B. hercules The Terminator of Colon Cancer Background & Motive - - PowerPoint PPT Presentation

2012 HKUST iGEM Team

The Terminator of Colon Cancer

• B. hercules

Background & Motive

Cancer Therapy & Synthetic Biology

Background & Motive

Our ¡project ¡ ¡Cancer ¡

Represent ¡>90% ¡of ¡colon ¡cancer ¡cases ¡ Accessible ¡to ¡agents ¡in ¡gut ¡

Colon Carcinomas – A Suitable Target

Background & Motive

• Non-­‑pathogenic. ¡
• Well-­‑understood. ¡
• Provide ¡engineering ¡op7ons. ¡

Our Chassis

Background & Motive

• Gut ¡microbiome ¡
• Lacks ¡virulence ¡
• Integrates ¡DNA ¡

Gene ¡integra7on ¡

• B. hercules

Background & Motive

¡ Target: ¡colon ¡carcinomas ¡ ¡ ¡ Tool: ¡B. ¡sub'lis ¡

• Target ¡Binding ¡
• An>-­‑tumor ¡Molecule ¡Secre>on ¡
• Regula>on ¡& ¡Control ¡

Background & Motive

Three Modules

Module 1

Target Binding

Colon ¡Cancer ¡Cell ¡

Module 1

RPMrel ¡

Tumor Recognition

Isola7on ¡of ¡a ¡colon ¡tumor ¡specific ¡binding ¡pep7de ¡using ¡phage ¡display ¡selec7on. ¡Kelly ¡& ¡Jones, ¡2003. ¡ ¡ ¡

Bacillus ¡ sub'lis ¡

Module 1

RPMrel ¡

Tumor Recognition

Colon ¡Cancer ¡Cell ¡

LytC ¡ Helical ¡Linker ¡

Module 1

Cell Wall Display

lytC ¡ linker ¡ RPMrel ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡

Double ¡ ¡ Terminator ¡ RBS ¡

¡

¡ ¡ ¡

¡ ¡ ¡

Pveg ¡ Module 1

Construct

Module 2

Anti-tumor Molecule Secretion

Secrete ¡BMP2 ¡ BMP2 ¡

Module 2

Anti-tumor Drug

Bone ¡morphogene7c ¡protein ¡signaling ¡and ¡growth ¡suppression ¡in ¡colon ¡cancer. ¡Beck ¡at ¡al, ¡2006. ¡

BMP2 ¡ Signal ¡ pep>de ¡

Module 2

Out ¡ In ¡ Membrane ¡

Secretion

Module 2

Cleavage ¡ Signal ¡ pep>de ¡ BMP2 ¡

Secretion

SPPase ¡ BMP2 ¡ Folding ¡

Module 2

Secretion

RBS ¡ xylR ¡ Bmp2 ¡ Signal ¡ ¡ pep>de ¡ ¡

¡ ¡

PxylA ¡ Module 2

Construct

0 ¡ 10 ¡ 20 ¡ 30 ¡ 40 ¡ 50 ¡ 60 ¡ 70 ¡ 80 ¡ 90 ¡ 100 ¡ 0.0001 ¡ 0.001 ¡ 0.01 ¡ 0.1 ¡

Percentage ¡of ¡Viable ¡Cells ¡

• B. ¡sub'lis ¡Concentra>on ¡(OD650) ¡

Viability ¡of ¡HT-­‑29 ¡Cells ¡Following ¡Co-­‑Culture ¡with ¡B. ¡sub'lis ¡

• B. ¡sub7lis ¡transformed ¡with ¡empty ¡vector ¡
• B. ¡sub7lis ¡transformed ¡to ¡express ¡BMP2 ¡
• B. ¡sub'lis ¡
• B. ¡sub'lis ¡

Module 2 Module 2

BMP2 Functional Assay

Regulation & Control

Module 3

Two ¡Regula>on ¡Systems ¡

• 1. ¡Time ¡Control ¡
• 2. ¡Dosage ¡Regula>on ¡

Module 3

Regulation Systems

RBS ¡ xylR ¡

¡ ¡

PxylA ¡

Module 3

Xylose-Inducible Promoter

A ¡xylose-­‑inducible ¡Bacillus ¡sub'lis ¡integra7on ¡vector ¡and ¡its ¡applica7on. ¡Kim ¡et ¡al, ¡1996. ¡ ¡ ¡

RBS ¡ xylR ¡ Bmp2 ¡ Signal ¡ ¡ pep>de ¡ ¡

¡ ¡

PxylA ¡ XylR ¡ Inhibited ¡Transcrip>on ¡ Module 3

Xylose-Inducible Promoter

RBS ¡ xylR ¡ Bmp2 ¡ Signal ¡ ¡ pep>de ¡ ¡

¡ ¡

PxylA ¡ XylR ¡ Transcrip>on ¡Proceeds ¡ Module 3 xylose ¡

Xylose-Inducible Promoter

B m p 2 ¡ S i g n a l ¡ ¡ p e p > d e ¡ y d c E ¡

R B S ¡

An>toxin ¡ Toxin ¡ EndoA ¡ EndoAI ¡

Module 3

Growth Inhibition Device

The ¡Bacillus ¡sub'lis ¡ydcDE ¡operon ¡encodes ¡an ¡endoribonuclease ¡of ¡the ¡MazFPemK ¡family ¡and ¡its ¡inhibitor. ¡Pelligrini ¡et ¡al, ¡2005 ¡

Bacillus ¡ ¡ sub'lis ¡ G r

• w

t h ¡ I n h i b i >

• n

¡

E n d

• A

¡ ( T

• x

i n ) ¡ EndoAI ¡ ¡ (An>toxin) ¡

Module 3

Growth Inhibition Device

OD ¡(Average ¡OD595) ¡ ¡

Module 3

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡

RBS ¡

Promoter ¡Ac>vity ¡= ¡ ¡ ¡ Ptms ¡ GFP ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡

RBS ¡

Double ¡ terminator ¡

¡ ¡ J23101 ¡ GFP ¡ GFP ¡Synthesis ¡Rate ¡(Slope) ¡ Promoter ¡Ac>vity ¡ ¡

• f ¡Ptms ¡

Promoter ¡Ac>vity ¡ ¡

• f ¡Standard ¡Promoter ¡

Rela>ve ¡Promoter ¡Unit ¡(RPU) ¡of ¡Ptms ¡ to ¡reference ¡standard ¡promoter ¡ =

Double ¡ terminator ¡

Ptms Characterization

y ¡= ¡3.4x ¡+ ¡3.8 ¡ y ¡= ¡35.45x ¡+ ¡225.7 ¡ 0 ¡ 50 ¡ 100 ¡ 150 ¡ 200 ¡ 250 ¡ 300 ¡ 350 ¡ 400 ¡ 450 ¡ 0 ¡ 15 ¡ 30 ¡ 45 ¡ 60 ¡

GFP ¡Intensity ¡(Arbitrary ¡Units) ¡ Time ¡(minutes) ¡

Ptms ¡& ¡J23101 ¡GFP ¡Intensity ¡

Ptms ¡ J23101 ¡

Module 3

Ptms ¡

Ptms has Low Activity

RPU: ¡0.046 ¡

0 ¡ 50 ¡ 100 ¡ 150 ¡ 200 ¡ 250 ¡ 300 ¡ 350 ¡ 0% ¡ 1% ¡ 2% ¡ 3% ¡ 4% ¡ 5% ¡ 10% ¡

GFP ¡Synthesis ¡Rate/Average ¡OD595 ¡ Xylose ¡Concentra>on ¡

PxylA ¡Promoter ¡Ac>vity ¡Induced ¡With ¡0-­‑10% ¡Xylose ¡

Module 3

PxylA is Inducible

Control ¡Group ¡ Experiment ¡Group ¡

Xylose ¡concentra'on ¡from ¡le6 ¡to ¡right ¡(both ¡groups): ¡0.00%, ¡0.05%, ¡0.10%, ¡0.15%, ¡0.20%, ¡0.25% ¡

Module 3

Growth Inhibition Characterization

Assembly

Assembly

Three Modules

• Target ¡Binding ¡
• An>-­‑tumor ¡Molecule ¡Secre>on ¡
• Regula>on ¡& ¡Control ¡

Assembly

Modules Assembled

Bacterial ¡ Chromosome ¡

amyE ¡3’ ¡ amyE ¡5’ ¡ RPMrel ¡ Expression ¡ xylR ¡ ¡ ¡ PxylA ¡ BMP2 ¡ Secre>on ¡ Toxin ¡ An>-­‑ toxin ¡ RPMrel ¡ LytC ¡ EndoA ¡ EndoAI ¡ ¡ ¡ P t m s ¡ ¡ ¡ ¡ ¡

Achievements & Future Work

• PxylA, ¡Ptms ¡func>on ¡as ¡expected. ¡
• Cell ¡growth ¡inhibi>on ¡device ¡func>ons. ¡

¡

• RPMrel ¡produc>on ¡– ¡work ¡in ¡progress. ¡
• BMP2 ¡produc>on ¡– ¡work ¡in ¡progress. ¡

Achievements & Future Work

Our Work

• ANIMATION? ¡

Human Practice

Presenta>on ¡at ¡Hong ¡ Kong ¡Cancer ¡Fund

Human Practice – Presentation

Presentation

Human Practice – Presentation

Objective & Role

Human Practice – Presentation

Presentation

Human Practice – Presentation

Positive Feedback

Synthe'c ¡biology ¡can ¡be ¡used ¡to ¡improve ¡cancer ¡treatment. ¡

¡-­‑-­‑-­‑ ¡Respondent ¡A

Synthe'c ¡biology ¡will ¡give ¡cancer ¡pa'ents ¡hope. ¡

• ­‑-­‑-­‑ ¡Respondent ¡B

This ¡presenta'on ¡is ¡clear ¡and ¡professional. ¡

• ­‑-­‑-­‑ ¡Respondent ¡C

Some ¡of ¡the ¡seeds ¡have ¡[been] ¡planted ¡which ¡will ¡allow ¡us ¡to ¡keep ¡a ¡ close ¡eye ¡to ¡its ¡(synthe'c ¡biology’s) ¡development. ¡

• ­‑-­‑-­‑ ¡Ms. ¡HSUEH, ¡the ¡Head ¡of ¡Wellness ¡and ¡Holis7c ¡Health ¡Care

Human Practice – Interviews

Interviews

POLITICIAN ¡ JOURNALIST UNIVERSITY ¡STUDENT HIGH ¡SCHOOL ¡STUDENT

Human Practice – Interviews

Interviews

Human Practice – Interviews

Interviews

…I ¡will ¡listen ¡to ¡their ¡complaints ¡sincerely ¡as ¡a ¡ responsible ¡listener… ¡ ¡ …I ¡will ¡tell ¡them ¡how ¡to ¡raise ¡this ¡issue ¡to ¡higher ¡ authori'es… ¡ ¡ …But ¡the ¡final ¡decision ¡should ¡be ¡made ¡only ¡by ¡the ¡ majority… ¡ ¡ ¡ ¡-­‑-­‑-­‑ ¡The ¡poli7cian, ¡Mr. ¡SHUM ¡

Human Practice – Interviews

Interviews

• Gather ¡informa7on ¡about ¡

the ¡interviewees. ¡ ¡

• Generate ¡an ¡interview ¡
• utline ¡and ¡ques7ons ¡

specifically ¡targeted ¡at ¡the ¡

• interviewee. ¡
• Guide ¡your ¡interviewers ¡

and ¡train ¡them ¡to ¡be ¡good ¡

• interviewers. ¡

Human Practice

Human ¡Prac>ce ¡

Presenta>on ¡ Interviews ¡

Recap

Cell ¡growth ¡ inhibi7on ¡ Toxin-­‑ an7toxin ¡ casseee ¡ Colon ¡tumor ¡ growth ¡ suppression ¡ Chemokine ¡ expression ¡ Tumor ¡ targe7ng ¡ Pep7de ¡ display ¡

• B. ¡sub'lis ¡

Recap

Integrated ¡ Genes ¡

• Office ¡of ¡the ¡Dean ¡of ¡Science ¡
• Office ¡of ¡the ¡Provost ¡

– The ¡Hong ¡Kong ¡University ¡of ¡Science ¡& ¡Technology ¡

Acknowledgements

2012 HKUST iGEM Team

The Terminator of Colon Cancer

• B. hercules