Joint use of AUC and SAS: advanced concepts Olwyn Byron - - PowerPoint PPT Presentation

Joint ¡use ¡of ¡AUC ¡and ¡SAS: ¡advanced ¡concepts ¡ ¡

Olwyn ¡Byron ¡ ¡ School ¡of ¡Life ¡Sciences ¡ College ¡of ¡Medical, ¡Veterinary ¡and ¡Life ¡Sciences ¡ ¡ University ¡of ¡Glasgow, ¡Scotland ¡UK ¡ ¡

AUC ¡tutorials ¡

• SeCng ¡up ¡and ¡running ¡AUC ¡experiments ¡
• Tutorial ¡paper ¡
• Lebowitz, ¡J., ¡M.S. ¡Lewis, ¡and ¡P. ¡Schuck, ¡Modern ¡analyLcal ¡ultracentrifugaLon ¡in ¡protein ¡

science: ¡A ¡tutorial ¡review. ¡Protein ¡Science, ¡2002. ¡11(9): ¡p. ¡2067-­‑2079. ¡

• AUC ¡user ¡guide ¡from ¡Demeler ¡lab ¡
• hWp://www.uslims.uthscsa.edu/AUCuserGuideVolume-­‑1-­‑Hardware.pdf ¡ ¡
• Data ¡analysis ¡
• Using ¡SEDFIT ¡& ¡SEDPHAT ¡
• hWp://www.analyLcalultracentrifugaLon.com/default.htm ¡
• Using ¡Ultrascan ¡
• hWp://www.ultrascan.uthscsa.edu/ ¡

Wanna ¡buy ¡an ¡AUC? ¡

• Choice ¡of ¡2 ¡instruments ¡
• Beckman ¡Coulter ¡ProteomeLab™ ¡XL-­‑A/XL-­‑I ¡(≈ ¡250k ¡Euro) ¡
• Spin ¡AnalyLcal ¡CFA ¡(available ¡early ¡2013) ¡(≈ ¡$200k) ¡
• hWp://www.spinanalyLcal.com/cfa.php ¡

CFA: ¡Centrifugal ¡Fluid ¡Analyser ¡– ¡part ¡of ¡Open ¡AUC ¡Project ¡

CFA: ¡Centrifugal ¡Fluid ¡Analyser ¡

• EnLrely ¡new ¡centrifuge ¡
• Capacity ¡for ¡3 ¡opLcal ¡systems ¡
• Detectors ¡outside ¡vacuum ¡system ¡
• Current ¡
• Dual ¡Wavelength ¡Fluorescence ¡(DWF); ¡permits: ¡
• 2 ¡different ¡fluorescently ¡tagged ¡molecules ¡to ¡be ¡monitored ¡

simultaneously ¡

• FRET ¡detecLon ¡of ¡molecular ¡proximity ¡of ¡co-­‑sedimenters ¡
• MulL-­‑wavelength ¡Absorbance ¡(MWA); ¡permits: ¡
• separaLon ¡of ¡components ¡by ¡absorbance ¡spectrum ¡and ¡s ¡
• Planned ¡
• Rayleigh ¡interference ¡
• Schlieren ¡refracLon ¡
• Small-­‑angle ¡light ¡scaWering ¡
• MulL-­‑angle ¡light ¡scaWering ¡
• (SAXS?) ¡

¡

Content ¡of ¡this ¡talk ¡

• Detergent ¡solubilised ¡systems: ¡AUC, ¡SANS ¡
• Use ¡of ¡H2O/D2O ¡+ ¡AUC ¡to ¡determine ¡molecular ¡weight, ¡Kd ¡etc ¡for ¡detergent ¡solubilised ¡

proteins ¡

• Use ¡of ¡SANS ¡to ¡determine ¡localisaLon ¡of ¡components ¡within ¡detergent ¡solubilised ¡proteins ¡
• Self-­‑ ¡and ¡hetero-­‑associaLons: ¡AUC, ¡SANS ¡
• DeterminaLon ¡of ¡stoichiometry ¡via ¡AUC: ¡SE ¡& ¡SV ¡LtraLon ¡experiments ¡
• DeterminaLon ¡of ¡stoichiometry ¡via ¡SANS: ¡LtraLon ¡with ¡deuterated ¡component ¡

Content ¡of ¡this ¡talk ¡

• Detergent ¡solubilised ¡systems: ¡AUC, ¡SANS ¡
• Use ¡of ¡H2O/D2O ¡+ ¡AUC ¡to ¡determine ¡molecular ¡weight, ¡Kd ¡etc ¡for ¡detergent ¡solubilised ¡

proteins ¡

• Use ¡of ¡SANS ¡to ¡determine ¡localisaLon ¡of ¡components ¡within ¡detergent ¡solubilised ¡proteins ¡
• Self-­‑ ¡and ¡hetero-­‑associaLons: ¡AUC, ¡SANS ¡
• DeterminaLon ¡of ¡stoichiometry ¡via ¡AUC: ¡SE ¡& ¡SV ¡LtraLon ¡experiments ¡
• DeterminaLon ¡of ¡stoichiometry ¡via ¡SANS: ¡LtraLon ¡with ¡deuterated ¡component ¡

Detergent ¡solubilised ¡proteins: ¡density ¡matching ¡SE ¡ ¡

• In ¡SE ¡bouyant ¡molecular ¡weight ¡is ¡determined: ¡
• In ¡many ¡AUC ¡expts ¡we ¡want ¡to ¡observe ¡self-­‑associaLon ¡
• Density ¡matching ¡is ¡a ¡good ¡method ¡for ¡self-­‑associaLng ¡membrane ¡proteins ¡

¡

Burgess, ¡N. ¡K., ¡Stanley, ¡A. ¡M. ¡& ¡Fleming, ¡K. ¡G. ¡(2008). ¡DeterminaLon ¡of ¡Membrane ¡Protein ¡Molecular ¡Weights ¡and ¡AssociaLon ¡Equilibrium ¡ Constants ¡Using ¡SedimentaLon ¡Equilibrium ¡and ¡SedimentaLon ¡Velocity. ¡In ¡Methods ¡in ¡Cell ¡Biology ¡(J. ¡Correia ¡& ¡H. ¡W ¡ ¡Detrich, ¡III, ¡eds.), ¡ 84, ¡181-­‑211. ¡Academic ¡Press ¡ ¡

Density ¡matching ¡SE: ¡experimental ¡condiLons ¡

• Experimental ¡condiLons ¡adjusted ¡such ¡that: ¡
• solvent ¡ρ ¡= ¡effecLve ¡ρ ¡of ¡bound ¡detergent ¡
• So ¡detergent ¡becomes ¡effecLvely ¡invisible ¡to ¡centrifugal ¡field ¡
• SE ¡data ¡can ¡be ¡analysed ¡with ¡standard ¡methods ¡ ¡

0 ¡

BUT…..this ¡method ¡works ¡only ¡in ¡certain ¡condiLons ¡

• The ¡solvent ¡density ¡must ¡be ¡adjusted ¡with ¡D2O ¡or ¡D2

18O ¡

• AlternaLves ¡would ¡be ¡e.g. ¡sucrose ¡or ¡other ¡co-­‑solvent ¡
• Affect ¡chemical ¡potenLal ¡
• Leads ¡to ¡preferenLal ¡binding ¡and/or ¡exclusion ¡of ¡water ¡or ¡the ¡addiLonal ¡co-­‑solvent ¡at ¡the ¡

protein ¡surface ¡

• But ¡use ¡of ¡D2O ¡or ¡D2

18O ¡limits ¡detergents ¡that ¡can ¡be ¡used ¡

• ρ ¡D2O ¡= ¡1.1 ¡g/ml ¡
• ¡ ¡ ¡ ¡of ¡the ¡detergent ¡must ¡be ¡between ¡that ¡of ¡water ¡and ¡D2O ¡
• i.e. ¡0.9 ¡≤ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡≤ ¡1.0 ¡ml/g ¡
• Eliminates: ¡ ¡
• dodecylmaltoside ¡(ρ ¡= ¡1.21 ¡g/ml, ¡ ¡ ¡ ¡= ¡0.83 ¡ml/g) ¡
• β-­‑octylglucoside ¡(ρ ¡= ¡1.15 ¡g/ml, ¡ ¡ ¡ ¡= ¡0.87 ¡ml/g) ¡
• Suitable: ¡
• C8E5 ¡( ¡ ¡ ¡ ¡= ¡0.993 ¡ml/g) ¡
• C14SB ¡(density ¡matched ¡by ¡13% ¡D2O ¡in ¡20 ¡mM ¡Tris-­‑HCl, ¡200 ¡mM ¡KCl) ¡
• Dodecylphosphocholine ¡(DPC) ¡(density ¡matched ¡by ¡52.5% ¡D2O ¡in ¡50 ¡mM ¡Tris-­‑HCl, ¡100 ¡

mM ¡NaCl) ¡ v v v v v

¡DeterminaLon ¡of ¡density-­‑matching ¡point ¡for ¡C14SB ¡

• Determine ¡% ¡of ¡D2O ¡required ¡to ¡density ¡match ¡C14SB ¡micelles ¡in ¡background ¡
• f ¡other ¡buffer ¡components ¡
• 30 ¡mM ¡C14SB ¡in ¡20 ¡mM ¡Tris-­‑HCl, ¡200 ¡mM ¡KCl ¡made ¡in ¡0, ¡10, ¡20, ¡30% ¡D2O ¡
• Reference ¡solvent ¡the ¡same ¡minus ¡detergent ¡
• SE ¡observed ¡with ¡interference ¡opLcs ¡
• Collect ¡“buffer ¡blanks” ¡for ¡subtracLon ¡to ¡reduce ¡noise ¡
• Then ¡replace ¡buffer ¡with ¡micelle ¡soluLon ¡in ¡sample ¡channel ¡
• Rotor ¡speed ¡50k ¡rpm ¡
• T ¡= ¡25°C ¡

¡ radius ¡ fringes ¡ ρmicelle ¡> ¡ρsolvent ¡ ρmicelle ¡< ¡ρsolvent ¡ ρmicelle ¡= ¡ρsolvent ¡ % ¡D2O ¡ slope ¡of ¡distribuLon ¡ ¡ ¡ 0 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡10 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡20 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡30 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡

SE ¡of ¡systems ¡solublised ¡by ¡C14SB: ¡OMPLA ¡

• Outer ¡membrane ¡phospholipase ¡A ¡(OMPLA) ¡
• Beckman ¡XL-­‑A, ¡T ¡= ¡25°C ¡
• 20 ¡mM ¡Tris-­‑HCl, ¡200 ¡mM ¡KCl ¡ ¡
• 13% ¡D2O ¡
• [OMPLA] ¡= ¡0.3, ¡0.6. ¡0.9 ¡A280 ¡(12 ¡mm ¡pathlength) ¡
• Rotor ¡speed ¡= ¡16.3, ¡20, ¡24.5 ¡k ¡rpm ¡
• [C14SB] ¡= ¡5 ¡mM ¡
• Increased ¡[detergent] ¡results ¡in ¡diluLon ¡of ¡protein ¡that ¡is ¡solublised ¡in ¡

detergent ¡phase ¡thus ¡promoLng ¡dissociaLon ¡

• Monomer ¡mass ¡determined ¡

SE ¡of ¡systems ¡solublised ¡by ¡C14SB: ¡OmpF ¡

• E. ¡coli ¡OmpF ¡
• Beckman ¡XL-­‑A, ¡T ¡= ¡25°C ¡
• 20 ¡mM ¡Tris-­‑HCl, ¡100 ¡or ¡200 ¡mM ¡KCl ¡ ¡
• 13% ¡D2O ¡
• OmpF ¡normally ¡trimer ¡
• Collected ¡36 ¡data ¡sets: ¡
• [OmpF] ¡= ¡0.3, ¡0.6. ¡0.9 ¡A230 ¡(12 ¡mm ¡pathlength) ¡
• [C14SB] ¡= ¡5, ¡12 ¡& ¡30 ¡mM ¡
• Rotor ¡speed ¡= ¡9, ¡11, ¡13.5, ¡16.3 ¡k ¡rpm ¡

Which ¡speed? ¡

Chervenka, ¡C. ¡H. ¡A ¡Manual ¡of ¡Methods ¡for ¡the ¡Analy8cal ¡Ultracentrifuge. ¡ Spinco ¡Division, ¡Beckman ¡Instruments, ¡Palo ¡Alto, ¡1969. ¡

Which ¡speed? ¡

• Rotor ¡speed ¡chosen ¡to ¡opLmise ¡shape ¡of ¡equilibrium ¡distribuLon ¡
• Rule ¡of ¡thumb: ¡at ¡lowest ¡chosen ¡rotor ¡speed, ¡effecLve ¡molecular ¡weight ¡= ¡1 ¡
• MOmpF ¡= ¡111 ¡kDa ¡(trimer) ¡
• MOMPLA ¡= ¡32 ¡kDa ¡(monomer) ¡
• At ¡subsequent ¡speeds, ¡speed ¡factor ¡= ¡1.5 ¡
• This ¡ensures ¡that ¡in ¡global ¡fiCng ¡of ¡data ¡at ¡different ¡speeds, ¡data ¡are ¡different ¡

from ¡each ¡other ¡

OMPLA ¡studied ¡at ¡3 ¡concs, ¡3 ¡rotor ¡speeds ¡for ¡each ¡of ¡4 ¡ condiLons ¡

• 1. OMPLA ¡
• 2. OMPLA ¡+ ¡20 ¡mM ¡CaCl2 ¡
• 3. OMPLA ¡+ ¡covalently ¡bound ¡faWy ¡acyl ¡chain ¡substrate ¡analogue ¡
• 4. OMPLA ¡+ ¡covalently ¡bound ¡faWy ¡acyl ¡chain ¡substrate ¡analogue ¡+ ¡20 ¡mM ¡CaCl2 ¡

SE ¡results: ¡1. ¡OMPLA ¡

• SE ¡data ¡first ¡globally ¡fiWed ¡with ¡equaLon ¡

for ¡single ¡ideal ¡species ¡

• Fits ¡were ¡good ¡
• √σ2 ¡≈ ¡noise ¡of ¡instrument ¡(≈ ¡0.005) ¡
• Residuals ¡randomly ¡distributed ¡about ¡0 ¡
• M ¡for ¡all ¡9 ¡data ¡sets ¡was ¡within ¡5% ¡of ¡

known ¡monomer ¡M ¡

• Conclusion: ¡in ¡these ¡condiLons ¡OMPLA ¡is ¡

monomeric ¡

SE ¡results: ¡4. ¡OMPLA ¡+ ¡covalently ¡bound ¡faWy ¡acyl ¡chain ¡ substrate ¡analogue ¡+ ¡20 ¡mM ¡CaCl2 ¡

• 2 ¡faWy ¡acyl ¡chain ¡analogues ¡tested: ¡
• decylsulfonylfluoride ¡(DSF) ¡
• perfluorinated ¡octylsulfonylfluoride ¡(pOSF) ¡(all ¡H ¡replaced ¡by ¡F) ¡
• For ¡both ¡analogues, ¡fits ¡with ¡single ¡species ¡returned ¡M ¡> ¡Mmonomer ¡
• Therefore ¡tried ¡
• Monomer-­‑dimer ¡
• Monomer-­‑trimer ¡
• Monomer-­‑tetramer ¡
• FiCng ¡parameter ¡is ¡Kd ¡

OMPL-­‑DSF ¡reversibly ¡dimerises ¡

DSF: ¡monomer-­‑dimer ¡reversible ¡ pOSF: ¡monomer-­‑dimer ¡not ¡reversible ¡

OmpF ¡

• Self-­‑associaLon ¡was ¡probed ¡in ¡2 ¡ways: ¡
• Working ¡at ¡low ¡protein ¡concs ¡
• Increasing ¡the ¡detergent ¡concentraLon ¡
• At ¡each ¡detergent ¡conc, ¡SE ¡data ¡globally ¡fiWed ¡
• For ¡4 ¡rotor ¡speeds ¡& ¡3 ¡protein ¡concs ¡

Content ¡of ¡this ¡talk ¡

• Detergent ¡solubilised ¡systems: ¡AUC, ¡SANS ¡
• Use ¡of ¡H2O/D2O ¡+ ¡AUC ¡to ¡determine ¡molecular ¡weight, ¡Kd ¡etc ¡for ¡detergent ¡solubilised ¡

proteins ¡

• Use ¡of ¡SANS ¡to ¡determine ¡localisaLon ¡of ¡components ¡within ¡detergent ¡solubilised ¡proteins ¡
• Self-­‑ ¡and ¡hetero-­‑associaLons: ¡AUC, ¡SANS ¡
• DeterminaLon ¡of ¡stoichiometry ¡via ¡AUC: ¡SE ¡& ¡SV ¡LtraLon ¡experiments ¡
• DeterminaLon ¡of ¡stoichiometry ¡via ¡SANS: ¡LtraLon ¡with ¡deuterated ¡component ¡

The ¡route ¡for ¡colicin ¡N ¡entry ¡into ¡E. ¡coli ¡cells ¡

Cli~on ¡L ¡A ¡et ¡al. ¡J. ¡Biol. ¡Chem. ¡2012;287:337-­‑346 ¡

Cli~on ¡L ¡A ¡et ¡al. ¡J. ¡Biol. ¡Chem. ¡2012;287:337-­‑346 ¡

SANS ¡data ¡for ¡the ¡d-­‑OmpF:h-­‑colicin ¡complex ¡

13% ¡D20 ¡ 41% ¡D20 ¡ 87% ¡D20 ¡ 100% ¡D20 ¡ ¡

CRYSON ¡curve ¡for ¡ OmpF ¡trimer ¡cf ¡ d-­‑OmpF:h-­‑ColN ¡ @ ¡41% ¡D2O ¡ ¡ Detergent ¡matched ¡ H-­‑ColN ¡matched ¡ D-­‑OmpF ¡matched ¡ Nothing ¡matched ¡ ¡ Data ¡globally ¡ fiWed ¡with ¡ MONSA ¡ ¡

The ¡OmpF-­‑colicin ¡complex ¡modeled ¡from ¡SANS ¡data ¡

Cli~on ¡L ¡A ¡et ¡al. ¡J. ¡Biol. ¡Chem. ¡2012;287:337-­‑346 ¡

Content ¡of ¡this ¡talk ¡

• Detergent ¡solubilised ¡systems: ¡AUC, ¡SANS ¡
• Use ¡of ¡H2O/D2O ¡+ ¡AUC ¡to ¡determine ¡molecular ¡weight, ¡Kd ¡etc ¡for ¡detergent ¡solubilised ¡

proteins ¡

• Use ¡of ¡SANS ¡to ¡determine ¡localisaLon ¡of ¡components ¡within ¡detergent ¡solubilised ¡proteins ¡
• Self-­‑ ¡and ¡hetero-­‑associaLons: ¡AUC, ¡SANS ¡
• DeterminaLon ¡of ¡stoichiometry ¡via ¡AUC: ¡SE ¡& ¡SV ¡LtraLon ¡experiments ¡
• DeterminaLon ¡of ¡stoichiometry ¡via ¡SANS: ¡LtraLon ¡with ¡deuterated ¡component ¡

• E3 ¡binds ¡to ¡E3BP ¡
• E3 ¡forms ¡a ¡homo-­‑dimer ¡

Hetero-­‑associaLon: ¡PDC ¡E3BP-­‑DD:E3 ¡sub-­‑complex ¡

NaLve ¡PAGE: ¡stoichiometry ¡is ¡2:1 ¡

Mischa ¡Smolle ¡ Smolle ¡et ¡al., ¡JBC ¡281 ¡19771-­‑80 ¡(2006) ¡

Isothermal ¡LtraLon ¡calorimetry ¡(ITC) ¡

• Series ¡of ¡small ¡volumes ¡of ¡concentrated ¡ligand ¡injected ¡into ¡binding ¡partner ¡
• Amount ¡of ¡heat ¡taken ¡up/given ¡out ¡upon ¡complex ¡formaLon ¡is ¡measured ¡
• Non-­‑linear ¡regression ¡of ¡data ¡gives ¡
• DissociaLon ¡constant ¡(Kd) ¡
• Stoichiometry ¡of ¡binding ¡(n) ¡
• Enthalpy ¡(∆H) ¡
• From ¡this ¡can ¡determine ¡free ¡energy ¡
• ∆G ¡= ¡-­‑RTln(1/Kd) ¡
• And ¡entropy ¡
• T∆S ¡ ¡= ¡∆H ¡-­‑ ¡∆G ¡

Kd ¡and ¡Ka: ¡ equilibrium ¡dissociaLon ¡and ¡associaLon ¡constants ¡ P ¡+ ¡L ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡PL ¡ k1 ¡ k-­‑1 ¡

[P]free ¡= ¡conc. ¡free ¡protein ¡ [PL] ¡= ¡conc. ¡complex ¡ rate ¡constant ¡for ¡ PL ¡formaLon ¡ ¡ rate ¡constant ¡for ¡ PL ¡breakdown ¡ ¡ rate ¡of ¡PL ¡formaLon ¡= ¡k1[P]free[L]free ¡ ¡ rate ¡of ¡PL ¡breakdown ¡= ¡k-­‑1[PL] ¡ ¡ [L]free ¡= ¡conc. ¡free ¡ligand ¡

At ¡equilibrium ¡

rate ¡of ¡PL ¡formaLon ¡= ¡k1[P]free[L]free ¡= ¡rate ¡of ¡PL ¡breakdown ¡= ¡k-­‑1[PL] ¡ ¡ ¡ ¡ Kd ¡= ¡k-­‑1/k1 ¡= ¡[P]free[L]free/[PL] ¡= ¡1/Ka ¡ y ¡= ¡fracLon ¡of ¡protein ¡binding ¡sites ¡occupied ¡= ¡[PL]/([PL] ¡+ ¡[P]free) ¡ = ¡[L]free/([L]free ¡+ ¡Kd) ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡y ¡ ¡ ¡= ¡ ¡[L]free/([L]free ¡+ ¡Kd) ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ For ¡[L]free ¡= ¡0: ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡y ¡= ¡0 ¡ ¡nothing ¡bound ¡ ¡ For ¡[L]free ¡→∞: ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡y ¡ ¡= ¡1 ¡ ¡full ¡occupancy ¡ ¡ For ¡[L]free ¡= ¡Kd: ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡y ¡= ¡0.5 ¡ ¡ ¡ ¡half ¡occupancy ¡ ¡ ¡ Two ¡possible ¡ways ¡to ¡determine ¡binding ¡constants: ¡ ¡ 1. Measure ¡bound ¡and ¡free ¡ligand ¡at ¡equilibrium ¡as ¡a ¡funcLon ¡of ¡concentraLon ¡ (AUC, ¡ITC) ¡ ¡ 2. Measure ¡associaLon ¡and ¡dissociaLon ¡rate ¡constants ¡and ¡use ¡these ¡to ¡calculate ¡ binding ¡constants ¡(SPR) ¡ ¡

Slide ¡from ¡hWp://www2.mrc-­‑lmb.cam.ac.uk/groups/hmm/techniqs/ITC/Calorimetry%20Tutorial.ppt_files/Calorimetry%20Tutorial.ppt.ppt ¡

Special ¡cases…. ¡

Slide ¡from ¡hWp://www2.mrc-­‑lmb.cam.ac.uk/groups/hmm/techniqs/ITC/Calorimetry%20Tutorial.ppt_files/Calorimetry%20Tutorial.ppt.ppt ¡

Special ¡cases…. ¡

y ¡ ¡ ¡= ¡ ¡[L]free/([L]free ¡+ ¡Kd) ¡ ¡ For ¡[L]free ¡= ¡0: ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡y ¡= ¡0 ¡ ¡nothing ¡bound ¡ For ¡[L]free ¡→∞: ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡y ¡ ¡= ¡1 ¡ ¡full ¡occupancy ¡ For ¡[L]free ¡= ¡Kd: ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡y ¡= ¡0.5 ¡ ¡ ¡ ¡half ¡occupancy ¡

• Two ¡possible ¡ways ¡to ¡determine ¡binding ¡constants: ¡
• 1. Measure ¡bound ¡and ¡free ¡ligand ¡at ¡equilibrium ¡as ¡a ¡funcLon ¡of ¡concentraLon ¡

(AUC, ¡ITC) ¡ ¡

• 2. Measure ¡associaLon ¡and ¡dissociaLon ¡rate ¡constants ¡and ¡use ¡these ¡to ¡calculate

¡ binding ¡constants ¡(SPR) ¡

• 4
• 2

30 60 90 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

• 15
• 10
• 5

Ligand / Protein µcal/s kcal/mol Ligand Time (min)

stochiometry: N enthalpy: ΔH affinity: 1/Kd Image ¡from ¡hWp://www2.mrc-­‑lmb.cam.ac.uk/groups/hmm/techniqs/ITC/Calorimetry%20Tutorial.ppt_files/Calorimetry%20Tutorial.ppt.ppt ¡

Fit ¡to ¡binding ¡curve ¡with ¡appropriate ¡model ¡gives ¡Kd, ¡n, ¡∆H ¡

• Heat ¡taken ¡up/given ¡out ¡

upon ¡ligand ¡binding ¡(Q) ¡

• V0 ¡= ¡vol ¡ITC ¡cell ¡
• [M]t ¡= ¡total ¡conc ¡binding ¡

partner ¡(bound ¡+ ¡free) ¡

• ni ¡= ¡stoichiometry ¡of ¡ith ¡

interacLon ¡

• ∆H ¡= ¡enthalpy ¡of ¡binding ¡

per ¡mole ¡of ¡ligand ¡

• Kai ¡= ¡associaLon ¡constant ¡
• f ¡ith ¡interacLon ¡
• [L] ¡= ¡conc ¡free ¡ligand ¡

Q = V0 M ! " # $t niΔHiKai[L]

( )

i=1 n

∑

1+Kai[L]

Image ¡from ¡hWp://www2.mrc-­‑lmb.cam.ac.uk/groups/hmm/techniqs/ITC/Calorimetry%20Tutorial.ppt_files/Calorimetry%20Tutorial.ppt.ppt ¡

ITC ¡is ¡done ¡at ¡a ¡constant ¡temperature ¡

Typical ¡ITC ¡apparatus ¡

hWp://www.microcal.com/products/default.asp ¡

VP-­‑ITC ¡ iTC200 ¡

Sample ¡requirements ¡

• Sample ¡volume/concentraLon ¡depends ¡on ¡instrument ¡
• Microcal ¡VP-­‑ITC: ¡1.4 ¡ml ¡
• Microcal ¡iTC200: ¡200 ¡µl, ¡≥ ¡10 ¡pg ¡protein! ¡
• Range ¡of ¡sensiLvity ¡depends ¡on ¡experiment ¡
• Typically ¡Kd ¡≈ ¡sub ¡mM ¡– ¡nM ¡
• When ¡Kd ¡< ¡10 ¡nM ¡saturaLon ¡reached ¡in ¡1-­‑2 ¡injecLons, ¡so ¡LtraLons ¡loose ¡sigmoidal ¡

shape ¡

• But ¡can ¡access ¡nM ¡– ¡pM ¡with ¡compeLLve ¡binding ¡assay ¡

ITC: ¡stoichiometry ¡is ¡2:1 ¡

• Microcal ¡VP-­‑ITC ¡
• T ¡= ¡25°C ¡
• Proteins ¡dialysed ¡o/n ¡vs ¡ref ¡buffer ¡
• 10 ¡µl ¡aliquots ¡E3 ¡(40.7 ¡µM) ¡Ltrated ¡into ¡6.2 ¡µM ¡

E3BP-­‑DD ¡

• Data ¡fiWed ¡with ¡non-­‑linear ¡regression ¡model ¡

(Microcal ¡so~ware) ¡

• Kd ¡= ¡36 ¡nM ¡
• ∆H ¡= ¡-­‑12.1 ¡kcal/mol ¡
• T∆S ¡= ¡-­‑1.7 ¡kcal/mol ¡ ¡
• N ¡= ¡0.5 ¡molecules ¡E3 ¡bind/molecule ¡E3BP-­‑DD ¡
• equivalent ¡to ¡2 ¡E3BP-­‑DD/E3 ¡ ¡

Mischa ¡Smolle, ¡Alan ¡Cooper ¡ Smolle ¡et ¡al., ¡JBC ¡281 ¡19771-­‑80 ¡(2006) ¡ E3BP-­‑DD:E3 ¡molar ¡raLo ¡

SV ¡LtraLon ¡

• T ¡= ¡4°C ¡
• Must ¡ensure ¡that ¡T ¡is ¡constant ¡
• Takes ¡hours ¡to ¡thermally ¡equilibrate ¡
• Rotor ¡speed ¡45k ¡rpm ¡
• Interference ¡opLcs ¡used ¡
• Scan ¡interval ¡1 ¡minute ¡
• [E3] ¡= ¡4.9 ¡µM ¡
• Sample ¡volume ¡380 ¡µl ¡
• Pathlength ¡12 ¡mm ¡

Mischa ¡Smolle ¡ Smolle ¡et ¡al., ¡JBC ¡281 ¡19771-­‑80 ¡(2006) ¡

SV ¡LtraLon: ¡stoichiometry ¡is ¡2:1 ¡ ¡

• Expt ¡1: ¡SV ¡of ¡E3 ¡alone; ¡SV ¡of ¡E3BP-­‑DD ¡alone ¡
• Determine ¡their ¡s ¡
• Expt ¡2: ¡SV ¡of ¡E3BP-­‑DD+E3 ¡
• At ¡which ¡raLo ¡does ¡the ¡E3BP-­‑DD ¡peak ¡vanish? ¡
• This ¡reveals ¡stoichiometry: ¡2:1 ¡
• Note ¡2 ¡complex ¡peaks ¡
• Different ¡conformaLons ¡
• s ¡≈ ¡6 ¡S ¡peak ¡less ¡compact ¡
• s ¡≈ ¡8 ¡S ¡peak ¡more ¡compact ¡

E3BP-­‑DD ¡ E3 ¡

4:1 ¡ 3:1 ¡ 2:1 ¡ 1:1 ¡ 1:2 ¡ 1:3 ¡

E3BP-­‑DD ¡ complex ¡ also ¡complex ¡ Mischa ¡Smolle ¡ Smolle ¡et ¡al., ¡JBC ¡281 ¡19771-­‑80 ¡(2006) ¡

SE ¡LtraLon ¡

• From ¡amino ¡acid ¡sequence: ¡
• E3BP-­‑DD ¡M ¡= ¡19.5 ¡kDa ¡
• E3 ¡M ¡= ¡105 ¡kDa ¡
• Sample ¡volume ¡= ¡30 ¡µl ¡
• Path-­‑length ¡3 ¡mm ¡
• SE ¡performed ¡at ¡3 ¡rotor ¡speeds ¡
• 8.5, ¡12, ¡16 ¡k ¡rpm ¡
• Appropriate ¡for ¡different ¡complexes ¡
• Absorbance ¡data ¡(280 ¡nm) ¡
• Radial ¡step ¡size ¡0.001 ¡cm ¡
• Program ¡WINMATCH ¡used ¡to ¡demonstrate ¡aWainment ¡
• f ¡equilibrium ¡
• Comparison ¡of ¡scans ¡3 ¡h ¡apart ¡

Mischa ¡Smolle ¡ Smolle ¡et ¡al., ¡JBC ¡281 ¡19771-­‑80 ¡(2006) ¡

SE ¡LtraLon: ¡stoichiometry ¡is ¡2:1 ¡

• Whole-­‑cell ¡weight-­‑average ¡M ¡

determined ¡(Mw,app) ¡

• e.g. ¡using ¡species ¡analysis ¡model ¡in ¡SEDPHAT ¡

with ¡1 ¡species ¡only ¡

• No ¡model ¡assumed ¡
• When ¡E3BP-­‑DD ¡is ¡in ¡excess ¡
• Mw,app ¡< ¡Mcomplex ¡unLl ¡complex ¡is ¡formed ¡
• When ¡E3 ¡is ¡in ¡excess ¡
• Mw,app ¡< ¡Mcomplex ¡because ¡complex ¡excess ¡E3 ¡

lowers ¡Mw,app ¡

• ??? ¡Why ¡Mw,app ¡≠ ¡Mcomplex ¡at ¡2:1??? ¡

E3 ¡ (E3BP-­‑DD)2E3 ¡ (E3BP-­‑DD)1E3 ¡ E3BP-­‑DD:E3 ¡molar ¡raLo ¡ Mischa ¡Smolle ¡ Smolle ¡et ¡al., ¡JBC ¡281 ¡19771-­‑80 ¡(2006) ¡

Structure ¡of ¡E3BP:E3 ¡subcomplex ¡inferred ¡from ¡SAXS ¡data ¡

p(r) ¡vs ¡r ¡ ab ¡ini8o ¡ rigid ¡body ¡modelling ¡ Mischa ¡Smolle ¡ Smolle ¡et ¡al., ¡JBC ¡281 ¡19771-­‑80 ¡(2006) ¡

Plausible ¡E3BP-­‑DD:E3 ¡models ¡

Only ¡1 ¡E3BP-­‑DD ¡lipoyl ¡domain ¡is ¡docked ¡into ¡E3 ¡

BrauLgam ¡et ¡al. ¡Structure ¡(2006) ¡14, ¡611–21 ¡ Mischa ¡Smolle ¡ Smolle ¡et ¡al., ¡JBC ¡281 ¡19771-­‑80 ¡(2006) ¡

4:1 ¡ 3:1 ¡ 2:1 ¡ 1:1 ¡ 1:2 ¡ 1:3 ¡

E3BP-­‑DD ¡ complex ¡ also ¡complex ¡

E3BP ¡is ¡one ¡of ¡2 ¡proteins ¡in ¡the ¡human ¡PDC ¡core ¡complex ¡

Olwyn ¡Byron ¡ Vijayakrishnan ¡et ¡al. ¡Biochem ¡J. ¡(2011) ¡437, ¡565-­‑574 ¡

SV ¡of ¡E2/E3BP ¡

• T ¡= ¡4°C ¡
• Rotor ¡speed ¡20k ¡rpm ¡
• Interference ¡opLcs ¡used ¡
• 450 ¡scans, ¡interval ¡1 ¡minute ¡
• Absorbance ¡data ¡(280 ¡nm) ¡
• Radial ¡step ¡size ¡0.002 ¡cm ¡
• Sample ¡volume ¡360 ¡µl ¡
• Pathlength ¡12 ¡mm ¡

Mischa ¡Smolle ¡ Smolle ¡et ¡al., ¡JBC ¡281 ¡19771-­‑80 ¡(2006) ¡

Is ¡E3BP:E3 ¡stoichiometry ¡2:1 ¡in ¡PDC ¡E2/E3BP ¡core? ¡

rE2/E3BP ¡ rE2 ¡ tE2/E3BP ¡ s20,w =29.3S s20,w =27.5S

Swetha ¡Vijayakrishnan ¡ Vijayakrishnan ¡et ¡al. ¡JMB ¡(2010) ¡399, ¡71-­‑93 ¡

NegaLve ¡stain ¡EM: ¡icosahedral ¡cores ¡with ¡empty ¡ pentagonal ¡faces ¡and ¡5-­‑ ¡3-­‑ ¡& ¡2-­‑fold ¡symmetry ¡

David ¡Bhella ¡ Vijayakrishnan ¡et ¡al. ¡JMB ¡(2010) ¡399, ¡71-­‑93 ¡

CD: ¡E3BP ¡destabilises ¡the ¡PDC ¡core ¡

E2/E3BP ¡ E2 ¡

Sharon ¡Kelly ¡ Vijayakrishnan ¡et ¡al. ¡Biochem ¡J. ¡(2011) ¡437, ¡565-­‑574 ¡

FS: ¡E3BP ¡destabilises ¡the ¡PDC ¡core ¡

E2/E3BP ¡ E2 ¡

Swetha ¡Vijayakrishnan ¡ Vijayakrishnan ¡et ¡al. ¡Biochem ¡J. ¡(2011) ¡437, ¡565-­‑574 ¡

SAXS: ¡great ¡data ¡for ¡rE2/E3BP! ¡

• M ¡(from ¡I(0)) ¡≈ ¡3.17 ¡MDa ¡(cf ¡3.55 ¡MDa ¡for ¡48+12) ¡
• Ab ¡ini8o ¡modelling ¡of ¡cores ¡
• GASBOR ¡(dummy ¡residues) ¡
• ImposiLon ¡of ¡icosahedral ¡(532) ¡symmetry ¡ ¡
• ComputaLonally ¡intensive ¡
• SCOTGRID ¡cluster ¡
• Typical ¡run ¡Lme ¡~ ¡7 ¡days ¡

Swetha ¡Vijayakrishnan ¡ Vijayakrishnan ¡et ¡al. ¡JMB ¡(2010) ¡399, ¡71-­‑93 ¡

SANS: ¡great ¡data ¡for ¡rE2/E3BP! ¡

• M ¡(from ¡I(0)) ¡≈ ¡3.66 ¡MDa ¡(cf ¡3.55 ¡MDa ¡for ¡48+12) ¡

Swetha ¡Vijayakrishnan ¡ Vijayakrishnan ¡et ¡al. ¡JMB ¡(2010) ¡399, ¡71-­‑93 ¡

Ab ¡ini8o ¡models ¡consistent ¡with ¡ ¡

• B. ¡stearothermophilus ¡core ¡crystal ¡structure ¡ ¡

tE2/E3BP ¡ 5-­‑fold ¡ 2-­‑fold ¡

• B. ¡Stearothermophilus ¡tE2 ¡

Homology ¡model ¡of ¡ human ¡tE2 ¡ Swetha ¡Vijayakrishnan, ¡Phil ¡Callow ¡ Vijayakrishnan ¡et ¡al. ¡JMB ¡(2010) ¡399, ¡71-­‑93 ¡

Ab ¡ini8o ¡modelling ¡with ¡icosahedral ¡symmetry ¡restores ¡ core ¡soluLon ¡structures ¡ ¡

rE2/E3BP ¡ bE2/E3BP ¡ 5-­‑fold ¡ 2-­‑fold ¡ 2-­‑fold ¡ 5-­‑fold ¡

Swetha ¡Vijayakrishnan ¡ Vijayakrishnan ¡et ¡al. ¡JMB ¡(2010) ¡399, ¡71-­‑93 ¡

SV ¡LtraLon: ¡rE2/E3BP:E3 ¡

• Rotor ¡speed ¡20k ¡rpm ¡
• Interference ¡opLcs ¡used ¡
• Scan ¡interval ¡1 ¡minute ¡
• [rhE2/E3BP] ¡= ¡191.5 ¡nM ¡
• Sample ¡volume ¡360 ¡µl ¡
• Pathlength ¡12 ¡mm ¡

Swetha ¡Vijayakrishnan ¡ Vijayakrishnan ¡et ¡al. ¡Biochem ¡J. ¡(2011) ¡437, ¡565-­‑574 ¡

What ¡is ¡the ¡stoichiometry ¡of ¡rE2/E3BP:E3? ¡ ¡

Swetha ¡Vijayakrishnan ¡ Vijayakrishnan ¡et ¡al. ¡Biochem ¡J. ¡(2011) ¡437, ¡565-­‑574 ¡

GFC ¡ SV ¡

Cryo-­‑EM ¡reconstrucLons ¡of ¡rE2/E3BP ¡± ¡E3: ¡evidence ¡of ¡ cross-­‑bridging, ¡consistent ¡with ¡2:1 ¡

rE2/E3BP:E3 ¡ rE2/E3BP ¡

• B. ¡Stearothermophilus ¡tE2 ¡

rE2/E3BP ¡-­‑ ¡lower ¡contour ¡level ¡

rE2/E3BP ¡SAXS ¡

Biochemistry ¡(5th ¡EdiLon), ¡R. ¡Garret ¡and ¡C. ¡Grisham ¡ (Cengage ¡publishers) ¡ ¡ Rob ¡Gilbert ¡ Vijayakrishnan ¡et ¡al. ¡JMB ¡(2010) ¡399, ¡71-­‑93 ¡

How ¡many ¡E3 ¡bind ¡to ¡the ¡PDC ¡core ¡complex? ¡

• Could ¡determine ¡with ¡SAXS ¡
• But ¡we ¡do ¡not ¡know ¡what ¡is ¡the ¡composiLon ¡of ¡the ¡PDC ¡core ¡
• 48 ¡E2 ¡+ ¡12 ¡E3BP? ¡
• 40 ¡E2 ¡+ ¡20 ¡E3BP? ¡
• Could ¡determine ¡with ¡AUC ¡
• Using ¡SE ¡ ¡

¡

SE ¡of ¡E2/E3BP ¡

• Sample ¡volume ¡= ¡80 ¡µl ¡
• Path-­‑length ¡12 ¡mm ¡
• SE ¡performed ¡at ¡3 ¡rotor ¡speeds ¡
• 3, ¡5, ¡7k ¡rpm ¡
• 5 ¡& ¡7k ¡data ¡too ¡steep ¡for ¡analysis ¡
• Absorbance ¡data ¡(280 ¡nm) ¡
• Radial ¡step ¡size ¡0.001 ¡cm ¡
• Program ¡WINMATCH ¡used ¡to ¡demonstrate ¡aWainment ¡
• f ¡equilibrium ¡
• Comparison ¡of ¡scans ¡3 ¡h ¡apart ¡

Mischa ¡Smolle ¡ Smolle ¡et ¡al., ¡JBC ¡281 ¡19771-­‑80 ¡(2006) ¡

SE ¡global ¡analysis: ¡unexpected ¡lower ¡M ¡for ¡non-­‑truncated ¡ cores ¡

Mw

0 =2.57MDa (3.55MDa)

Mw

0 =3.06MDa (3.74MDa)

Mw

0 =1.65MDa (1.67MDa)

Swetha ¡Vijayakrishnan ¡ Vijayakrishnan ¡et ¡al. ¡JMB ¡(2010) ¡399, ¡71-­‑93 ¡

rhE2/E3BP ¡ rhE2 ¡ tE2/E3BP ¡

rE2/E3BP ¡and ¡rE2 ¡extended ¡domains ¡are ¡cleaved ¡during ¡ lengthy ¡SE ¡AUC ¡

Swetha ¡Vijayakrishnan ¡

Vijayakrishnan ¡et ¡al. ¡JMB ¡(2010) ¡399, ¡71-­‑93 ¡

Content ¡of ¡this ¡talk ¡

• Detergent ¡solubilised ¡systems: ¡AUC, ¡SANS ¡
• Use ¡of ¡H2O/D2O ¡+ ¡AUC ¡to ¡determine ¡molecular ¡weight, ¡Kd ¡etc ¡for ¡detergent ¡solubilised ¡

proteins ¡

• Use ¡of ¡SANS ¡to ¡determine ¡localisaLon ¡of ¡components ¡within ¡detergent ¡solubilised ¡proteins ¡
• Self-­‑ ¡and ¡hetero-­‑associaLons: ¡AUC, ¡SANS ¡
• DeterminaLon ¡of ¡stoichiometry ¡via ¡AUC: ¡SE ¡& ¡SV ¡LtraLon ¡experiments ¡
• DeterminaLon ¡of ¡stoichiometry ¡via ¡SANS: ¡LtraLon ¡with ¡deuterated ¡component ¡

SANS ¡LtraLon ¡of ¡rE2/E3BP ¡with ¡dE3 ¡

• Deuterated ¡E3 ¡(dE3) ¡– ¡enhances ¡sensiLvity ¡of ¡experiment ¡
• /e ¡in ¡BL21 ¡(DE3) ¡E. ¡coli ¡
• Grown ¡in ¡Enfors ¡minimal ¡medium ¡(85% ¡D2O, ¡hydrogenated ¡glycerol ¡as ¡C ¡source) ¡
• Enfors ¡fermentaLon ¡system ¡
• unLl ¡OD600 ¡nm ¡= ¡15 ¡(!) ¡
• T ¡= ¡30°C ¡ ¡
• Beamline ¡D22 ¡at ¡ILL, ¡Grenoble ¡ ¡
• Sample-­‑to-­‑detector ¡distance ¡= ¡4 ¡& ¡14 ¡m ¡
• 0.034 ¡< ¡Q ¡< ¡1.43 ¡nm-­‑1 ¡
• T ¡= ¡4°C ¡
• Transmission ¡data ¡recorded ¡for ¡4 ¡mins ¡
• ScaWering ¡data ¡recorded ¡for ¡15 ¡mins ¡
• Pathlength ¡= ¡1 ¡mm ¡
• [rE2/E3BP] ¡= ¡1.04 ¡µM ¡

SANS ¡LtraLon: ¡rE2/E3BP ¡core ¡binds ¡10 ¡E3s ¡

• pE2/E3BP ¡+ ¡dE3 ¡in ¡100% ¡D2O ¡
• If ¡48+12, ¡2:1 ¡means ¡E2/E3BP ¡core ¡

binds ¡6E3s ¡

• 10E3s ¡means ¡20E3BP ¡
• Therefore ¡model ¡is ¡not ¡

48E2+12E3BP ¡

• 40E2+20E3BP? ¡
• Does ¡subunit ¡composiLon ¡

depend ¡on ¡relaLve ¡ expression ¡levels? ¡

Phil ¡Callow, ¡Swetha ¡Vijayakrishnan ¡ Vijayakrishnan ¡et ¡al. ¡Biochem ¡J. ¡(2011) ¡437, ¡565-­‑574 ¡

rE2/E3BP ¡core ¡is ¡40E2+20E3BP ¡

David ¡Gilbert, ¡Peter ¡Kropholler ¡ Vijayakrishnan ¡et ¡al. ¡Biochem ¡J. ¡(2011) ¡437, ¡565-­‑574 ¡

The ¡workers ¡

Gordon ¡ Lindsay ¡

GU ¡

Mischa ¡ Smolle ¡

GU, ¡now ¡ Stowers ¡ Inst, ¡US ¡ ¡

¡ Sylke ¡ Müller ¡

GU ¡

David ¡ Bhella ¡

GU ¡

Rob ¡ Gilbert ¡

U ¡Oxford ¡

Olwyn ¡ Byron ¡

GU ¡

Swetha ¡ Vijayakrishnan ¡

GU ¡

Phil ¡Callow ¡

ILL ¡France ¡

Peter ¡ Kropholler ¡

GU ¡

Sharon ¡ Kelly ¡

GU ¡

David ¡ Gilbert ¡

U ¡Brunel ¡

¡ Larissa ¡ Laine ¡

GU ¡

The ¡workers ¡