DNA REPL KASYONU VE REKOMB NASYONU (Kaynak: Genetik Kavramlar, - PowerPoint PPT Presentation

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA Polimeraz I ¤ DNA polimeraz I ile yönlendirilen sentez genelde yarı saklı replikasyondaki gibi gerçekle ş ir. 28

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Zincir uzaması nasıl gerçekle ş ir ? ¤ Öncü dNTP’de, deoksiribozun 5’ karbonuna üç adet fosfat grubu ba ğ lıdır. ¤ Sentez esnasında uçtaki iki fosfat grubu kopar. ¤ 5’ karbona ba ğ lı fosfat grubu, ilave edilece ğ i deoksiribozun 3’ OH grubuna kovalent ba ğ lanır. ¤ Böylece zincir uzaması 5’-3’ yönünde devam eder. 29

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Zincir uzaması nasıl gerçekle ş ir ? 30

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA büyük do ğ rulukla sentezlenir ¤ Kornberg, DNA sentezinin nasıl gerçekle ş ti ğ ini anladıktan sonra, enzimin DNA kalıbını ne derece do ğ rulukla sentezledi ğ ini ara ş tırmı ş tır. ¤ Bunun için DNA kalıbı ile yeni sentezlenen DNA’nın bazlarını kar ş ıla ş tırmı ş tır. 31

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Polimeraz I DNA sentezinden sorumlu tek enzim midir? ¤ Kornberg’in çalı ş malarına ra ğ men ara ş tırıcıların tümü DNA polimeraz I’in hücrede DNA’yı kopyalayan tek enzim oldu ğ una ikna olmamı ş lardır. ¤ Bunun sebebi; ¤ DNA’nın in vitro sentezinin in vivo sentezine göre çok yava ş olması ¤ Enzimin tek zincirli DNA’yı, çift zincirli DNA’ya göre daha etkin bir biçimde kopyalaması ¤ Enzimin DNA’yı yıkabilmesi yani ekzonükleaz aktivite göstermesiydi. 32

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Polimeraz I DNA sentezinden sorumlu tek enzim midir? ¤ Kornberg’e göre DNA polimeraz I, in vitro ko ş ullarda biyolojik olarak aktif DNA sentezleyebiliyorsa, hücre içinde de DNA sentezinin ba ş lıca katalizörü olmalıydı. ¤ Biyolojik olarak aktif ifadesi, sentezlenen DNA’nın metabolik aktiviteleri destekleyebilmesi ve kopyalandı ğ ı organizmanın üremesini yönlendirebilmesi anlamında kullanılmaktadır. 33

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Polimeraz I DNA sentezinden sorumlu tek enzim midir? ¤ Polimeraz I’in biyolojik olarak aktif DNA sentezinde görevli enzim oldu ğ u saptanmı ş tı. ¤ Fakat Peter DeLucia ve John Cairns’in DNA polimeraz I aktivitesine sahip olmayan mutant bir E. coli su ş unda yaptıkları deney, polimeraz I’in gerçek biyolojik rolü hakkında ş üpheler uyandırmı ş tır. 34

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Polimeraz I DNA sentezinden sorumlu tek enzim midir? ¤ Polimeraz I aktivitesi göstermeyen yani polA1 mutasyonu içeren bu E. coli su ş u; ¤ DNA’sını kopyalayıp üremeyi ba ş armı ş , ancak hücreler onarım bakımından çok yetersiz kalmı ş tır. ¤ Örne ğ in mutant su ş UV ya da radyasyona son derece hassastır. ¤ Oysa mutant olmayanlar UV hasarını önemli derecede tamir edebilir. 35

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Polimeraz I DNA sentezinden sorumlu tek enzim midir? ¤ Bu gözlemlerden 2 sonuç elde edilmi ş tir. ¤ E. coli ’de in vivo DNA replikasyonundan sorumlu en az bir enzim daha bulunmalıdır. ¤ DNA polimeraz I’in in vivo ko ş ullarda bir i ş levi daha bulunabilir. ¤ Bugüne kadar polimeraz I aktivitesi olan veya olmayan hücrelerden 4 özgün DNA polimeraz elde edilmi ş tir. 36

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA Polimeraz I,II ve III ¤ Bu üç enzimin hiçbiri bir kalıptan DNA sentezi ba ş latamaz. ¤ Üçü de primer adı verilen bir DNA zincirini kalıp boyunca uzatabilir. 37

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA Polimeraz I,II ve III ¤ DNA polimeraz enzimlerinin hepsinin a ğ ırlı ğ ı 100.000 Dalton’un üzerindedir. ¤ Üçünün de 3’-5’ ekzonükleaz aktivitesi bulunur. 38

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Ekzonükleaz aktivitesi ne demektir? ¤ Polimerizasyonu tek yönde gerçekle ş tirme, bir an duraksayıp yön de ğ i ş tirerek ilave edilen nükleotidleri çıkarabilme aktivitesini ifade eder. ¤ Bu aktivite yeni sentezlenen DNA’da hata olup olmadı ğ ını kontrol eder (proof reading) ve yanlı ş girmi ş nükleotidleri do ğ rusu ile de ğ i ş tirir. 39

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Ekzonükleaz aktivitesi ¤ DNA polimeraz I’in 5’-3’ ekzonükleaz aktivitesi de vardır. ¤ Bu aktivite, sentezin ba ş ladı ğ ı uçtan itibaren nükleotidlerin kesilmesini ve sonra sentez yönünde i ş levine devam etmesini sa ğ lar. 40

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Kornberg neden DNA polimeraz III’e degil de I’e rastladı? ¤ Çünkü; ¤ Hücrede polimeraz I daha fazla bulunur. ¤ Polimeraz I daha dayanıklıdır. 41

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Polimeraz III’ün i ş levi ¤ Replikasyonda gerekli olan 5’-3’ polimerizasyonundan sorumlu asıl enzimdir. ¤ Sentez sırasında hatalı bir nükleotid ile kar ş ıla ş ıldı ğ ında onarım gerçekle ş tirir. ¤ Bu durumda sentez duraksar, polimeraz rotasını de ğ i ş tirerek yanlı ş nükleotidi çıkarır. ¤ Sonra tekrar 5’-3’ yönünde kalıp zincirin sentezine devam eder. 42

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Polimeraz I’in i ş levi ¤ Primeri uzakla ş tırır ve sentez sırasında olu ş an bo ş luklarda DNA sentezleyerek bu bölgeleri doldurur. ¤ Enzimin ekzonükleaz aktivitesi onun DNA onarımına katılmasını sa ğ lar. 43

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Polimeraz II’nin i ş levi ¤ Polimeraz II, polimeraz IV ve V ile birlikte UV gibi dı ş etmenler sonucu hasar gören DNA onarımında yer alırlar. 44

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Polimeraz III kompleks yapıdadır ¤ Polimeraz III enzimi holoenzim olarak adlandırılan yapıdadır. ¤ 10 farklı polipeptit zincirinden meydana gelmi ş bir dimerdir. ¤ Molekül a ğ ırlı ğ ı 900.000 daltondur. 45

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Polimeraz III kompleks yapıdadır ¤ α alt birim ε ve θ alt birimleriyle birlikte holoenzimin çekirdek enzim kısmını olu ş turur. ¤ Bu kısmın görevi polinükleotid zincirini uzatmak ve olu ş an nükleotid hatalarını okumaktır. 46

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Polimeraz III kompleks yapıdadır ¤ Be ş alt birimin olu ş turdu ğ u ( γ , δ , δ ’, χ , ψ ) 2. grup olan γ kompleksi, replikasyon çatalında enzimin kalıba oturtulmasında rol alır. ¤ Bu enzimatik i ş lev için ATP gereklidir. 47

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Polimeraz III kompleks yapıdadır 48

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Polimeraz III kompleks yapıdadır ¤ β alt birimi ‘kıskaç’ i ş ini görür ve polimerizasyon sırasında çekirdek enzimin kalıptan kopmamasını sa ğ lar. ¤ τ alt birimi, iki çekirdek polimerazın dimerize olmasını sa ğ lar. ¤ Ayrıca replikasyon çatalında sarmalın her iki zincirinin e ş zamanlı sentezini kolayla ş tırır. 49

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA replikasyonu sırasında karma ş ık olayların çözülmesi gerekir ¤ Sarmalın yer yer açılması ve her iki zincirde sentezin devam etmesi için bu ‘açık’ konfigürasyonunun dayanıklı olmasını sa ğ layan bir mekanizma bulunmalıdır. ¤ Sarmalın açılması ve sonrasında DNA sentezi ilerlerken, zincirin daha a ş a ğ ı kısımlarında sarmalın sıkı ş ması sonucunda ortaya çıkan gerilim dü ş ürülmelidir. 50

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA replikasyonu sırasında karma ş ık olayların çözülmesi gerekir ¤ DNA polimeraz III’ün polimerizasyonu yönlendirebilmesi için bir çe ş it primer sentezlenmelidir. ¤ Bu primer RNA’dır. ¤ RNA primeri sentezlendikten sonra DNA polimerez III, atasal molekülün her iki zincirinin tamamlayıcısı olan DNA zincirini sentezlemeye ba ş lar. 51

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA replikasyonu sırasında karma ş ık olayların çözülmesi gerekir ¤ Replikasyonun tamamlanmasından önce RNA primerlerinin uzakla ş tırılması gereklidir. ¤ Olu ş an geçici bo ş lukların bulundu ğ u yerler, kalıp DNA e ş leni ğ i ile doldurulmalıdır. ¤ Bo ş lukları doldurmak için sentezlenen DNA, biti ş i ğ indeki DNA zinciri ile birle ş tirilmelidir. 52

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA replikasyonu sırasında karma ş ık olayların çözülmesi gerekir ¤ Kopyalama sırasında DNA polimerazlar e ş lenik bazları do ğ ru biçimde takmaktadır, ancak hata olasılı ğ ı da vardır. ¤ Bazen sentezlenen zincire yanlı ş bazlar ilave edilebilir. ¤ Sentez i ş leminin bir parçası olan bir hata okuma mekanizması (proof reading) DNA sentezi sırasında olu ş an hataları düzeltir. 53

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA sarmalı açılmalıdır ¤ Ço ğ u bakteri ve virüslerin halkasal kromozomlarında, DNA sentezinin ba ş ladı ğ ı orijin noktası bulunur. ¤ Ço ğ unlukla E. coli’ de çalı ş ılan bu bölge oriC olarak adlandırılır. ¤ 9 ve 13 bazdan olu ş ur (9mer ve 13mer olarak adlandırılır) ve tekrar dizilerinin bulundu ğ u 245 baz çifti içerir. 54

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA sarmalı açılmalıdır ¤ DnaA denen özgül bir protein ilk basamakta sarmalın açılmasından sorumludur. ¤ DnaA proteinlerinin bazı alt birimleri bir çok 9mer dizisine ba ğ lanır. ¤ Bu ba ğ lanma, sarmalın daha fazla açılmasında ve kararlılı ğ ında rol alan DnaB ve DnaC proteinlerinin ba ğ lanmasını kolayla ş tırır. 55

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA sarmalı açılmalıdır ¤ Hidrojen ba ğ larını kırıp ikili sarmal yapıyı denatüre etmek için ATP hidrolizi ile sa ğ lanan enerjiye gereksinim duyan DnaB ve DnaC gibi proteinler helikazlar olarak adlandırılır. ¤ Tek zincire ba ğ lanan proteinler (single-stranded binding proteins,SSBP) olarak bilinen di ğ er bazı proteinler bu konformasyonu daha da kararlı kılar. 56

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA sarmalı açılmalıdır ¤ Sarmalın açılması devam ettikçe, replikasyon çatalının önünde olu ş an sarılma gerilimi, üstün kıvrılma (supercoiling) meydana getirir. ¤ Halkasal moleküllerde üstün kıvrılmalar, DNA’daki ek bükülmeler ve dönü ş ler sonucu olu ş turulur. 57

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA sarmalı açılmalıdır ¤ DNA topoizomerazlar olarak adlandırılan geni ş enzim ailesinin üyesi olan DNA giraz (DNA girase), bu tip üstün kıvrımları gev ş etir. ¤ Giraz enzimi zincirlerde kırılmalar olu ş turur ve aynı zamanda üstün kıvrılma olu ş umu sırasında meydana gelen bükülmeleri ve dü ğ ümleri açma hareketini katalizler. 58

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA sarmalı açılmalıdır ¤ Olu ş an kırıklar daha sonra tekrar birle ş tirilir. ¤ Bu reaksiyonda ATP hidrolizinden çıkan enerji kullanılır. 59

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA sentezi için RNA primeri gereklidir ¤ DNA polimeraz III’ün polinükleotid zincirini uzatması için, serbest 3’-OH grubu olan bir primer gereklidir. ¤ Günümüzde bu primerin RNA oldu ğ u açıkça bilinmektedir. 60

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA sentezi için RNA primeri gereklidir ¤ Öncelikle kalıp DNA üzerinden DNA’ya e ş lenik olan kısa bir RNA parçası sentezlenir. ¤ RNA sentezi, primaz olarak adlandırılan RNA polimerazın bir çe ş idi tarafından katalizlenir. ¤ Primazın sentezi ba ş latması için serbest 3’ ucu gerekmemektedir. ¤ DNA polimeraz III, bu kısa RNA parçasına 5’- deoksiribonükleotidleri takmaya ba ş layarak DNA sentezini ba ş latır. 61

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA sentezi için RNA primeri gereklidir ¤ Sonraki a ş amada, RNA primeri uzakla ş tırılmalı ve yerini DNA’ya bırakmalıdır. ¤ Bu reaksiyonun DNA polimeraz I tarafından katalizlendi ğ i dü ş ünülmü ş tür. ¤ RNA primerinin olu ş umu, virüsler, bakteriler ve çe ş itli ökaryotik organizmalarda tanımlanan evrensel bir i ş lemdir. 62

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Antiparalel zincirlerde DNA sentezi ¤ Sarmalın iki zinciri birbirine göre antiparaleldir (biri 5’-3’ yönündeyken di ğ erinin 3’-5’ yönünde). ¤ DNA polimeraz III, DNA sentezini sadece 5’-3’ yönünde gerçekle ş tirebilir. 63

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Antiparalel zincirlerde DNA sentezi ¤ Sentez, replikasyon çatalı boyunca zincirin birinde bir yönde, di ğ erinde zıt yönde ve aynı anda gerçekle ş ir. ¤ Sonuç olarak çatal boyunca sadece bir zincir sürekli DNA sentezi için kalıp olarak kullanılır. 64

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Kesintisiz ve kesintili DNA zincirleri ¤ DNA sentezi sonucu olu ş an yeni zincire kesintisiz zincir (leading strand) denir. ¤ Di ğ er zincirde ise DNA sentezi ilerledikçe bir çok ba ş langıç noktası gereklidir. 65

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Kesintisiz ve kesintili DNA zincirleri ¤ Sonuç olarak bu zincirde kesintili DNA sentezi yapılır. ¤ DNA sentezi, zincirin birinde kesintili, di ğ erinde kesintisiz meydana geldi ğ i için bu i ş lemin tümü için yarı kesintili sentez (semi discontinuous synthesis) terimi kullanılır. 66

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Kesintili-kesintisiz zincir ve Okazaki fragmentleri ¤ DNA zincirleri birbirine antiparalel oldu ğ u için ve DNA polimeraz III sadece tek yönde sentez gerçekle ş tirdi ğ i için, ¤ Kesintili zincirde sentez sürekli de ğ ildir ve okazaki fragmentleri ortaya çıkar. 67

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Kesintili-kesintisiz zincir ve Okazaki fragmentleri ¤ Kesintisiz zincirde sentez süreklilik gösterir. ¤ Her iki zincirde de sentezi ba ş latmak için RNA primeri kullanılır. 68

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Kesintili DNA sentezini destekleyen kanıtlar ¤ Bu kanıtlar ilk olarak Reiji ve Tuneka Okazaki tarafından elde edilmi ş tir. ¤ Bu ara ş tırmacılar, E. coli ’de bakteriyofaj DNA’sının replikasyonu sırasında sentezlenen DNA’nın bir kısmının küçük parçalar halinde oldu ğ unu göstermi ş tir. 69

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Okazaki fragmentleri ¤ RNA primeri, DNA’nın bir bölümünü olu ş turan küçük parçaların bir kısmını olu ş turmaktadır. ¤ Okazaki parçaları olarak adlandırılan bu parçacıklar sentez devam ettikçe moleküler a ğ ırlıklarını arttırarak daha uzun DNA zincirlerine dönü ş ür. 70

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA ligaz ve DNA polimeraz I ¤ DNA polimeraz I, primerin uzakla ş tırılması ve eksik nükleotidlerin yerine konulmasından sorumludur. ¤ Fragmanların birle ş tirilmesi i ş ini DNA ligaz yapar. ¤ DNA ligaz kesintili sentezlenen zincirler arasındaki bo ş lu ğ u kapatır. 71

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Birkaç soru !!! ¤ Okazaki modelinde, DNA polimeraz III, DNA sentezini kesintili ve kesintisiz zincirlerde nasıl e ş zamanlı olarak gerçekle ş tirir? ¤ Bu iki zincir aynı replikasyon çatalında aynı anda mı kopyalanır yoksa bu i ş lemler enzimin kopyasını içeren iki ayrı olay mıdır? 72

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Sentez kesintili ve kesintisiz zincirlerde aynı anda yapılır ¤ Nükleotid polimerizasyonu, enzimin dimerik bir formu tarafından her iki zincirde birden gerçekle ş tirilir. ¤ Elde edilen veriler her iki zincirin aynı anda kopyalandı ğ ına i ş aret etmektedir. 73

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Sentez kesintili ve kesintisiz zincirlerde aynı anda yapılır ¤ Sentezin fiziksel yönünü de ğ i ş tirmek için kesintili zincir ilmek olu ş turur. ¤ Ancak sentezin biyokimyasal yönü de ğ i ş mez (5’-3’). ¤ Enzim dimer olarak i ş lev görür ve dimerin enzimlerinden her biri zincirlerden birinin ya da di ğ erinin üzerinden sentezi gerçekle ş ir. 74

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Hata okuma (proof reading) ve düzeltme ¤ DNA replikasyonda, her nükleotidi tamamen kalıp zincirin e ş leni ğ i olan yeni bir zincir sentezlenir. ¤ DNA polimeraz, sentezi çok do ğ ru yaptı ğ ı halde kusursuz de ğ ildir. ¤ E ş lenik olmayan bir nükleotid zincire girebilir. 75

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Hata okuma (proof reading) ve düzeltme ¤ E ş lenik olmayan nükleotid zincire girdi ğ i zaman bu tip hataların giderilmesi için belirli aktiviteler gözlenir. ¤ DNA polimerazların hepsi 3’-5’ ekzonükleaz aktivitesi gösterir. ¤ Bu özellik DNA polimerazlarla yanlı ş e ş le ş en nükleotidleri saptama ve yapıdan çıkarma potansiyeli sa ğ lar. 76

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Hata okuma (proof reading) ve düzeltme ¤ Yanlı ş e ş le ş mi ş nükleotid çıkarıldıktan sonra sentez 5’-3’ yönünde yeniden devam eder. ¤ Hata okuma denen bu i ş lev, sentezin do ğ rulu ğ unu 100 kez arttırır. ¤ DNA polimeraz III’ün ε (epsilon) alt birimi hata onarım basama ğ ına do ğ rudan katılır. 77

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA replikasyonu uygun bir modelle açıklanır ¤ Replikasyon çatalında gerçekle ş en DNA kopyalanmasını uygun bir model üzerinde inceleyebiliriz. ¤ İ lerleyen çatalda, helikaz enzimi ikili sarmalı açar. ¤ Sarmal açılınca, tekrar sarmal olu ş masını engellemek için açılan zincirlere tek zincirlere özgü proteinler ba ğ lanır. 78

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA replikasyonu uygun bir modelle açıklanır 79

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) DNA replikasyonu uygun bir modelle açıklanır ¤ İ lerleyen replikasyon çatalında DNA giraz, kıvrımların yarattı ğ ı gerilimi azaltma görevi görür. ¤ Polimeraz dimerini olu ş turan her bir çekirdek enzim, kalıp zincirlerden birine kaygan kıskaç yardımıyla ba ğ lanır. ¤ Sentezin her iki zincirde de aynı anda gerçekle ş mesi için kesintili zincir ilmek olu ş turmaktadır. 80

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Replikasyonu kontrol eden genler ¤ Virüs ve bakteride DNA kopyalanması hakkındaki bilgilerimizin ço ğ u bu i ş lemlerin genetik analizlerine dayanır. ¤ Genetik analizlerde genellikle bir ko ş ulda kendini gösteren ancak ba ş ka bir ko ş ulda gözlenmeyen ko ş ullu mutasyonlar kullanılır. ¤ Örne ğ in sıcaklı ğ a-hassas mutasyon, belirli bir sıcaklık ko ş ulunda etkisini göstermez. 81

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Gen ürünlerinin görevleri ¤ Gen ürünleri; ¤ Replikasyon orijinlerinin belirlenmesi ¤ Sarmalın açılması ¤ Sarmalın dayanıklılı ğ ı ¤ Sentezin ba ş laması ¤ Primer olu ş umu ¤ Üstün kıvrılmanın gev ş emesi ¤ Hata onarımı ve serbest uçların birle ş tirilmesi olaylarına katılır. 82

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Ökaryotik DNA sentezi prokaryotik DNA sentezine benzerdir ¤ Ara ş tırmalara göre ökaryotik DNA sentezi bir bakıma bakterilerdekine benzemektedir. ¤ Her iki sistemde de DNA, replikasyon orijinlerinden açılarak, replikasyon çatalı olu ş ur. ¤ DNA polimerazın yönetiminde, kalıplardan çift yönlü DNA sentezi kesintisiz ve kesintili zincirleri olu ş turur. 83

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Ökaryotik DNA sentezi prokaryotik DNA sentezine benzerdir ¤ Ökaryotik polimerazların da bakteriyel sistemde oldu ğ u gibi temel gereksinimleri vardır. ¤ İ ki sentezde de; ¤ Dört tip deoksiribonükleosit trifosfat ¤ Kalıp DNA ¤ Primer gereklidir. 84

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Ökaryotik DNA sentezi ile prokaryotik DNA sentezi arasındaki ‘farklar’ ¤ Ökaryotik hücrelerde hücre ba ş ına dü ş en DNA miktarı fazla oldu ğ undan ökaryotik kromozomlar, halkasal yerine do ğ rusaldır. ¤ Ökaryotik hücreler, bakterilerin kar ş ıla ş madı ğ ı bazı sorunlarla yüz yüze gelir çünkü kompleks canlılardır. 85

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Çoklu replikasyon orijini ¤ Prokaryotik ve ökaryotik DNA replikasyonu arasındaki en belirgin fark çoklu replikasyon orijinidir. ¤ E. coli kromozomunda bir replikasyon orijini bulunurken, ökaryotik kromozomda bir çok replikasyon orijini bulunur. 86

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Çoklu replikasyon orijini ¤ Elektron mikroskobunda sarmal açıldıkça ‘replikasyon baloncukları’ olarak görüntülenen çoklu orijinlerin her biri birer potansiyel replikasyon çatalı sa ğ lar. 87

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Çoklu replikasyonda ilk bulgular ¤ Birden fazla orijinin ve bu orijinlerden DNA sentezinin ba ş lamasının moleküler mekanizmasına açıklık getiren bir çok kavram artık ortaya çıkarılmı ş tır. ¤ İ lk bulguların ço ğ u 250-400 replikonu bulunan mayalardan elde edilmi ş tir. ¤ Mayadan elde edilen replikasyon orijinlerine, ‘özerk replike olan diziler’(Autonomously Replicating Sequences, ARS) denir. 88

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Orijin tanıma kompleksi (ORC) ¤ Polimerazın, kompleks DNA arasında ARS dizilerini nasıl buldu ğ u açıkça bir moleküler tanıma sorunudur. ¤ Çözüm, S fazından önce ba ş layan bir mekanizmadır. ¤ Hücre döngüsünün G 1 fazı sırasında bütün ARS dizilerine bazı özgül protein grupları ba ğ lanır ve orjin tanıma kompleksi (Origin Recognition Complex, ORC) meydana gelir. 89

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Ökaryotik DNA polimerazlar ¤ Ökaryotik replikasyonların en karma ş ık yönü DNA sentezini yönlendiren bir dizi polimeraz içermesidir. ¤ Safla ş tırılan enzim formlarının yalnızca dört tanesi DNA’nın replikasyonunda yer alır, geri kalanlar tamir i ş lemleriyle ilgilidir. 90

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Polimerazın DNA’ya ba ğ lanması ¤ Polimerazın DNA ba ğ lanabilmesi için; ¤ İ lk olarak sarmalın topolojisinin de ğ i ş mesi gerekir. ¤ Orijin bölgesinde sentezin ba ş laması tetiklenince ikili sarmal AT-zengin bir bölgeden açılarak helikaz enziminin giri ş i sa ğ lanır. ¤ Helikaz DNA sarmalını daha da açarak ilerler. 91

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Polimerazın sentezi ba ş latmasından önce gerekenler ¤ DNA ile kompleks yapmı ş olan histon proteinlerinin uzakla ş tırılması gereklidir. ¤ DNA sentezi ilerledikçe histonlar her sentezlenen dubleksle tekrar bir araya gelerek nükleozom yapısını olu ş turur. 92

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Ökaryotik DNA polimerazın özellikleri ¤ Ökaryotik DNA polimerazların üçü yani pol α , ¡ δ ¡ ve ε ¡ (alfa,delta ve epsilon) ökaryotik hücrelerde çekirdek DNA’sının replikasyonu için gereklidir. ¤ Di ğ er ikisinin (pol ß ve ζ ) DNA tamirinde görev aldı ğ ı dü ş ünülmektedir. ¤ Altıncı ise pol γ , mitokondri DNA’sının sentezinde yer alır. 93

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Do ğ rusal kromozomların uçlarının replikasyonu sorunludur ¤ Prokaryotik ve ökaryotik DNA sentezi arasındaki son fark kromozomların yapısı ile ilgilidir. ¤ Bakteri ve fajların ço ğ unda bulunan kapalı halkasal kromozomların tersine, ökaryotlardaki kromozomlar do ğ rusaldır (linear). 94

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Do ğ rusal kromozomların uçlarının replikasyonu sorunludur ¤ Replikasyon esnasında, telomerler olarak adlandırılan do ğ rusal kromozom uçlarında özel bir sorunla kar ş ıla ş ılır. ¤ Bu probleme yönelmeden önce telomerler hakkında bilgi verece ğ iz. 95

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Telomerler ¤ Telomerler, telomer-ili ş kili özel proteinlerin ba ğ landı ğ ı kısa tekrar dizileri içeren uzun DNA dizilerinden olu ş ur. ¤ Telomerlerin e ş siz nitelikleri kromozomların bütünlü ğ ünün ve dayanıklılı ğ ının korunmasını sa ğ lar. ¤ Telomerlerin ökaryotik kromozom uçlarını parçalanmadan korudu ğ u dü ş ünülmektedir. 96

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Do ğ rusal kromozomların uçlarının replikasyonu sorunludur ¤ Ş imdi ikili sarmal bir DNA molekülünün, ucuna yakın bir yarı- saklı replikasyonu dü ş ünelim. ¤ Kesintisiz zincirdeki sentez normal olarak kromozom ucuna kadar devam ederken, kesintili zincirdeki RNA primeri uzakla ş tırıldı ğ ı zaman sorun ortaya çıkar. 97

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Do ğ rusal kromozomların uçlarının replikasyonu sorunludur ¤ Normal olarak kesintili sentez sırasında olu ş an 3’-OH grubuna nükleotid ilavesi yapılarak yeni olu ş an bo ş luklar doldurulmalıdır. ¤ Ancak burası DNA molekülünün ucu oldu ğ u için 3’-OH grubunu sa ğ layacak kalıp zincir yoktur. 98

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Do ğ rusal kromozomların uçlarının replikasyonu sorunludur ¤ Dolayısıyla teorik olarak, her sentezin sonunda kromozom RNA primerinin boyu kadar kısalacaktır. ¤ Bu durum potansiyel bir problemdir. ¤ Bu nedenle moleküler bir çözümün geli ş tirildi ğ ini ve hemen hemen bütün ökaryotlarda bu mekanizmanın korundu ğ u bilinmektedir. 99

(Kaynak: Genetik Kavramlar, Klug, Prof. Dr. Bekta ş TEPE Cummings & Reece) Telomeraz enziminin aktivitesi ¤ Bu enzim, ilk olarak silli bir protozoa olan Tetrahymena’ da ke ş fedilip, telomeraz olarak adlandırılmı ş tır. ¤ Ökaryotlarda telomerik DNA’da birçok kısa tekrar nükleotid dizileri bulunur. ¤ Örne ğ in; Tetrahymena kromozomunun ucunda kesikli zinciri olu ş turan kalıp DNA’da 5’- TTGGGG-3’ dizisi bir çok kez tekrarlanır. 100