Medical bioremedia-on : An alterna*ve treatment for - PowerPoint PPT Presentation

ITESM ¡CEM ¡ Medical ¡bioremedia-on : ¡An ¡ alterna*ve ¡treatment ¡for ¡ atherosclerosis ¡

How ¡it ¡all ¡started… ¡ Sept. ¡2013 ¡ Oct. ¡2014 ¡

What ¡is ¡Atherosclerosis? ¡ • A ¡disease ¡in ¡which ¡ plaque ¡builds ¡up ¡on ¡ the ¡inner ¡layer ¡of ¡ arteries ¡ • Consequences: ¡ – An ¡ increase ¡ in ¡ blood ¡pressure ¡ – Higher ¡ risk ¡ of ¡ strokes ¡ – Sudden ¡death ¡ Figure ¡1: ¡ ¡View ¡of ¡an ¡atheroma ¡ hHp://www.nhlbi.nih.gov/health/health-­‑topics/topics/atherosclerosis/ ¡

What ¡causes ¡Atherosclerosis? ¡ 1. ¡Lipoproteins ¡(containing ¡cholesterol) ¡are ¡oxidized. ¡ 2. ¡Oxidized ¡cholesterol ¡accumulates ¡ 3. ¡An ¡immflamatory ¡response ¡is ¡triggered ¡ Figure ¡2: ¡Forma-on ¡of ¡an ¡atheroma ¡ hHp://openi.nlm.nih.gov/imgs/512/199/2118281/2118281_jem2030813f01.png ¡

Role ¡of ¡7-­‑ketocholesterol ¡ • It ¡is ¡a ¡common ¡oxida*on ¡product ¡of ¡cholesterol ¡ • It ¡ has ¡ been ¡ widely ¡ studied ¡ (Jacques ¡ Mathieu, ¡ Rice ¡ University) ¡ Can ¡bacteria ¡do ¡this ¡ backwards? ¡ Chromobacterium ¡sp. ¡ and ¡ Rhodococcus ¡jos4i ¡ can! ¡ ¡Figure ¡3: ¡Conversion ¡ ¡of ¡cholesterol ¡into ¡7-­‑ketocholesterol ¡ hHp://www.genox.com/mono3.html ¡

Medical ¡Bioremedia-on ¡ • Enhancement ¡ of ¡ 7-­‑ketocholesterol ¡ conversion ¡ into ¡ cholesterol ¡(readily ¡metabolized) ¡ • Introducing ¡bacterial ¡enzymes ¡in ¡mammalian ¡cells ¡ OUR ¡GOAL: ¡ Macrophage ¡therapy ¡based ¡on ¡the ¡ usage ¡of ¡microbial ¡enzymes ¡ New ¡synthe-c ¡metabolic ¡pathway ¡

New ¡synthe*c ¡metabolic ¡pathway ¡ Designed ¡by ¡our ¡team ¡(based ¡on ¡Mathieu’s ¡studies) ¡ •

Three ¡Microbial ¡Enzymes ¡ • Cholesterol ¡oxidase ¡( Chromobacterium ¡sp. ) ¡ • Two ¡hypothe*cal ¡proteins ¡( Rhodococcus ¡jos4i ) ¡ 3D ¡Models ¡generated ¡by ¡our ¡team ¡(I-­‑TASSER) ¡ • Cholesterol ¡oxidase ¡ Oxoacyl ¡reductase ¡ 7-­‑dehydratase ¡

Enzyme ¡Kine*cs ¡Modeling ¡ Mathema*cal ¡model ¡built ¡by ¡our ¡team ¡ Two ¡enzymes ¡were ¡modelled ¡ • Michaelis-­‑Menten ¡kine*cs ¡ • 3 ¡coupled ¡differen*al ¡equa*ons. ¡ • Approximated ¡using ¡Rungge-­‑Ku\a ¡4th ¡order ¡ • method. ¡

Predic*ons ¡obtained ¡ Plots: ¡substrate ¡concentra*on ¡in ¡*me ¡ • – Second ¡enzyme’s ¡affinity ¡fixed ¡ – First ¡enzyme’s ¡affinity ¡assessed ¡at ¡increasing ¡values ¡ X: ¡*me ¡ Y: ¡concentra*on ¡ 7-­‑ketocholesterol ¡ 7-­‑βOH-­‑colesterol ¡ Cholesterol ¡ Endogenous ¡ human ¡ pathways ¡ Microbial ¡synthe*c ¡ pathway ¡

BioBrick ¡by ¡BioBrick ¡… ¡ Primer ¡Design ¡& ¡ Liga*on ¡in ¡ Characteriza*on ¡ HF ¡PCR ¡ pSB1C3 ¡ Project ¡ Final ¡construct ¡ Human ¡Prac*ces ¡ Expression ¡and ¡ purifica*on ¡ Sequence ¡ Interlab ¡ Liga*on ¡in ¡ op*miza*on ¡of ¡ pSB1C3 ¡ enzymes ¡ Prove ¡enzyme ¡ catalysis ¡ Modeling ¡

Final ¡Step!! ¡ ¡ Mammalian ¡Vector ¡Construc*on ¡ • pCMV : ¡promoter ¡ • Kozak ¡Sequence : ¡RBS ¡ • BGHPA : ¡ Terminator-­‑ ¡ Polyadenila*on ¡ ¡ • f1ori : ¡origin ¡of ¡replica*on ¡ • NeoR : ¡ Aminoglycoside ¡ 7775 ¡bp ¡ phosphotransferase. ¡ Selec*on ¡marker. ¡ • Oxoacyl ¡reductase ¡ • 7-­‑dehydratase ¡ • Cholesterol ¡oxidase ¡

pCMV ¡ BBa_K1313005 ¡ Promoter ¡ pCMV ¡ 588 ¡bp ¡ 1766bp ¡ Figure ¡ 4. ¡ Successful ¡ Transforma-on ¡ of ¡ 892bp ¡ pCMV ¡in ¡pSB1C3 ¡ Figure ¡5. ¡Diges-on ¡Proof ¡pCMV ¡Gel ¡ ¡Electrophoresis ¡Lane ¡1 ¡

Oxoacyl ¡reductase ¡ BBa_K1313002 ¡ CDS ¡ Oxoacyl ¡Reductase ¡ 942 ¡bp ¡ BBa_K1313003 ¡ RBS+CDS ¡ RBS+Oxoacyl ¡ 960 ¡bp ¡ Reductase ¡ Synthesis ¡ Pep*de ¡ Glycosila*on ¡ Prefix+suffix ¡ CDS ¡Oxoacyl ¡ signal ¡ site ¡ Reductase ¡

Oxoacyl ¡reductase ¡ Cut ¡+ ¡Paste ¡sequence ¡in ¡expression ¡vector ¡ ¡ Transform ¡in ¡DH5-­‑alpha ¡and ¡grow ¡un*l ¡O.D. ¡ 0.5-­‑0.6 ¡ Add ¡IPTG ¡1mM ¡and ¡take ¡sample ¡every ¡hour ¡ and ¡observe ¡overexpression ¡ SDS ¡– ¡PAGE ¡15% ¡ Figure ¡6. ¡Methodology ¡Oxoacyl ¡Reductase ¡characteriza-on ¡

Oxoacyl ¡reductase ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡1 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡2 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡3 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡4 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡5 ¡ kDA ¡ 250 ¡ 150 ¡ 100 ¡ 75 ¡ 50 ¡ 37 ¡ 34 ¡kDa ¡ 25 ¡ 20 ¡ 15 ¡ 10 ¡ Figure ¡7. ¡Oxoacyl ¡reductase ¡analysis ¡before ¡and ¡acer ¡induc-on ¡with ¡IPTG. ¡Lanes: ¡1, ¡protein ¡marker ¡Precision ¡Plus ¡ Protein ¡ TM ¡Dual ¡Color ¡Standards ¡(10 ¡ul),. ¡2, ¡control ¡Oxoacyl ¡reductase ¡sample ¡(20 ¡ul). ¡3, ¡protein ¡induced ¡with ¡IPTG ¡ hour ¡1 ¡(20 ¡ul). ¡4, ¡protein ¡induced ¡with ¡IPTG ¡hour ¡2 ¡(20 ¡ul). ¡5, ¡protein ¡induced ¡with ¡IPTG ¡hour ¡3 ¡(20 ¡ul). ¡

BGHPA ¡ BBa_K1313006 ¡ Terminator ¡ BGHPA ¡ 228 ¡bp ¡ 1406 ¡bp ¡ 892bp ¡ Figure ¡8. ¡Successful ¡Transforma-on ¡of ¡BGHPA ¡in ¡ pSB1C3 ¡ Figure ¡ 9. ¡ Diges-on ¡ proof ¡ of ¡ BGHPA ¡ on ¡ a ¡ electrophoresis ¡gel ¡lane ¡5 ¡ ¡

f1 ¡Ori, ¡BGHPA ¡and ¡CMV ¡ ¡Characteriza*on-­‑MARC145 ¡ Figure ¡10. ¡Mammalian ¡Expression ¡Vector: ¡ A) Control ¡with ¡lipofectamine ¡ ¡ ¡B) ¡Cells ¡with ¡lipofectamine ¡ ¡C) ¡Cells ¡with ¡ With ¡no ¡plasmid ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡and ¡plasmid ¡(clear ¡field) ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡plasmid ¡and ¡lipofectamine ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡dark ¡field. ¡

7-­‑Dehydratase ¡ BBa_K1313002 ¡ CDS ¡ 7-­‑dehydratase ¡ 537 ¡bp ¡ Synthesis ¡ Pep*de ¡ Glycosila*on ¡ CDS ¡7-­‑ Prefix+suffix ¡ signal ¡ site ¡ Dehydratase ¡

7-­‑ ¡Dehydratase ¡ Cut ¡+ ¡Paste ¡sequence ¡in ¡expression ¡vector ¡ ¡ Transform ¡in ¡DH5-­‑alpha ¡ Solubility ¡analysis ¡with ¡IPTG ¡1mM ¡induc*on ¡ SDS ¡– ¡PAGE ¡15% ¡ Figure ¡11. ¡Methodology ¡for ¡7-­‑Dehydratase ¡

7-­‑Dehydratase ¡ ¡1 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡2 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡3 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡4 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡5 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡6 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡7 ¡ kDA ¡ 250 ¡ 150 ¡ 100 ¡ 75 ¡ 50 ¡ 37 ¡ 25 ¡ 20 ¡ 22 ¡kDa ¡ 15 ¡ 10 ¡ Image ¡12. ¡Dehydratase ¡analysis ¡by ¡SDS-­‑PAGE. ¡Lanes: ¡1, ¡protein ¡marker ¡Precision ¡Plus ¡Protein ¡ TM ¡Unstained ¡ Standards ¡(10 ¡ul). ¡2, ¡protein ¡without ¡induc-on ¡with ¡IPTG ¡or ¡control ¡sample ¡(15 ¡ul). ¡3, ¡protein ¡induced ¡with ¡ IPTG ¡(15 ¡ul). ¡4, ¡empty ¡lane. ¡5, ¡protein ¡found ¡in ¡inclusion ¡bodies ¡(15 ¡ul). ¡6, ¡protein ¡found ¡in ¡soluble ¡phase ¡(15 ¡ ul). ¡7, ¡protein ¡found ¡in ¡soluble ¡phase ¡(15 ¡ul). ¡

7-­‑Dehydratase ¡– ¡MARC145 ¡ Figure ¡13. ¡Lec: ¡Control ¡cells ¡with ¡lipofectamine ¡before ¡lipofec-on. ¡ Right: ¡Cells ¡acer ¡lipofec-on ¡with ¡7-­‑dehydratase ¡in ¡a ¡mammalian ¡ expression ¡vector. ¡

Cholesterol ¡Oxidase ¡ Fig. ¡ 14 ¡ Growth ¡ of ¡ isolated ¡ white ¡ colony ¡ showing ¡ a ¡ successful ¡ transforma-on ¡ with ¡ cholesterol ¡ oxidase ¡ enzyme ¡ in ¡ pSB1C3 ¡ LB ¡ plate ¡ ¡ with ¡chloramphenicol ¡(35 ¡mg/ul). ¡