Medical bioremedia-on : An alterna*ve treatment for - - PowerPoint PPT Presentation

Medical ¡bioremedia-on: ¡An ¡ alterna*ve ¡treatment ¡for ¡ atherosclerosis ¡

ITESM ¡CEM ¡

How ¡it ¡all ¡started… ¡

• Sept. ¡2013 ¡
• Oct. ¡2014 ¡

What ¡is ¡Atherosclerosis? ¡

• A ¡disease ¡in ¡which ¡

plaque ¡builds ¡up ¡on ¡ the ¡inner ¡layer ¡of ¡ arteries ¡

• Consequences: ¡

– An ¡ increase ¡ in ¡ blood ¡pressure ¡ – Higher ¡ risk ¡

• f ¡

strokes ¡ – Sudden ¡death ¡

Figure ¡1: ¡ ¡View ¡of ¡an ¡atheroma ¡

hHp://www.nhlbi.nih.gov/health/health-­‑topics/topics/atherosclerosis/ ¡

What ¡causes ¡Atherosclerosis? ¡

• 1. ¡Lipoproteins ¡(containing ¡cholesterol) ¡are ¡oxidized. ¡
• 2. ¡Oxidized ¡cholesterol ¡accumulates ¡
• 3. ¡An ¡immflamatory ¡response ¡is ¡triggered ¡

Figure ¡2: ¡Forma-on ¡of ¡an ¡atheroma ¡

hHp://openi.nlm.nih.gov/imgs/512/199/2118281/2118281_jem2030813f01.png ¡

Role ¡of ¡7-­‑ketocholesterol ¡

• It ¡is ¡a ¡common ¡oxida*on ¡product ¡of ¡cholesterol ¡
• It ¡ has ¡ been ¡ widely ¡ studied ¡ (Jacques ¡ Mathieu, ¡ Rice ¡

University) ¡

¡Figure ¡3: ¡Conversion ¡ ¡of ¡cholesterol ¡into ¡7-­‑ketocholesterol ¡

hHp://www.genox.com/mono3.html ¡

Can ¡bacteria ¡do ¡this ¡ backwards? ¡ Chromobacterium ¡sp. ¡and ¡ Rhodococcus ¡jos4i ¡can! ¡

Medical ¡Bioremedia-on ¡ Macrophage ¡therapy ¡based ¡on ¡the ¡ usage ¡of ¡microbial ¡enzymes ¡ New ¡synthe-c ¡metabolic ¡pathway ¡

• Enhancement ¡
• f ¡

7-­‑ketocholesterol ¡ conversion ¡ into ¡ cholesterol ¡(readily ¡metabolized) ¡

• Introducing ¡bacterial ¡enzymes ¡in ¡mammalian ¡cells ¡

OUR ¡GOAL: ¡

New ¡synthe*c ¡metabolic ¡pathway ¡

• Designed ¡by ¡our ¡team ¡(based ¡on ¡Mathieu’s ¡studies) ¡

Three ¡Microbial ¡Enzymes ¡

Cholesterol ¡oxidase ¡ Oxoacyl ¡reductase ¡ 7-­‑dehydratase ¡

• Cholesterol ¡oxidase ¡(Chromobacterium ¡sp.) ¡
• Two ¡hypothe*cal ¡proteins ¡(Rhodococcus ¡jos4i) ¡
• 3D ¡Models ¡generated ¡by ¡our ¡team ¡(I-­‑TASSER) ¡

Enzyme ¡Kine*cs ¡Modeling ¡

Mathema*cal ¡model ¡built ¡by ¡our ¡team ¡

• Two ¡enzymes ¡were ¡modelled ¡
• Michaelis-­‑Menten ¡kine*cs ¡
• 3 ¡coupled ¡differen*al ¡equa*ons. ¡
• Approximated ¡using ¡Rungge-­‑Ku\a ¡4th ¡order ¡
• method. ¡

Predic*ons ¡obtained ¡

• Plots: ¡substrate ¡concentra*on ¡in ¡*me ¡

– Second ¡enzyme’s ¡affinity ¡fixed ¡ – First ¡enzyme’s ¡affinity ¡assessed ¡at ¡increasing ¡values ¡

7-­‑ketocholesterol ¡ 7-­‑βOH-­‑colesterol ¡ Cholesterol ¡

Endogenous ¡ human ¡ pathways ¡ Microbial ¡synthe*c ¡ pathway ¡

X: ¡*me ¡ Y: ¡concentra*on ¡

BioBrick ¡by ¡BioBrick ¡… ¡

Project ¡ Primer ¡Design ¡& ¡ HF ¡PCR ¡ Liga*on ¡in ¡ pSB1C3 ¡ Characteriza*on ¡ Sequence ¡

• p*miza*on ¡of ¡

enzymes ¡ Liga*on ¡in ¡ pSB1C3 ¡ Expression ¡and ¡ purifica*on ¡ Prove ¡enzyme ¡ catalysis ¡ Human ¡Prac*ces ¡ Interlab ¡ Modeling ¡ Final ¡construct ¡

Final ¡Step!! ¡ ¡ Mammalian ¡Vector ¡Construc*on ¡

• pCMV: ¡promoter ¡
• Kozak ¡Sequence: ¡RBS ¡
• BGHPA: ¡

Terminator-­‑ ¡ Polyadenila*on ¡ ¡

• f1ori: ¡origin ¡of ¡replica*on ¡
• NeoR: ¡

Aminoglycoside ¡

• phosphotransferase. ¡

Selec*on ¡marker. ¡

• Oxoacyl ¡reductase ¡
• 7-­‑dehydratase ¡
• Cholesterol ¡oxidase ¡

7775 ¡bp ¡

pCMV ¡

BBa_K1313005 ¡ Promoter ¡ pCMV ¡ 588 ¡bp ¡

Figure ¡ 4. ¡ Successful ¡ Transforma-on ¡ of ¡ pCMV ¡in ¡pSB1C3 ¡

1766bp ¡ 892bp ¡

Figure ¡5. ¡Diges-on ¡Proof ¡pCMV ¡Gel ¡ ¡Electrophoresis ¡Lane ¡1 ¡

Oxoacyl ¡reductase ¡

Pep*de ¡ signal ¡ Glycosila*on ¡ site ¡ Prefix+suffix ¡ Synthesis ¡ CDS ¡Oxoacyl ¡ Reductase ¡

BBa_K1313002 ¡ CDS ¡ Oxoacyl ¡Reductase ¡ 942 ¡bp ¡ BBa_K1313003 ¡ RBS+CDS ¡ RBS+Oxoacyl ¡ Reductase ¡ 960 ¡bp ¡

Oxoacyl ¡reductase ¡

Cut ¡+ ¡Paste ¡sequence ¡in ¡expression ¡vector ¡ ¡ Transform ¡in ¡DH5-­‑alpha ¡and ¡grow ¡un*l ¡O.D. ¡ 0.5-­‑0.6 ¡ Add ¡IPTG ¡1mM ¡and ¡take ¡sample ¡every ¡hour ¡ and ¡observe ¡overexpression ¡ SDS ¡– ¡PAGE ¡15% ¡

Figure ¡6. ¡Methodology ¡Oxoacyl ¡Reductase ¡characteriza-on ¡

Oxoacyl ¡reductase ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡1 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡2 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡3 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡4 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡5 ¡

Figure ¡7. ¡Oxoacyl ¡reductase ¡analysis ¡before ¡and ¡acer ¡induc-on ¡with ¡IPTG. ¡Lanes: ¡1, ¡protein ¡marker ¡Precision ¡Plus ¡ Protein ¡TM ¡Dual ¡Color ¡Standards ¡(10 ¡ul),. ¡2, ¡control ¡Oxoacyl ¡reductase ¡sample ¡(20 ¡ul). ¡3, ¡protein ¡induced ¡with ¡IPTG ¡ hour ¡1 ¡(20 ¡ul). ¡4, ¡protein ¡induced ¡with ¡IPTG ¡hour ¡2 ¡(20 ¡ul). ¡5, ¡protein ¡induced ¡with ¡IPTG ¡hour ¡3 ¡(20 ¡ul). ¡

10 ¡ 15 ¡ 20 ¡ 25 ¡ 37 ¡ 50 ¡ 75 ¡ 100 ¡ 150 ¡ 250 ¡ kDA ¡

34 ¡kDa ¡

BGHPA ¡

BBa_K1313006 ¡ Terminator ¡ BGHPA ¡ 228 ¡bp ¡

Figure ¡8. ¡Successful ¡Transforma-on ¡of ¡BGHPA ¡in ¡ pSB1C3 ¡

1406 ¡bp ¡ 892bp ¡

Figure ¡ 9. ¡ Diges-on ¡ proof ¡ of ¡ BGHPA ¡ on ¡ a ¡ electrophoresis ¡gel ¡lane ¡5 ¡ ¡

f1 ¡Ori, ¡BGHPA ¡and ¡CMV ¡ ¡Characteriza*on-­‑MARC145 ¡

Figure ¡10. ¡Mammalian ¡Expression ¡Vector: ¡ A) Control ¡with ¡lipofectamine ¡ ¡ ¡B) ¡Cells ¡with ¡lipofectamine ¡ ¡C) ¡Cells ¡with ¡ With ¡no ¡plasmid ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡and ¡plasmid ¡(clear ¡field) ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡plasmid ¡and ¡lipofectamine ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡dark ¡field. ¡

7-­‑Dehydratase ¡

Pep*de ¡ signal ¡ Glycosila*on ¡ site ¡ Prefix+suffix ¡ Synthesis ¡ CDS ¡7-­‑ Dehydratase ¡

BBa_K1313002 ¡ CDS ¡ 7-­‑dehydratase ¡ 537 ¡bp ¡

7-­‑ ¡Dehydratase ¡

Cut ¡+ ¡Paste ¡sequence ¡in ¡expression ¡vector ¡ ¡ Transform ¡in ¡DH5-­‑alpha ¡ Solubility ¡analysis ¡with ¡IPTG ¡1mM ¡induc*on ¡ SDS ¡– ¡PAGE ¡15% ¡

Figure ¡11. ¡Methodology ¡for ¡7-­‑Dehydratase ¡

7-­‑Dehydratase ¡

¡1 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡2 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡3 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡4 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡5 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡6 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡7 ¡

10 ¡ 15 ¡ 20 ¡ 25 ¡ 37 ¡ 50 ¡ 75 ¡ 100 ¡ 150 ¡ 250 ¡ kDA ¡

Image ¡12. ¡Dehydratase ¡analysis ¡by ¡SDS-­‑PAGE. ¡Lanes: ¡1, ¡protein ¡marker ¡Precision ¡Plus ¡Protein ¡ TM ¡Unstained ¡ Standards ¡(10 ¡ul). ¡2, ¡protein ¡without ¡induc-on ¡with ¡IPTG ¡or ¡control ¡sample ¡(15 ¡ul). ¡3, ¡protein ¡induced ¡with ¡ IPTG ¡(15 ¡ul). ¡4, ¡empty ¡lane. ¡5, ¡protein ¡found ¡in ¡inclusion ¡bodies ¡(15 ¡ul). ¡6, ¡protein ¡found ¡in ¡soluble ¡phase ¡(15 ¡ ul). ¡7, ¡protein ¡found ¡in ¡soluble ¡phase ¡(15 ¡ul). ¡

22 ¡kDa ¡

7-­‑Dehydratase ¡– ¡MARC145 ¡

Figure ¡13. ¡Lec: ¡Control ¡cells ¡with ¡lipofectamine ¡before ¡lipofec-on. ¡ Right: ¡Cells ¡acer ¡lipofec-on ¡with ¡7-­‑dehydratase ¡in ¡a ¡mammalian ¡ expression ¡vector. ¡

Cholesterol ¡Oxidase ¡

• Fig. ¡ 14 ¡ Growth ¡ of ¡ isolated ¡ white ¡ colony ¡

showing ¡ a ¡ successful ¡ transforma-on ¡ with ¡ cholesterol ¡ oxidase ¡ enzyme ¡ in ¡ pSB1C3 ¡ LB ¡ plate ¡ ¡ with ¡chloramphenicol ¡(35 ¡mg/ul). ¡

NeoR ¡

• Fig. ¡ 15 ¡ Successful ¡ Transforma-on ¡ of ¡ NeoR ¡

in ¡pSB1C3 ¡

• Fig. ¡16 ¡Diges-on ¡proof ¡of ¡NeoR ¡on ¡a ¡electrophoresis ¡gel ¡lane ¡5 ¡ ¡

1975bp ¡ 892bp ¡ BBa_K1313004 ¡ Coding ¡ Neomycin ¡ Resistance ¡ 786 ¡

NeoR ¡

Neomycin ¡ concentra-on ¡ (ug/ml) ¡ CFU ¡ 0 ¡ Uncountable ¡ 35 ¡ 288 ¡ 40 ¡ 284 ¡ 60 ¡ 191 ¡ 100 ¡ 89 ¡ 150 ¡ 52 ¡ Table ¡1: ¡NeoR ¡concentra*ons ¡and ¡ CFUs ¡grown ¡ Figure ¡17: ¡Graphic ¡of ¡CFU ¡vs ¡Neomycin ¡ concentra*ons ¡ 0 ¡ 50 ¡ 100 ¡ 150 ¡ 200 ¡ 250 ¡ 300 ¡ 350 ¡ 0 ¡ 50 ¡ 100 ¡ 150 ¡ 200 ¡ CFU/ml ¡ Neo ¡ug/ml ¡

NeoR ¡

Conclusions ¡

Conclusions ¡

• Biobricks ¡proved ¡on ¡pSB1C3 ¡
• Correct ¡design ¡of ¡synthe*c ¡metabolic ¡pathway ¡
• pCMV, ¡BGHPA ¡and ¡NeoR ¡work! ¡
• We ¡obtained ¡three ¡recombinant ¡proteins ¡with ¡main ¡

characteris*cs ¡to ¡accomplish ¡our ¡goal ¡

• Human ¡prac*ces ¡ ¡

Perspec-ve ¡

Personalized ¡Gene ¡therapy ¡

Insert ¡DNA ¡ material ¡

Fig ¡18. ¡Induc-on ¡of ¡pluripotent ¡stem ¡cells ¡from ¡ mouse ¡embryonic ¡and ¡adult ¡fibroblast ¡cultures. ¡ Yamanaka ¡theory ¡hHp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/

16904174 ¡

Pa*ent ¡

• ¡CRISPR/Cas ¡mecanism ¡
• Fig. ¡19 ¡Macrophage ¡differen-a-on ¡from ¡

embryoid ¡bodies ¡derived ¡from ¡human ¡ embryonic ¡stem ¡cells. ¡hHp://

www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20498689 ¡

Not ¡just ¡experiments ¡& ¡lab: ¡ Human ¡Prac-ces ¡

• Workshops, ¡talks, ¡courses ¡

– What ¡is ¡synthe*c ¡biology? ¡ – DNA ¡extrac*on ¡ – Preven*on ¡of ¡atherosclerosis ¡ – Make ¡consciousness ¡ – Bioethics ¡talks ¡ ¡

• Handbooks ¡

Handbooks ¡

Biosafety ¡

• Your ¡training ¡
• Local ¡Rules ¡or ¡regula*ons ¡
• Organisms ¡ and ¡ parts ¡ we ¡

use ¡

• Risks ¡of ¡the ¡project ¡
• Risks ¡ of ¡ the ¡ project ¡ in ¡

future ¡terms ¡

• Bioparts ¡

supported ¡ by ¡ “CIBIOGEM” ¡

Working ¡with ¡other ¡ teams! ¡

• Coopera*on ¡
• Collabora*on ¡
• Help ¡through ¡the ¡

development ¡of ¡our ¡ project ¡

• Interlab ¡
• Human ¡prac*ces ¡

(Courses ¡& ¡Handbooks) ¡

THANK ¡YOU ¡

CRISPR/Cas ¡mecanism ¡

• Fig. ¡20. ¡DNA ¡sequencing ¡and ¡CRISPR-­‑ ¡

Cas9 ¡gene ¡edi-ng ¡for ¡target ¡valida-on ¡in ¡ mammalian ¡cells ¡

hHp://www.nature.com/nchembio/journal/v10/ n8/full/nchembio.1550.html ¡