Manchester Institute of Biotechnology Discovery through innovation - - PowerPoint PPT Presentation

Manchester Institute of Biotechnology

Discovery through innovation

The Manchester Institute of Biotechnology is committed to the pursuit of research excellence, education, knowledge transfer and discovery through innovation whereby a coherent and integrated interdisciplinary research community work towards developing new biotechnologies that will find applications in areas such as human health, the energy economy, food security, industrial transformations and the environment.

@RoyGoodacre ¡ @Metabolomics ¡

Lessons learnt from HUSERMET The Human Serum Metabolome Project Roy Goodacre and friends

www.biospec.net ¡

www.husermet.org ¡

Funded ¡by ¡and ¡in ¡collabora/on ¡with: ¡

Department ¡of ¡Trade ¡ ¡ and ¡Industry ¡

MS ¡pla;orms ¡in ¡Mcr ¡

• Microbial ¡

– cell ¡extracts ¡ – metabolic ¡footprint ¡ – vola?les ¡

• Mammalian ¡

– serum/plasma, ¡urine, ¡?ssues, ¡vola?les ¡ – cell/?ssue ¡cultures ¡ – media ¡(metabolic ¡footprint) ¡

2x ¡LECO ¡GC-­‑TOF-­‑MS ¡ 2x ¡UPLC-­‑LTQ-­‑Orbitrap ¡XL ¡MS ¡ + ¡Waters ¡LCT ¡+ ¡Agilent ¡Q3 ¡ Waters ¡GCT-­‑MS ¡

n Plant ¡ Ø ?ssues ¡ ¡ Ø fruit ¡extracts ¡ Ø vola?les ¡

LESSON ¡I ¡

Mass ¡Spectrometers ¡AND ¡Chromatography ¡driM ¡

QCs ¡allow ¡signal ¡assessment ¡

QC 1 QC 2 QC 3 QC 4 QC 5 QC 6 QC 7 QC 8 QC 9 QC 10 blank column test solution sample 1 sample 2 sample 3 sample 4 sample 5 QC 11 sample 6 sample 7 sample 8 sample 9 sample 10 QC 12 sample 11

Begley ¡P. ¡et ¡al. ¡(2009) ¡Analy)cal ¡Chemistry ¡71, ¡7038-­‑7046 ¡ Real: 60 serum (healthy). QA: sigma serum. Spike1: glutaric acid, citric acid, alanine, glycine, leucine, phenylalanine, and tryptophan.

[each at 0.16 mg mL-1]

Spike 2: caffeine & nicotine.

[each at 0.16 mg mL-1]

QCs ¡allow ¡signal ¡correc?on ¡

QC 1 QC 2 QC 3 QC 4 QC 5 QC 6 QC 7 QC 8 QC 9 QC 10 blank column test solution sample 1 sample 2 sample 3 sample 4 sample 5 QC 11 sample 6 sample 7 sample 8 sample 9 sample 10 QC 12 sample 11

Sample ¡ QC ¡

Instrument ¡annual ¡ ¡ maintenance ¡ Before: ¡ AMer: ¡

Dunn ¡W. ¡et ¡al. ¡(2011) ¡Nature ¡Protocols ¡6, ¡1060-­‑1083 ¡

HUSERMET ¡ ¡pipeline ¡

metadata capture metabolomics curation reference map of normal biomarker discovery SOPs QCs

D D C C C C C C C C

SOP SOP N=1000s

Multiple samples - Biobank for future studies

reference map of normal biomarker discovery

HUSERMET ¡ ¡pipeline ¡ and ¡data ¡analysis ¡

Brown, ¡M. ¡et ¡al. ¡(2005) ¡Metabolomics ¡1, ¡39-­‑51 ¡ Mamas, ¡M. ¡et ¡al. ¡(2011) ¡Arch. ¡Toxicology ¡85, ¡5-­‑17 ¡ Goodacre, ¡R. ¡et ¡al. ¡(2007) ¡Metabolomics ¡3, ¡231-­‑241 ¡

• Normal ¡popula?ons: ¡
• Stockport ¡PCT ¡
• GSK, ¡EMAS ¡
• 1200 ¡subjects: ¡
• Took ¡18 ¡months ¡

!

Q: ¡Did ¡the ¡QC ¡correc?on ¡work? ¡

• Discriminant ¡

analysis ¡

• Abemp?ng ¡to ¡

separate ¡the ¡ 10 ¡batches ¡

• A: ¡Yes! ¡

Clinical ¡Chemistry ¡versus ¡LC-­‑MS ¡

Clinical ¡Chemistry ¡versus ¡GC-­‑MS ¡

microbial ¡ drugs ¡ food ¡

Q: ¡How ¡fast ¡did ¡we ¡get ¡to ¡this ¡point? ¡

A: ¡A ¡lot ¡slower ¡than ¡expected!!! ¡

hbp://searchengineland.com/figz/wp-­‑content/seloads/2014/08/speed-­‑slow-­‑snails-­‑ss-­‑1920-­‑800x450.jpg ¡

LESSON ¡II ¡

Need ¡to ¡control ¡experimental ¡design ¡

Databases: data + metadata Interpretation

Ronald A. Fisher (1938)

“To call in the statistician after the experiment is done may be no more than asking him to perform a post-mortem examination: he may be able to say what the experiment died of”

*Broadhurst, D. & Kell, D.B. (2006) Metabolomics 2, 171-196

* and this is why most claimed research findings are false

Data ¡analysis ¡ ‘slide’/‘pipeline’ ¡

Pre-processing Analysis + validation Visualisation

Poste ¡G. ¡(2011) ¡Bring ¡on ¡the ¡biomarkers. ¡Nature ¡469, ¡156-­‑157 ¡

Nature ¡469, ¡156-­‑157 ¡

Most ¡data ¡analyses ¡are ¡Supervised ¡

• Powerful! ¡But ¡they ¡do ¡make ¡mistakes! ¡
• Can ¡you ¡spot ¡the ¡difference? ¡
• Must ¡use ¡sta?s?cal ¡valida?on ¡

Sta?s?cian ¡needed ¡at ¡onset ¡

• Was ¡randomisa?on ¡

successful: ¡Check! ¡

• In ¡case-­‑control ¡studies ¡
• nly ¡non-­‑random ¡thing ¡

should ¡be ¡what ¡you ¡ are ¡tes?ng ¡for ¡

Ransohoff, ¡D.R. ¡(2005) ¡Nature ¡Reviews ¡Cancer ¡5, ¡142-­‑149 ¡

LESSON ¡II ¡

Biological ¡inference ¡possible ¡

Age ¡effects: ¡clinical ¡metadata ¡

Ageing: ¡glycolysis ¡and ¡TCA ¡

Figure: ¡Levine ¡A.J. ¡& ¡Puzio-­‑Kuter, ¡A.M. ¡(2010) ¡ ¡ Science ¡330, ¡1340-­‑1344 ¡

2-­‑way ¡ANOVA; ¡age ¡& ¡gender: ¡ F(1,779)=79.8, ¡p=3.1x10-­‑18 ¡

Gender ¡effects ¡

• Seen ¡previously ¡

– 4-­‑hydroxyphenyllac?c ¡acid, ¡ crea?nine, ¡citrate, ¡urate, ¡ glycerol, ¡hexadecenoic ¡acid ¡

• Higher ¡in ¡Females ¡

– Caffeine: ¡food ¡consump?on ¡ – 2-­‑aminomalonic ¡acid: ¡ associated ¡with ¡ atherosclero?c ¡plaques ¡ – glycerol, ¡+ ¡glyceric ¡acid, ¡ glycerol-­‑3P: ¡glycerolipid ¡and ¡ glycerophospholipid ¡synthesis ¡

Marker ¡of ¡oxida?ve ¡stress; ¡oxida?on ¡product ¡of ¡methionine ¡ ¡ 2-­‑way ¡ANOVA ¡on ¡gender: ¡ ¡F(1,901)=20.3, ¡p=7.7x10-­‑6 ¡

Gender ¡and ¡age ¡effects ¡

2-­‑way ¡ANOVA ¡ ¡ ¡ ¡Age ¡(<50 ¡vs. ¡>64 ¡y): ¡F(1,788)=39.1 ¡F(1,778)=11.7 ¡ ¡p=6.8x10-­‑10 ¡ ¡p=0.0007 ¡ ¡ ¡ ¡Gender ¡ ¡F(1,788)=55.4 ¡ ¡ ¡p=2.6x10-­‑13 ¡

BMI: ¡Body ¡Mass ¡Index ¡

less than 25 vs. greater than 30

GC-­‑MS ¡ UPLC-­‑MS(-­‑) ¡ UPLC-­‑MS(+) ¡ PCA ¡ PLS ¡

Amino ¡acids: ¡ ¡

Asparagine, ¡aspartate, ¡cys)ne, ¡cysteine, ¡ glutamine, ¡his)dine, ¡leucine, ¡ phenylalanine, ¡serine, ¡tyrosine ¡

Ubiquinone ¡9 ¡and ¡ubiquinone ¡6 ¡ and ¡Undecaprenyl ¡diphosphate ¡ Diglycerides ¡ Uric ¡acid ¡

MANY ¡OTHERS ¡

• Phospholipids ¡incl. ¡

sphingolipids ¡and ¡PCs ¡

• Lac?c ¡acid ¡
• Deoxy ¡sugars ¡and ¡

sugars ¡

• Faby ¡acids ¡
• xidised ¡faby ¡acids ¡

(e.g.13,14-­‑dihydroxy-­‑ docosanoic ¡acid, ¡ tetradecanoic ¡acid) ¡

• glycerol ¡

¡

BMI: ¡Body ¡Mass ¡Index ¡

less than 25 vs. greater than 30

Many ¡molecular ¡phenotypes ¡

Characteristic* !! Gender!(male:female)! 701:490! Age!(median,!IQR)! 48.0!(40.0,60.0)! BMI!(median,!IQR)! 25.63!(23.20,28.71)! Smokers!(non:ex:current)! 502:163:176! SBP!(median,!IQR),!mmHg! 125!(115,137)! DBP!(median,!IQR),!mmHg! 76!(70,83)! GLUC!(median,!IQR),!mmol.LP1! 4.71!(4.20,5.30)! CHOL!(median,!IQR),!mmol.LP1! 5.10!(4.30,5.80)! TRIG!(median,!IQR),!mmol.LP1! 1.18!(0.80,1.80)! HDLC!(median,!IQR),!mmol.LP1! 1.26!(1.00,1.50)! LDLC!(median,!IQR),!mmol.LP1! 3.2!(2.54,3.77)!

!

Clinical ¡characteris?cs ¡of ¡the ¡ Husermet ¡cohort ¡

Q: ¡Is ¡size ¡important? ¡

• We ¡measured ¡

1200 ¡subjects ¡

• Sample ¡size ¡>400 ¡

provides ¡the ¡ greatest ¡accuracy ¡ with ¡highest ¡ precision ¡

• Recommend: ¡

¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡at ¡least ¡200 ¡ ¡ ¡per ¡class ¡

A: ¡You ¡Bet! ¡

Factors ¡affec?ng ¡the ¡human ¡metabolome ¡ ¡

body composition tissue turnover metabolic rate (at rest) age human genotype health status reproductive status diurnal cycle nutrients non-nutrients drugs physical activity microbiome mental status Intrinsic factors Extrinsic factors Metabolic status

Goodacre, R. (2007) J. Nutrition 137, 259S-266S.

Metabolomics ¡of ¡a ¡ superorganism ¡

• Complex! ¡ ¡
• Its ¡metabolites ¡include: ¡

– Human ¡derived ¡metabolites ¡ – Microbial ¡derived ¡one ¡ – Nutri?onal ¡metabolites ¡ – Xenometabolites ¡

• To ¡do ¡it ¡properly… ¡

– Need ¡to ¡control ¡diet ¡ – Sampling ¡?me ¡(diurnal ¡rhythm) ¡ – Need ¡to ¡have ¡matched ¡controls ¡

www.husermet.org ¡

Funded ¡by ¡and ¡in ¡collabora/on ¡with: ¡

Department ¡of ¡Trade ¡ ¡ and ¡Industry ¡