feng ¡Xue ¡ ¡as ¡well ¡as ¡

both ¡of ¡their ¡labs. ¡ ¡

• ­‑ ¡School ¡of ¡Biosciences ¡ ¡
• ­‑ ¡University ¡of ¡Kent ¡