Activation-inactivation intercellular signaling in one- and - - PowerPoint PPT Presentation

Activation-inactivation intercellular signaling in one- and two-dimensions

Faisal Naqib and Horia Vulpe representing the McGill 2009 iGEM Team.

• Description of signaling network
• Mathematical modeling
• Engineered biological signaling

network

• Wetlab experiments

Why explore signaling?

Using synthetic biology to learn about natural biology. Many applications depend on cell signaling. Microbiological based sensors are a form of cell signaling.

Signaling Network

Two diffusible proteins: one activating and one inhibiting. Separation distance was primary interest. Three types of dynamics possible:

• Steady state
• Oscillations
• No interaction

Signaling Network

Mathematical Modeling

Model Equations

Par$al ¡differen$al ¡equa$on ¡(PDE) ¡based ¡model, ¡which ¡was ¡an ¡ expansion ¡of ¡a ¡model ¡ini$ally ¡presented ¡by ¡Shymko ¡and ¡Glass ¡ (1974).

Ψ1 ¡and ¡Ψ2 ¡represent ¡the ¡concentra$ons ¡of ¡the ¡ ac$va$ng ¡and ¡inhibi$ng ¡molecules, ¡ respec$vely, ¡γi ¡the ¡degrada$on ¡constant, ¡Di ¡ the ¡diffusion ¡constant, ¡λi ¡the ¡maximal ¡synthesis ¡ rate ¡of ¡molecule ¡i, ¡and ¡δ ¡the ¡Dirac ¡func$on. ¡fi ¡ represents ¡the ¡Hill ¡func$on ¡describing ¡the ¡ dependence ¡on ¡the ¡opposing ¡molecule. ¡where ¡ n, ¡b, ¡and ¡θ ¡are ¡posi$ve. ¡

Equa$ons ¡solved ¡numerically ¡using ¡a ¡forward ¡Euler ¡scheme ¡in ¡ $me ¡and ¡a ¡centered ¡difference ¡scheme ¡in ¡space. ¡Cyclical ¡ boundary ¡condi$ons ¡were ¡assumed; ¡meaning ¡the ¡spa$al ¡ dimension ¡formed ¡a ¡ring.

1D Simulations

The ¡red ¡bar ¡represents ¡the ¡inhibi-­‑ ¡tory ¡site, ¡ which ¡remains ¡fixed ¡in ¡posi$on ¡while ¡the ¡ ac$va$ng ¡site, ¡blue ¡bar, ¡is ¡sequen$ally ¡moved ¡ around ¡the ¡ring.

• 1 frequency

corresponds to complex

• scillations that

frequency could not be easily computed.

Frequency vs. Separation Distance

The ¡leU ¡map ¡has ¡a ¡finite ¡number ¡of ¡points, ¡meaning ¡that ¡it ¡is ¡ periodic, ¡while ¡the ¡right ¡map ¡is ¡forming ¡a ¡closed ¡curve, ¡ indica$ve ¡of ¡quasiperiodicity.

Classifying Oscillations

The perfect reflection across the line y=x of the phase plane curve means the two

• scillations are always 180 degrees out of
• phase. This type of oscillations was

present for a wide range of separation distances.

• At close separation

distances oscillations in sync.

• Quasiperiodicity.
• Intermediate distances at

180 degrees out of sync.

• Large enough distances

results in possibly no interaction.

Phase Lag

Effect of other parameters

Oscilla$ons ¡appear ¡as ¡ degrada$on ¡constant ¡ is ¡increased ¡ Amplitude ¡of ¡

• scilla$ons ¡decreases ¡

as ¡diffusion ¡constant ¡

• increases. ¡

Degrada$on ¡constant ¡changing ¡in ¡$me. ¡ Diffusion ¡constant ¡changing ¡in ¡$me. ¡ 0.1 ¡ 3 ¡ 0.1 ¡ 3 ¡

2D Simulations

We also looked at the different dynamics resulting from different geometries in two dimensions. Here we have leaking boundary conditions and 5 lines of activating cells and 4 lines of inhibitory cells.

2D Simulations

We also looked at the different dynamics resulting from different geometries in two dimensions. Here we have leaking boundary conditions and 5 lines of activating cells and 4 lines of inhibitory cells.

2D Simulations

Cyclical boundary conditions with alternating lines of activating and inhibiting cells.

2D Simulations

Cyclical boundary conditions with alternating lines of activating and inhibiting cells.

2D Simulations

Cyclical boundary conditions with alternating lines of activating and inhibiting cells in both latitude and longitude.

2D Simulations

Cyclical boundary conditions with alternating lines of activating and inhibiting cells in both latitude and longitude.

System ¡Design ¡

• 1. Transcrip$on ¡factors ¡
• 2. Promoters ¡
• 3. Reporters ¡
• 4. The ¡system ¡

Outline ¡

Transcrip4on ¡Factors ¡

• 1. Freely ¡diffusible ¡across ¡the ¡membrane ¡
• 2. Turn ¡their ¡respec$ve ¡promoter ¡ON ¡and ¡

OFF ¡

• 3. Do ¡not ¡interact ¡with ¡each ¡other’s ¡

promoters ¡

Transcrip4on ¡Factors ¡

• 3OC6-­‑HSL

¡ ¡

• Acts ¡on ¡its ¡promoter ¡in ¡associa$on ¡with ¡LuxR ¡
• Is ¡produced ¡by ¡the ¡synthetase ¡LuxI ¡(LVA ¡tagged) ¡

LuxR ¡

+

(3OC6-­‑HSL) ¡

Lux ¡I ¡

Transcrip4on ¡Factors ¡

• C4-­‑HSL

¡ ¡

• Acts ¡on ¡its ¡promoter ¡in ¡associa$on ¡with ¡RhlR ¡
• Is ¡produced ¡by ¡the ¡synthetase ¡RhlI ¡(LVA ¡tagged) ¡

+

RhlR ¡ (C4-­‑HSL) ¡

Rhl ¡I ¡

Promoters ¡

• 1. Lux ¡pL ¡

¡ ¡ ¡ ¡“ON ¡promoter”. ¡Turned ¡OFF ¡by ¡LuxR/3OC6HSL.

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡

• 2. ¡ ¡RhlR ¡+ ¡C4 ¡

¡ ¡ ¡“OFF ¡promoter”. ¡Turned ¡ON ¡by ¡RhlR/C4-­‑HSL. ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡

LuxR ¡

+ +

RhlR ¡ (C4-­‑HSL) ¡ (3OC6-­‑HSL) ¡

(C4-­‑HSL) ¡ (3OC6-­‑HSL) ¡

Transcrip4on ¡Factors ¡

• 1. “Wild-­‑type ¡LuxR ¡exhibits ¡no ¡response ¡to ¡

butanoyl-­‑HSL ¡(C4HSL)” ¡

Source: ¡ ¡

• ­‑Directed ¡Evolu$on ¡of ¡Vibrio ¡fischeri ¡LuxR ¡for ¡Improved ¡Response ¡to ¡Butanoyl-­‑Homoserine ¡Lactone. ¡ ¡

Andrew ¡C. ¡Hawkins, ¡Frances ¡H. ¡Arnold, ¡Rainer ¡Stuermer,Bernhard ¡Hauer, ¡and ¡Jared ¡R. ¡Leadbejer1*, ¡ 2007, ¡APPLIED ¡AND ¡ENVIRONMENTAL ¡MICROBIOLOGY, ¡p. ¡5775–5781. ¡ ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ No ¡Cross-­‑talk ¡between ¡HSLs ¡ ¡

LuxR ¡ + (C4-­‑HSL) ¡

Transcrip4on ¡Factors ¡

• 2. ¡iGEM: ¡Part:BBa_F2620:Specificity ¡page ¡

¡ ¡Transfer ¡func$on ¡( ¡for ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡promoter) ¡ No ¡Cross-­‑talk ¡between ¡HSLs ¡ ¡

Reporters ¡

• 1. EYFP ¡– ¡AAV

¡ ¡ ¡ ¡2. ¡ECFP ¡-­‑ ¡AAV ¡

Emission ¡spectra ¡ Source: ¡Princeton ¡Instruments. ¡ ¡ hjp://www.princetoninstruments.com/Uploads/Princeton/Documents/Library/UpdatedLibrary/ Dual_labeling_using_green_fluorescent_proteins.pdf ¡

Constructs ¡

• 1. Construct ¡1 ¡“Inhibitor” ¡
• 2. Construct ¡2 ¡“Ac$vator” ¡

Cons$tu$ve ¡ ¡Bicistronic ¡construct. ¡ RhlI/EYFP ¡ ¡Transcribed ¡in ¡tandem ¡

• 1. Synthesis ¡of ¡constructs ¡
• 2. Experiments ¡
• 3. Future ¡direc$on ¡

Gene ¡Synthesis ¡and ¡Experiments ¡ ¡

Synthesis ¡

• 1. Carried ¡out ¡by ¡GenScript ¡
• 2. Unstable ¡repeats ¡in ¡the ¡terminator ¡

region ¡( ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡) ¡caused ¡delays ¡

• 3. pCC1 ¡plasmid ¡from ¡Epicentre ¡
• Copy-­‑number ¡inducible ¡
• 4. ¡ ¡EPI300 ¡E.Coli ¡strain ¡from ¡Epicentre ¡
• For ¡stability ¡
• 5. ¡ ¡Codon ¡op$miza$on ¡

Experiments ¡

• 1. Construct ¡2 ¡“Ac$vator” ¡

ON ¡ Fluorescence ¡ Protocol ¡

• 1. Overnight ¡cultures ¡grown ¡for ¡a ¡few ¡hours ¡to ¡O.D. ¡

0.4-­‑0.6 ¡at ¡single ¡copy ¡number ¡

• 2. pCC1 ¡Induced ¡to ¡high ¡copy ¡number ¡with ¡L-­‑

arabinose ¡for ¡3-­‑4 ¡hours ¡ ¡ Expected ¡

Experiments ¡

• 1. Construct ¡1 ¡“Inhibitor” ¡

OFF ¡ Fluorescence… ¡ Protocol ¡

• 1. Overnight ¡cultures ¡grown ¡for ¡a ¡few ¡hours ¡to ¡O.D. ¡

0.4-­‑0.6 ¡at ¡single ¡copy ¡number ¡

• 2. pCC1 ¡Induced ¡to ¡high ¡copy ¡number ¡with ¡L-­‑

arabinose ¡for ¡another ¡3-­‑4 ¡hours ¡ ¡ Unexpected ¡

Why ¡did ¡construct ¡2 ¡fluoresce? ¡

• 1. RhlR+C4 ¡promoter ¡leaky? ¡
• 2. Long ¡incuba$on ¡$mes, ¡accumulated ¡

ECFP? ¡

• 3. others? ¡

Future ¡experiments ¡

• 1. Determine ¡the ¡Transfer ¡Func$on ¡of ¡lux ¡

pL ¡and ¡RhlR+C4 ¡transfer ¡func$ons ¡

• exogenous ¡HSL ¡vs ¡fluorescence ¡

[HSL] ¡ fluorescence ¡

Future ¡experiments ¡

¡2. ¡Constructs ¡1 ¡and ¡2 ¡can ¡be ¡used ¡as ¡ receivers ¡for ¡HSLs ¡

• For ¡example, ¡to ¡determine ¡the ¡rate ¡of ¡

diffusion ¡of ¡HSLs ¡in ¡various ¡media ¡

A ¡drop ¡of ¡ HSL ¡ lawn ¡of ¡E. ¡Coli ¡ containing ¡ Constructs ¡1 ¡or ¡2 ¡

Future ¡experiments ¡

¡3. ¡Test ¡the ¡system ¡as ¡a ¡whole. ¡ ¡

Supervisors: ¡

• Dr. ¡Jay ¡Nadeau ¡
• Dr. ¡Leon ¡Glass ¡
• Dr. ¡Ed ¡Ruthazer ¡

Sponsors ¡

Thomas ¡Quail, ¡Louai ¡Musa, ¡Faisal ¡Naqib, ¡Horia ¡Vulpe ¡

Thank ¡You! ¡

Special ¡thanks ¡to: ¡ Naomi ¡Takeda ¡ Admin ¡assistant ¡