Outline Background Outreach, Conclusions, Future Work - PowerPoint PPT Presentation

Outline Background ¡ Outreach, ¡Conclusions, ¡ Future ¡Work ¡ Team ¡Goals ¡ Protein ¡PurificaBon ¡ Spider ¡silk-­‑GFP ¡ ¡fusion ¡protein ¡ Design ¡with ¡BioBricks ¡ The ¡First ¡Spider ¡ Silk ¡BioBricks ¡ 2 ¡

Orb-weaver spiders • Include ¡over ¡10,000 ¡species ¡ and ¡make ¡up ¡about ¡25% ¡of ¡ spider ¡diversity ¡ • Argiope ¡auran,a ¡ is ¡one ¡of ¡the ¡ major ¡orb ¡weavers ¡ • Common ¡to ¡North ¡and ¡Central ¡ America ¡ • Major ¡ampullate ¡dragline ¡silk ¡ is ¡one ¡of ¡the ¡six ¡solid ¡fibers ¡ produced ¡by ¡spider ¡silk ¡glands ¡ 3 ¡

Types of silk 4 ¡

Properties of spider silk Material ¡ Strength ¡(N ¡m -­‑2 ) ¡ ElongaBon ¡ Energy ¡to ¡ (%) ¡ break ¡(J ¡kg -­‑1 ) ¡ Dragline ¡silk ¡ 4000x10 6 ¡ 35 ¡ 40x10 4 ¡ Kevlar ¡ 4000x10 6 ¡ 5 ¡ 3x10 4 ¡ Rubber ¡ 1x10 6 ¡ 600 ¡ 8x10 4 ¡ • ¡As ¡strong ¡as ¡Kevlar, ¡7 ¡Nmes ¡more ¡elasNc ¡ • ¡5 ¡Nmes ¡larger ¡energy ¡to ¡break ¡than ¡rubber ¡ • ¡BiocompaNble ¡ ¡ • ¡Biodegradable ¡ • ¡Comparable ¡thermal ¡properNes ¡to ¡copper ¡ ¡ 5 ¡

Potential spider silk applications 6 ¡

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Motivation Problem: ¡ ¡ • Spiders ¡are ¡territorial ¡and ¡cannibalisNc ¡so ¡ producing ¡spider ¡silk ¡in ¡‘spider ¡farms’ ¡is ¡not ¡an ¡ opNon ¡ • Even ¡if ¡you ¡could ¡have ¡farms, ¡silk ¡collecNon ¡ would ¡be ¡difficult ¡ • The ¡mechanical ¡properNes ¡of ¡natural ¡silk ¡are ¡not ¡ ideal ¡for ¡all ¡applicaNons ¡ SoluNon: ¡Create ¡spider ¡silk ¡BioBricks ¡in ¡ E.coli ¡ 8 ¡

Our goals this year • Create ¡the ¡first ¡spider ¡silk ¡BioBrick ¡ • Create ¡a ¡method ¡of ¡purifying ¡spider ¡silk ¡that ¡is ¡ produced ¡in ¡ E.coli ¡ • Create ¡spider ¡silk-­‑GFP ¡fusion ¡proteins ¡for ¡easy ¡ detecNon ¡of ¡products ¡ • Manufacture ¡spider ¡silk ¡protein ¡in ¡ E.coli ¡ • Manufacture ¡spider ¡silk ¡fibers ¡from ¡protein ¡ ¡ • Use ¡tRNAs ¡to ¡opNmize ¡spider ¡silk ¡producNon ¡ 9 ¡

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Spider silk proteins: a series of repeats U (GGYGPGAGQQGPGSQGPGSGGQQGPGGQ)GPYGPSAAAAAA ¡ W (GGYGPGAGQQGPGSQGPGSGGQQGPGGQ)(GGYGPGAGQQGPGSQGPGSGGQQGPGGQ)GPYGPSAAAAAA ¡ β -spirals ¡ and ¡ β -helices act like springs giving the silk high elasticity. β - sheets give strength and stiffness properties to the fiber. β ¡-­‑ ¡Sheets ¡ β ¡-­‑ ¡Spiral ¡ β ¡-­‑ ¡Helix ¡ 11 ¡

Spider silk amino acid composition Amino ¡Acid ¡ Count ¡ % ¡ComposiBon ¡ Glycine ¡(G) ¡ 30 ¡ 44.1 ¡ Glutamine ¡(Q) ¡ 12 ¡ 17.6 ¡ Proline ¡(P) ¡ 10 ¡ 14.7 ¡ Alanine ¡(A) ¡ 8 ¡ 11.8 ¡ Serine ¡(S) ¡ 5 ¡ 7.4 ¡ Tyrosine ¡(Y) ¡ 3 ¡ 4.4 ¡ • Our ¡silk ¡gene ¡uses ¡only ¡six ¡of ¡the ¡twenty ¡different ¡ amino ¡acids ¡ • 44% ¡of ¡the ¡amino ¡acids ¡are ¡glycine, ¡so ¡having ¡enough ¡ intracellular ¡glycine ¡is ¡important ¡for ¡producNon ¡ 12 ¡

Designing a system to produce silk Spider ¡silk ¡plasmid ¡ Cm R ¡ • E. ¡coli ¡ ¡ is ¡used ¡to ¡transform ¡the ¡spider ¡silk ¡plasmid ¡ • The ¡bacteria ¡works ¡hard ¡to ¡produce ¡the ¡silk ¡ • When ¡the ¡ E. ¡coli ¡is ¡overworked ¡it ¡no ¡longer ¡has ¡ sufficient ¡tRNA’s ¡to ¡make ¡proteins ¡it ¡needs ¡to ¡survive, ¡ and ¡product ¡yield ¡decreases ¡ 13 ¡

tRNA Supplementation • Since ¡there ¡are ¡only ¡6 ¡different ¡amino ¡acids ¡in ¡spider ¡silk, ¡ overexpression ¡of ¡the ¡silk ¡protein ¡may ¡lead ¡to ¡the ¡depleNon ¡ of ¡charged ¡tRNA ¡molecules ¡in ¡the ¡cell, ¡prevenNng ¡the ¡cell ¡ from ¡making ¡proteins ¡ • Our ¡spider ¡silk ¡constructs ¡have ¡been ¡opNmized ¡to ¡use ¡only ¡ 1 ¡or ¡2 ¡of ¡the ¡codons ¡for ¡each ¡amino ¡acid ¡ • By ¡supplying ¡these ¡extra ¡tRNA ¡genes, ¡we ¡can ¡increase ¡the ¡ intracellular ¡pool ¡of ¡the ¡needed ¡tRNAs, ¡and ¡hopefully ¡ increase ¡levels ¡of ¡spider ¡silk ¡producNon ¡ 14 ¡

15 ¡

Spider silk sequence design F1 Fewest tRNA, 2E construct, Length: 204 bp U1 Unoptimized 1E construct, Length: 120 bp GGTGGTTATGGTCCTGGTGCAGGTCAACAAGGTC GGCGGTTATGGTCCGGGCGCCGGCCAGCAAGGTC CTGGTAGTCAAGGTCCTGGTAGTGGTGGTCAACA CGGGCAGCCAGGGTCCGGGCAGCGGTGGCCAACA AGGTCCTGGTGGTCAAGGTGGTTATGGTCCTGGT GGGTCCGGGTGGTCAGGGGCCGTATGGTCCGAGC GCAGGTCAACAAGGTCCTGGTAGTCAAGGTCCTG GCTGCGGCAGCGGCAGCT GTAGTGGTGGTCAACAAGGTCCTGGTGGTCAAGG GC% ¡= ¡75% ¡ TCCTTATGGTCCTAGTGCAGCAGCAGCAGCAGCA GC% ¡= ¡55% ¡ B1 Balanced tRNA, 2E construct Length: 204 bp W1 Unoptimized 2E construct, Length: 204 bp GGTGGATATGGTCCTGGAGCAGGTCAACAAGGAC GGCGGTTATGGTCCGGGCGCCGGCCAGCAAGGTC CAGGTAGTCAAGGACCTGGTTCTGGAGGTCAACA CGGGCAGCCAGGGTCCGGGCAGCGGTGGCCAACA AGGACCAGGTGGACAAGGTGGATATGGTCCTGGA GGGTCCGGGTGGTCAGGGCGGTTATGGTCCGGGC GCAGGTCAACAAGGACCAGGTAGTCAAGGACCTG GCCGGCCAGCAAGGTCCGGGCAGCCAGGGTCCGG GTTCTGGAGGTCAACAAGGACCAGGTGGACAAGG GCAGCGGTGGCCAACAGGGTCCGGGTGGTCAGGG TCCTTATGGACCAAGTGCAGCAGCAGCAGCAGCA GCCGTATGGTCCGAGCGCTGCGGCAGCGGCTGCA GC% ¡= ¡55% ¡ GC% ¡= ¡75% ¡ GGC ¡ ¡  ¡ GGT ¡ All ¡available ¡in ¡the ¡registry ¡now! ¡ 16 ¡

tRNAs DNA ¡construct ¡containing ¡the ¡ six ¡tRNAs ¡for ¡enhanced ¡spider ¡ silk ¡expression ¡in ¡‘F’ ¡construct ¡ P ¡ A ¡ P ¡ A ¡ Q ¡ Q ¡ S ¡ S ¡ Y ¡ G ¡ G ¡ Y ¡ G-­‑Glycine ¡(GGT ¡ ¡codon) ¡ Q-­‑Glutamine ¡(CAA ¡codon) ¡ P-­‑Proline ¡(CCT ¡codon) ¡ A-­‑Alanine ¡(GCA ¡codon) ¡ S-­‑ ¡Serine ¡(AGT ¡codon) ¡ Y-­‑Tyrosine ¡(TAT ¡codon) ¡ 17 ¡

tRNAs DNA ¡construct ¡containing ¡the ¡ five ¡tRNAs ¡for ¡enhanced ¡spider ¡ A ¡ silk ¡expression ¡in ¡‘B’ ¡construct ¡ Q ¡ S ¡ S ¡ P ¡ G ¡ P ¡ T ¡ G ¡ R ¡ G ¡ P ¡ To ¡help ¡with ¡ BioBrick ¡scar ¡ G-­‑Glycine ¡(GGA ¡codon) ¡ P-­‑Proline ¡(CCA ¡codon) ¡ S-­‑ ¡Serine ¡(TCT ¡codon) ¡ S ¡ T-­‑Threonine ¡(ACT ¡codon) ¡ Y ¡ R-­‑Arginine ¡(AGA ¡codon) ¡ 18 ¡

The benefit of tRNAs ¡ AddiBonal ¡ ¡tRNAs ¡ AddiNonal ¡tRNA ¡plasmid ¡ Kan R ¡ • With ¡addiNonal ¡tRNAs ¡the ¡bacteria ¡should ¡be ¡able ¡to ¡ handle ¡our ¡spider ¡silk ¡BioBricks ¡ • The ¡tRNA ¡plasmid ¡is ¡pSB3K3 ¡ 19 ¡

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Principles of Assembly • Spider ¡Silk ¡Repeat ¡Units ¡ – Many ¡spider ¡silk ¡BioBrick ¡monomers ¡were ¡assembled ¡ to ¡create ¡longer ¡repeNNve ¡sequences ¡ • Added ¡Start ¡Codon ¡ ATG-­‑ ¡ – ¡Met ¡(ATG) ¡placed ¡before ¡first ¡Spider ¡Silk ¡repeat ¡unit ¡ • Added ¡Promoter ¡+ ¡RBS ¡ – BBa_K208010 ¡(Utah ¡State ¡iGEM ¡2009) ¡ • HisNdine ¡Tag ¡ – 10x ¡His-­‑tag ¡placed ¡aler ¡the ¡repeat ¡units ¡ 21 ¡

Addition of repeating units 1X ¡ His-­‑tag ¡ atg ¡+ ¡Spider ¡silk ¡unit ¡ Promoter ¡+ ¡RBS ¡ Spider ¡silk ¡unit ¡ 2X ¡ BBa_K844000 ¡ e.g. ¡ ¡BBa_K844005 ¡ BBa_K208010 ¡ e.g. ¡Ba_K844001 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡BBa_K844006 ¡ BBa_K844002 ¡ 3X ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡BBa_K844007 ¡ BBa_K844003 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡BBa_K844008 ¡ BBa_K844004 ¡ 4X ¡ 5X ¡ 6X ¡ 7X ¡ 8X ¡ 9X ¡ 10X ¡ 11X ¡ 12X ¡ 22 ¡