MAST BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016 DEPArray User Meeting Dissecting - - PowerPoint PPT Presentation

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DEPArray™ User Meeting

Dissecting the Heterogeneity of Circulating Tumor Cells in the Metastastic Breast Cancer

Daniela Cesselli, University of Udine

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DEPArray™ User Meeting

MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016 FIGURE 1 MINIMALLY INVASIVE APPROACHES TO MONITOR TUMOR GENOME EVOLUTION. (A) CIRCULATING TUMOR CELLS (CTCS;

BLUE) ARE ISOLATED FROM TOTAL BLOOD CELLS BY CELL

SEPARATION SYSTEMS. CELL LYSIS YIELDS PURE TUMOR

DNA (GRAY) AND RNA (BLACK); FOR ANALYSIS OF TUMOR-

SPECIFIC MUTATIONS, THESE ARE SUBJECTED TO WHOLE- GENOME OR WHOLE-TRANSCRIPTOME AMPLIFICATION, RESPECTIVELY (WGA, WTA). PROTEINS IN CTCS CAN BE ANALYZED BY IMMUNOHISTOCHEMISTRY AND, IF VIABLE,

CTCS CAN BE SUBJECTED TO FUNCTIONAL ANALYSES8.

(B) CELL-FREE DNA (CFDNA) IS PREPARED

FROM PLASMA BY SEVERAL CENTRIFUGATION AND FILTRATION STEPS.THE RESULTING DNA IS A MIXTURE OF

DNA FRAGMENTS RELEASED FROM NONMALIGNANT CELLS (BROWN) AND FROM TUMOR CELLS (CTDNA; BLUE).

(C) EXOSOMES CAN BE EFFICIENTLY CAPTURED

FROM BLOOD USING THE NPLEX ASSAY AND THEIR MOLECULAR CONSTITUENTS ANALYZED; FOR EXAMPLE, PROTEINS CAN BE QUANTIFIED BY NPLEX, AND RNA CAN BE QUANTIFIED OR SEQUENCED.

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CTC: open questions

 BEYOND ¡EPCAM ¡  BEYOND ¡ENUMERATION: ¡CHARACTERIZATION ¡

 EPITHELIAL ¡TO ¡MESENCHYMAL ¡TRANSITION ¡  DRUG-­‑SENSITIVITY ¡(e.g. ¡HER-­‑2, ¡ER, ¡PR) ¡  SINGLE ¡CELL ¡GENOMICS ¡

 VIABLE ¡CELL ¡SORTING

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AIMS

MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016 PERIPHERAL ¡

BLOOD ¡

ENRICHED ¡CTCS ¡ VIABLE ¡CTCS ¡

ENRICHMENT ¡ SORTING ¡

DOWNSTREAM ¡ ¡

ANALYSES ¡

AMPLI1™ WHOLE GENOME AMPLIFICATION

DEPARRAY-BASED PLATFORM

Sample ¡ ¡

RBC ¡LYSIS ¡ DEPLETION ¡OF ¡CD45+ ¡ ¡ CELLS ¡ STAINING ¡WITH ¡AN ¡ANTIBODY ¡

COCKTAIL ¡RECOGNIZING ¡EPITHELIAL ¡ AND ¡MESENCHYMAL ¡CTC ¡

MRNA REAL TIME

ANALYSIS PROTEINS

OUTPUT ¡

• 1. CTC ¡QUANTIFICATION ¡
• 2. CTC ¡CHARACTERIZATION: ¡

EPITHELIAL ¡/ ¡MESENCHYMAL ¡CTC ¡ ¡

• 3. VIABLE ¡CELLS ¡FOR ¡DOWNSTREAM ¡

ANALYSES ¡

• 4. CORRELATION ¡WITH ¡CLINICAL ¡DATA ¡

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1) ¡EPITHELIAL ¡AND ¡MESENCHYMAL ¡CTC ¡ 2) ¡VIABLE ¡CTCS ¡FOR ¡DOWNSTREAM ¡ANALYSES ¡(PROTEIN, ¡DNA, ¡RNAS….) ¡

PERIPHERAL ¡

BLOOD ¡

OPTIMIZATION ¡OF ¡THE ¡EXPERIMENTAL ¡ PLATFORM ¡TO ¡ISOLATE ¡AND ¡SORT ¡CTCS ¡

• 1. RBC ¡LYSIS ¡
• 2. DEPLETION ¡OF ¡CD45+/GLYCOFORIN+ ¡CELLS ¡(MILTENYI) ¡
• 1. ¡ENRICHMENT ¡PROCEDURE ¡(7.5 ¡ML ¡BLOOD) ¡

99.98 ¡± ¡0.012 ¡ % ¡

CD45 ¡POS ¡ CD45 ¡NEG ¡

• Dr. ¡MICHELA ¡BULFONI ¡

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EpCAM APC EpCAM APC E-CAD PE E-CAD PE AFTER ¡RB ¡LYSIS ¡AND ¡CD45+ ¡DEPLETION ¡OF ¡A ¡

SPIKED ¡SAMPLE ¡(7.5 ¡ML ¡PB+ ¡500’000 ¡TUMOR ¡ CELLS ¡MCF-­‑7) ¡ ¡WE ¡FOUND ¡ ¡

IN ¡THE ¡CD45-­‑ ¡FRACTION ¡99.5% ¡OF ¡THE ¡

TUMOR ¡CELLS. ¡

CTCS ¡ER+ ¡ENRICHED ¡FROM ¡PERIPHERAL ¡BLOOD ¡

OF ¡METASTATIC ¡BREAST ¡CANCER ¡PATIENTS ¡USING ¡ THE ¡EXPERIMENTAL ¡METHOD ¡DESIGNED ¡

• 1. ¡ENRICHMENT ¡PROCEDURE ¡(7.5 ¡ML ¡BLOOD) ¡

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MDA-MB231

• 2. CTCs ¡DETECTION ¡STRATEGY: ¡ANTIBODY ¡COCKTAIL ¡RECOGNIZING ¡VIABLE ¡ ¡

EPITHELIAL-­‑LIKE ¡(MCF-­‑7) ¡AND ¡MESENCHYMAL-­‑LIKE ¡(MDA-­‑MB ¡231) ¡CELLS ¡SPIKED ¡ IN ¡HUMAN ¡BLOOD ¡

MCF-7

• ­‑ ¡EPCAM ¡(MILTENYI ¡BIOTECH) ¡COD. ¡130-­‑091-­‑254; ¡
• ­‑ ¡CD44 ¡CLONE ¡G44-­‑26 ¡(BD) ¡COD. ¡347943; ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡
• ­‑ ¡CD146 ¡(BD) ¡COD. ¡550315; ¡
• ­‑ ¡N-­‑CAD ¡CLONE ¡8C11 ¡(BD) ¡COD. ¡561554; ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡
• ­‑ ¡CD49F ¡CLONE ¡GOH3 ¡(BIOLEGEND) ¡COD. ¡313615; ¡
• ­‑ ¡EGFR ¡CLONE ¡AY13 ¡(BIOLEGEND); ¡
• ­‑ ¡CD133 ¡CLONE ¡AC-­‑133 ¡(MILTENYI ¡BIOTECH); ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡
• ­‑ ¡CD45 ¡CLONE ¡2D1 ¡(BD) ¡COD.345809. ¡

MAST • BOLOGNA, 25-26 OCTOBER, 2016 SENSITIVITY ¡ SPECIFICITY ¡ PPV ¡ TOTAL ¡ 98.9±1.4% ¡ 99.2±1.6% ¡ 95±5.7% ¡ MCF-­‑7 ¡ 99.7±0.1% ¡ 98.4±2.1% ¡ 90±2.6% ¡ MDA-­‑231 ¡ 98±1.7% ¡ 99.9±0.1% ¡ 99.97±0.06% ¡

HOECHST ¡33342 ¡ STAINING ¡

NUCLEI ¡ ¡

EPITHELIAL MARKERS: EPCAM AND E-CAD

CONJUGATED WITH FITC

MESENCHYMAL MARKES: CD44, CD146 AND N-CAD

CONJUGATED WITH PE

HEALTHY ¡FEMALE ¡BLOOD ¡DONORS ¡

• 2. CTCs ¡DETECTION ¡STRATEGY: ¡ANTIBODY ¡COCKTAIL ¡RECOGNIZING ¡EPITHELIAL-­‑

LIKE ¡(MCF-­‑7) ¡AND ¡MESENCHYMAL-­‑LIKE ¡(MDA-­‑MB ¡231) ¡CELLS ¡SPIKED ¡IN ¡HUMAN ¡ BLOOD ¡

LEUKOCYTE MARKER: CD45

CONJUGATED WITH APC

SPIKED ¡SAMPLES ¡(n ¡= ¡27) ¡

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• 3. ¡DEVELOPMENT ¡OF ¡A ¡DEPARRAY-­‑BASED ¡PROTOCOL ¡TO ¡

DETECT ¡AND ¡SORT ¡SINGLE, ¡VIABLE, ¡EPITHELIAL ¡AND ¡ MESENCHYMAL ¡CELLS ¡

SPIKED ¡SAMPLES ¡ DEPARRAY ¡ ANALYSIS ¡ AND ¡ SORTING ¡

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• 4. ¡USE ¡OF ¡THE ¡STRATEGY ¡ON ¡MBC ¡PATIENTS ¡

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• 5. ¡CLINICAL ¡TRIAL: ¡METASTATIC ¡BREAST ¡CANCER ¡PATIENTS ¡

OBJECTIVE: ¡OBSERVATIONAL ¡STUDY ¡TO ¡EVALUATE ¡ 1. ASSOCIATION ¡BETWEEN ¡CTC ¡SUBPOPULATIONS ¡AND ¡CLINICOPATHOLOGICAL ¡FEATURES ¡ 2. THE ¡PROGNOSTIC ¡ROLE ¡OF ¡CTC ¡

¡RECRUITMENT ¡CRITERIA ¡

• 1. MEASURABLE ¡METASTATIC ¡BREAST ¡CANCER ¡(RECIST ¡CRITERIA); ¡ ¡
• 2. BEGINNING ¡OF ¡A ¡NEW ¡LINE ¡OF ¡SYSTEMIC ¡THERAPY, ¡WITH ¡NO ¡RESTRICTIONS ¡ON ¡ANY ¡PREVIOUS ¡THERAPY; ¡ ¡
• 3. ECOG ¡PERFORMANCE ¡STATUS ¡BETWEEN ¡0 ¡AND ¡2; ¡ ¡
• 4. AVAILABILITY ¡OF ¡A ¡HISTOLOGICAL ¡SPECIMEN ¡OF ¡THE ¡PRIMARY ¡TUMOR ¡

Oncology ¡Department ¡of ¡Udine ¡Hospital: ¡

• Prof. ¡F. ¡Puglisi, ¡Dr. ¡L. ¡Gerratana ¡

¡BIOBANKING ¡AND ¡FOLLOW-­‑UP ¡

• 1. SAMPLING: ¡BEFORE ¡THE ¡NEW ¡THERAPEUTIC ¡LINE, ¡AT ¡THE ¡FIRST ¡CLINICAL-­‑RADIOLOGICAL ¡FOLLOW-­‑UP, ¡AT ¡PROGRESSION ¡
• 2. COLLECTION ¡AND ¡STORAGE ¡OF ¡PLASMA ¡SAMPLE ¡ALIQUOTS ¡FOR ¡EXOSOME ¡AND ¡BIOMARKER ¡ANALYSIS; ¡
• 3. UP-­‑DATED ¡CLINICAL ¡DATABASE ¡(OS, ¡PFS, ¡DRUG ¡RESPONSE) ¡

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• 5. ¡CLINICAL ¡TRIAL: ¡PROGNOSTIC ¡ROLE ¡OF ¡CTC ¡EXPRESSING ¡

MESENCHYMAL ¡MARKERS ¡(N=47) ¡ ¡

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• 5. ¡CLINICAL ¡TRIAL: ¡ASSOCIATION ¡OF ¡CD45 ¡NEG ¡SUBSETS ¡

WITH ¡CLINICOPATHOLOGICAL ¡FEATURES ¡

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• 5. ¡CLINICAL ¡STUDY: ¡ASSOCIATION ¡OF ¡CD45 ¡NEG ¡SUBSETS ¡

WITH ¡CLINICAL ¡OUTCOME ¡

¡AT ¡THE ¡DATABASE ¡LOCK: ¡ – Disease ¡progression: ¡29 ¡cases ¡ – Death: ¡18 ¡cases. ¡ ¡ – Median ¡follow-­‑up: ¡33 ¡months ¡ – Median ¡OS ¡from ¡CTC ¡assessment: ¡21.7 ¡months ¡ – Median ¡PFS ¡from ¡CTC ¡assessment ¡: ¡8.12 ¡months. ¡ ¡ – Es<mated ¡1-­‑year ¡and ¡2-­‑year ¡OS ¡rates: ¡70 ¡% ¡and ¡46 ¡%, ¡respecavely, ¡ – Es<mated ¡1-­‑year ¡and ¡2-­‑year ¡PFS ¡rates: ¡37 ¡% ¡and ¡19 ¡% ¡respecavely. ¡

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• Prof. ¡M. ¡Isola, ¡University ¡of ¡Udine ¡

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EM-­‑CTC ¡ MES ¡

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Conclusions

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DEPArray™ User Meeting

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DEPArray™ User Meeting

Ampli1™ ¡LowPass ¡ CNA ¡analysis ¡on ¡single-­‑CTCs ¡obtained ¡by ¡ DEPArray™ ¡following ¡enrichment ¡by ¡depleaon ¡ ¡

Paaent: ¡MAM-­‑26 ¡ n=6 ¡E-­‑CTC ¡ n=7 ¡EM-­‑CTC ¡ n=7 ¡MES ¡ n=4 ¡NEG ¡ n=4 ¡LEUKOCYTES ¡

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Conclusions

• Aberrations were found in E, and some EMT, M, and

negative cells, confirming them as bona-fide CTCs

• Certain EMT, M and negative cells showed relatively flat

profiles, possibly normal cells

• A clear cluster of profiles included representatives from E

(n=3), EMT (n=4), and Negative (n=1) class.

• At least one other E CTC had a clearly distinct aberration

profile

• p. ¡26 ¡

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Acknowledgements

INSTITUTE ¡OF ¡PATHOLOGY ¡ C.A. ¡BELTRAMI ¡ A.P. ¡BELTRAMI ¡ : ¡ MICHELA ¡BULFONI ¡ Marisa ¡Sorrenano ¡ Stefania ¡Marzinoho ¡ Histopathology: ¡

• Prof. ¡C. ¡Di ¡Loreto ¡

NANOTECHNOLOGY ¡GROUP ¡ GIACINTO ¡SCOLES ¡ Fabio ¡Del ¡Ben ¡ Maheo ¡Tureha ¡

DEPARTMENT ¡OF ¡MEDICAL ¡AND ¡BIOLOGICAL ¡ SCIENCES ¡ ¡ UNIVERSITY ¡OF ¡UDINE ¡

INSTITUTE ¡OF ¡ONCOLOGY ¡

• F. ¡Puglisi ¡
• L. ¡Gerratana ¡

STATISTICS ¡

• M. ¡Isola ¡

SYLICON ¡BIOSYSTEM ¡(MENARINI) ¡ Nicolò ¡Manaresi ¡ Manuela ¡Banzi ¡ Elena ¡Peruzzi ¡ Giulio ¡Signorini ¡ Nicolas ¡Ryan ¡ IOV ¡PADUA ¡ (CELLSEARCH) ¡ Rita ¡Zamarchi ¡