Analy&cal ultracentrifuga&on and hydrodynamic modeling - - PowerPoint PPT Presentation

Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡and ¡hydrodynamic ¡modeling ¡

Olwyn ¡Byron ¡ ¡ School ¡of ¡Life ¡Sciences ¡ College ¡of ¡Medical, ¡Veterinary ¡and ¡Life ¡Sciences ¡ ¡ University ¡of ¡Glasgow, ¡Scotland ¡UK ¡ ¡

Structure ¡of ¡this ¡session ¡

• Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡
• Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡
• AUC ¡instrumenta&on ¡
• Modes ¡of ¡opera&on ¡
• Some ¡theory ¡
• SE ¡versus ¡SV ¡
• Data ¡analysis ¡
• Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡
• Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡
• Some ¡theory ¡
• SoOware ¡
• HYDRO++ ¡
• Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α5β1 ¡ligands ¡
• HYDROPRO ¡
• SOMO ¡
• Example: ¡Tpx ¡

¡

Structure ¡of ¡this ¡session ¡

• Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡
• Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡
• AUC ¡instrumenta&on ¡
• Modes ¡of ¡opera&on ¡
• Some ¡theory ¡
• SE ¡versus ¡SV ¡
• Data ¡analysis ¡
• Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡
• Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡
• Some ¡theory ¡
• SoOware ¡
• HYDRO++ ¡
• Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α5β1 ¡ligands ¡
• HYDROPRO ¡
• SOMO ¡
• Example: ¡Tpx ¡

¡

Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡by ¡AUC ¡

• Is ¡the ¡sample ¡homogeneous ¡or ¡heterogeneous? ¡ ¡
• If ¡heterogeneous, ¡is ¡it ¡in ¡molecular ¡weight, ¡shape, ¡or ¡both? ¡
• If ¡heterogeneous, ¡does ¡heterogeneity ¡depend ¡on ¡pH, ¡salt, ¡buffer, ¡etc? ¡
• Is ¡the ¡sample ¡pure ¡enough ¡for ¡X-­‑ray ¡crystallography, ¡SAXS, ¡SANS ¡or ¡NMR? ¡ ¡
• Does ¡the ¡sample: ¡
• self-­‑associate? ¡ ¡
• aggregate? ¡ ¡
• What ¡is ¡the ¡molecular ¡weight ¡of ¡the ¡sample, ¡or ¡a ¡mixture ¡of ¡samples? ¡ ¡
• Does ¡the ¡sample ¡bind ¡to ¡a ¡ligand? ¡ ¡
• What ¡is ¡the ¡stoichiometry ¡of ¡binding? ¡
• What ¡are ¡the ¡equilibrium ¡and ¡rate ¡constants ¡for ¡the ¡binding? ¡
• Is ¡the ¡associa&on ¡state/conforma&on ¡of ¡the ¡sample ¡affected ¡by ¡tagging? ¡

More ¡ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡by ¡AUC ¡

• What ¡is ¡the ¡sedimenta&on ¡and ¡diffusion ¡coefficient ¡of ¡my ¡sample? ¡
• Is ¡it ¡globular ¡or ¡unfolded/disordered? ¡ ¡
• Is ¡the ¡conforma&on ¡dependent ¡on ¡salt, ¡pH, ¡ligand ¡concentra&on, ¡deutera&on, ¡etc? ¡
• Do ¡muta&ons ¡affect ¡the ¡strength ¡of ¡binding, ¡self-­‑associa&on, ¡conforma&on, ¡

stoichiometry, ¡etc? ¡ ¡

• Is ¡the ¡sample ¡affected ¡by ¡crowding? ¡

Structure ¡of ¡this ¡session ¡

• Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡
• Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡
• AUC ¡instrumenta&on ¡
• Modes ¡of ¡opera&on ¡
• Some ¡theory ¡
• SE ¡versus ¡SV ¡
• Data ¡analysis ¡
• Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡
• Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡
• Some ¡theory ¡
• SoOware ¡
• HYDRO++ ¡
• Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α5β1 ¡ligands ¡
• HYDROPRO ¡
• SOMO ¡
• Example: ¡Tpx ¡

¡

The ¡analy&cal ¡ultracentrifuge ¡(AUC) ¡was ¡invented ¡by ¡ Theodor ¡(The) ¡Svedberg ¡

Nobel ¡Prize ¡in ¡Chemistry ¡1926 ¡awarded ¡to ¡The ¡Svedberg ¡"for ¡his ¡work ¡on ¡disperse ¡systems" ¡

Progress….. ¡

• Advice ¡from ¡the ¡Beckman ¡Model ¡E ¡AUC ¡1964 ¡manual: ¡
• “The ¡Model ¡E, ¡like ¡a ¡woman, ¡performs ¡best ¡when ¡you ¡care. ¡But ¡you ¡needn’t ¡

pamper ¡it ¡-­‑ ¡just ¡give ¡it ¡the ¡understanding ¡it ¡deserves” ¡

¡ image ¡from ¡Analy&cal ¡Ultracentrifuge ¡User ¡Guide ¡Volume ¡1: ¡Hardware, ¡K. ¡L. ¡Planken ¡& ¡V. ¡Schirf, ¡2008 ¡(hpp://www.ultrascan.uthscsa.edu/) ¡ ¡

The ¡modern ¡AUC: ¡a ¡high ¡speed ¡prepara&ve ¡UC ¡with ¡op&cs ¡

¡ Beckman ¡Coulter ¡ProteomeLab ¡XL-­‑A/XL-­‑I; ¡€250-­‑350 ¡k ¡

vacuum ¡chamber ¡ rotor ¡ UV-­‑vis ¡

• p&cs

¡ Rayleigh ¡ interference ¡

• p&cs

¡ sample ¡cell ¡(minus ¡casing) ¡

Inside ¡an ¡AUC ¡

Inside ¡the ¡rotor ¡chamber ¡

¡ image ¡from ¡Analy&cal ¡Ultracentrifuge ¡User ¡Guide ¡Volume ¡1: ¡Hardware, ¡K. ¡L. ¡Planken ¡& ¡V. ¡Schirf, ¡2008 ¡(hpp://www.ultrascan.uthscsa.edu/) ¡ ¡

monochromator ¡ mount ¡ absorbance ¡slit ¡ assembly ¡ radiometer ¡ condenser ¡lens ¡for ¡ interference ¡op&cs ¡ drive ¡spindle ¡

Sample ¡holders ¡sit ¡in ¡holes ¡in ¡the ¡AUC ¡rotor ¡

¡ image ¡from ¡Analy&cal ¡Ultracentrifuge ¡User ¡Guide ¡Volume ¡1: ¡Hardware, ¡K. ¡L. ¡Planken ¡& ¡V. ¡Schirf, ¡2008 ¡(hpp://www.ultrascan.uthscsa.edu/) ¡ ¡

50k ¡rpm ¡ 60k ¡rpm ¡

Nose ¡grease ¡!!! ¡ The ¡most ¡difficult ¡part ¡of ¡an ¡AUC ¡experiment: ¡assembling ¡ the ¡sample ¡holders ¡

image ¡from ¡Beckman ¡AUC ¡manual ¡ hpp://www.beckmancoulter.com/resourcecenter/labresources/resource_xla_xli.asp ¡

Loading ¡a ¡sample ¡

image ¡from ¡Beckman ¡AUC ¡manual ¡ hpp://www.beckmancoulter.com/resourcecenter/labresources/resource_xla_xli.asp ¡

Absorbance ¡op&cs: ¡the ¡AUC ¡is ¡like ¡a ¡spinning ¡double-­‑beam ¡ spectrophotometer ¡

image ¡from ¡Beckman ¡AUC ¡manual ¡ hpp://www.beckmancoulter.com/resourcecenter/labresources/resource_xla_xli.asp ¡

Interference ¡op&cs ¡acquire ¡refrac&ve ¡index ¡data ¡rapidly, ¡ independent ¡of ¡chromophores ¡

image ¡from ¡Beckman ¡AUC ¡manual ¡ hpp://www.beckmancoulter.com/resourcecenter/labresources/resource_xla_xli.asp ¡

Structure ¡of ¡this ¡session ¡

• Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡
• Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡
• AUC ¡instrumenta&on ¡
• Modes ¡of ¡opera&on ¡
• Some ¡theory ¡
• SE ¡versus ¡SV ¡
• Data ¡analysis ¡
• Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡
• Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡
• Some ¡theory ¡
• SoOware ¡
• HYDRO++ ¡
• Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α5β1 ¡ligands ¡
• HYDROPRO ¡
• SOMO ¡
• Example: ¡Tpx ¡

¡

2 ¡modes ¡of ¡opera&on ¡-­‑ ¡several ¡data ¡types ¡

• Sedimenta&on ¡equilibrium ¡(SE) ¡
• Mass ¡
• Associa&on/dissocia&on ¡constant ¡(Ka/Kd) ¡
• Stoichiometry ¡
• Non-­‑ideality ¡(charge, ¡asymmetry) ¡
• Sedimenta&on ¡velocity ¡(SV) ¡
• Heterogeneity ¡determina&on ¡
• Sedimenta&on ¡& ¡diffusion ¡coefficients ¡(shape) ¡
• Associa&on/dissocia&on ¡constant ¡(Ka/Kd) ¡
• Stoichiometry ¡
• In ¡solu&on ¡
• Non-­‑destruc&ve ¡
• Self-­‑cleaning ¡
• Absolute ¡

t=1 ¡h ¡ t=3 ¡h ¡ t=0 ¡

absorbance ¡

radius ¡

Sedimenta&on ¡velocity ¡(SV) ¡-­‑ ¡shape ¡and ¡homogeneity ¡ informa&on ¡

heterogeneity ¡determina&on ¡ sedimenta&on ¡(s) ¡& ¡diffusion ¡(D) ¡ coefficients ¡(shape) ¡ associa&on/dissocia&on ¡constant ¡(Ka/Kd) ¡ stoichiometry ¡

M, ¡Kd, ¡ ¡ Stoichiometry ¡ Non-­‑ideality ¡(B) ¡ t=0 ¡ t=1h ¡ t=3h ¡ t=24h+ ¡

absorbance ¡

radius ¡

Sedimenta&on ¡equilibrium ¡(SE): ¡mass ¡and ¡self-­‑associa&on ¡

Sample ¡requirements ¡

• Sample ¡volume ¡
• SV ¡
• 360 ¡µl ¡(up ¡to ¡480 ¡µl) ¡in ¡12 ¡mm ¡pathlength ¡
• 90 ¡µl ¡(up ¡to ¡120 ¡µl) ¡in ¡3 ¡mm ¡pathlength ¡
• SE ¡
• 20 ¡µl ¡(8-­‑channel ¡centrepiece ¡-­‑ ¡interference ¡op&cs ¡only) ¡
• 80 ¡µl ¡(2-­‑ ¡or ¡6-­‑channel ¡centrepiece) ¡
• Sample ¡concentra&on ¡
• Absorbance ¡op&cs: ¡Aλ≈ ¡0.1-­‑1.0 ¡in ¡12 ¡mm ¡pathlength ¡cell ¡ ¡
• λ ¡= ¡180-­‑800 ¡nm ¡
• Interference ¡op&cs: ¡typically ¡0.05-­‑30 ¡mg/ml ¡
• Sample ¡reference ¡
• Absorbance ¡op&cs: ¡can ¡be ¡column ¡eluant ¡or ¡dialysate ¡beper ¡ ¡
• Interference ¡op&cs: ¡must ¡be ¡dialysate ¡
• Typical ¡mul&plexing: ¡3 ¡or ¡7 ¡sample ¡holders ¡(“cells”)/run ¡

Structure ¡of ¡this ¡session ¡

• Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡
• Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡
• AUC ¡instrumenta&on ¡
• Modes ¡of ¡opera&on ¡
• Some ¡theory ¡
• SE ¡versus ¡SV ¡
• Data ¡analysis ¡
• Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡
• Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡
• Some ¡theory ¡
• SoOware ¡
• HYDRO++ ¡
• Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α5β1 ¡ligands ¡
• HYDROPRO ¡
• SOMO ¡
• Example: ¡Tpx ¡

¡

direc&on ¡of ¡ rotor ¡ In ¡the ¡AUC ¡there ¡are ¡3 ¡forces ¡on ¡a ¡molecule ¡

m ¡

r ¡ centrifugal ¡ fric&onal ¡ buoyant ¡ ω ¡(radians/s) ¡ ¡ ¡ 1 ¡revolu&on ¡= ¡ 2π ¡radians ¡= ¡ 6.28 ¡radians ¡ ¡

1: ¡Centrifugal ¡force ¡ F

c = m!2

r = M NA !2r F

c = m!2

r = M NA !2r F

c = m!2

r = M NA !2r

m ¡

r ¡ centrifugal ¡

2: ¡Buoyancy ¡force ¡ displaces ¡ F

b = !m0"2r = M

NA v #"2r r ¡

m ¡

buoyant ¡ F

b = !m0"2r = ! M

NA v #"2r = ¡ mass ¡= ¡volume ¡x ¡density ¡

m0 ¡

M NA v mass ¡= ¡volume ¡x ¡density ¡ ! x ¡ F

b = !m0"2r = ! M

NA v #"2r mass ¡= ¡volume ¡x ¡density ¡

3: ¡Fric&onal ¡force ¡ F

f = !fu

m ¡

r ¡ fric&onal ¡ speed ¡of ¡molecule ¡ fric&onal ¡coefficient ¡

3 ¡forces ¡balance ¡rapidly ¡

m ¡

r ¡ centrifugal ¡ fric&onal ¡ buoyant ¡ F

c + F b + F f = 0

In ¡< ¡1 ¡µs ¡

3 ¡forces ¡balance ¡rapidly ¡ F

c + F b + F f = 0

In ¡< ¡1 ¡µs ¡ M NA !2r ! M NA v "#2r !fu =0 ¡ M NA 1! v "

( )#2 ! fu = 0

u !2r = M( 1" v #) NAf sedimenta&on ¡ coefficient ¡

2 ¡important ¡equa&ons ¡

!! " = # "$% = &'(# )! $* +,- !! " = #$% &'(" )! #*

Svedberg ¡equa&on ¡

t=1 ¡h ¡ t=3 ¡h ¡ t=0 ¡

absorbance ¡

radius ¡

SV: ¡diffusion ¡opposes ¡a ¡concentra&on ¡gradient ¡

• Diffusion ¡is ¡inversely ¡

dependent ¡on ¡fric&onal ¡ coefficient ¡

• Fick’s ¡1st ¡law: ¡diffusional ¡

flow ¡(flux) ¡is ¡propor&onal ¡to ¡ diffusion ¡coefficient ¡and ¡ concentra&on ¡gradient ¡

• Fick’s ¡2nd ¡law: ¡rate ¡of ¡

change ¡of ¡concentra&on ¡is ¡ propor&onal ¡to ¡change ¡in ¡ steepness ¡of ¡concentra&on ¡ gradient ¡ !! !" =#!$! !%$ != !""# "$ ! = "# $%&

Transport ¡versus ¡equilibrium ¡

• Transport ¡(e.g. ¡SV) ¡
• Equilibrium ¡(e.g. ¡SE) ¡

!! !" " # $ % & '

#

= ($ # ! !# %)&#&!('#!! !# " # $ % & '

"

!= "!#$%"&#% #$ = '

sedimenta&on ¡ diffusion ¡

Structure ¡of ¡this ¡session ¡

• Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡
• Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡
• AUC ¡instrumenta&on ¡
• Modes ¡of ¡opera&on ¡
• Some ¡theory ¡
• SE ¡versus ¡SV ¡
• Data ¡analysis ¡
• Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡
• Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡
• Some ¡theory ¡
• SoOware ¡
• HYDRO++ ¡
• Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α5β1 ¡ligands ¡
• HYDROPRO ¡
• SOMO ¡
• Example: ¡Tpx ¡

¡

SV ¡versus ¡SE ¡

• In ¡SV ¡we ¡observe ¡the ¡movement ¡of ¡a ¡sedimenta&on ¡boundary ¡
• The ¡change ¡in ¡the ¡(some&mes ¡complex) ¡boundary ¡over ¡&me ¡is ¡due ¡to ¡
• Sedimenta&on ¡
• Diffusion ¡
• In ¡SE ¡the ¡rotor ¡is ¡spun ¡more ¡slowly ¡so ¡that ¡diffusion ¡can ¡balance ¡

sedimenta&on ¡and ¡the ¡system ¡reaches ¡thermodynamic ¡equilibrium ¡

• Then ¡we ¡observe ¡no ¡change ¡in ¡the ¡boundary ¡over ¡&me ¡
• Unless ¡the ¡sample ¡is ¡degrading ¡or ¡changing ¡in ¡some ¡other ¡way ¡

SV: ¡radial ¡movement ¡recorded ¡as ¡func&on ¡of ¡&me ¡

SV: ¡species ¡can ¡resolve ¡into ¡separate ¡boundaries ¡

SE: ¡6-­‑hole ¡centrepiece ¡data ¡recorded ¡un&l ¡no ¡change ¡

monomer ¡ dimer ¡ tetramer ¡ experimental ¡data ¡= ¡ sum ¡of ¡species ¡

Self-­‑associa&on: ¡“deconvolu&on” ¡into ¡individual ¡ components ¡

SE ¡data: ¡the ¡sum ¡of ¡exponen&als ¡for ¡self-­‑associa&on ¡

!" =#$%&'(!) +*+,-". !")

./0

+#$%&(.'(!) +'(12. +(.+*+,-". !")

./0

+#$%&(3'(!) +'(123 +(3+*+,-". !")

./0

+#$%&(4'(!) +'(124 +(4+*+,-". !")

./0+5

monomer ¡ 1-­‑n2 ¡ 1-­‑n3 ¡ 1-­‑n2 ¡

• 0.040
• 0.020

0.000 0.020 0.040 5.95 6.05 6.15 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 radius (cm) absorbance residuals

• 0.080
• 0.040

0.000 0.040 0.080 5.95 6.05 6.15 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 radius (cm) absorbance residuals

2-­‑4 ¡ 1-­‑4 ¡

SE: ¡best ¡model ¡revealed ¡by ¡residuals ¡

Structure ¡of ¡this ¡session ¡

• Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡
• Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡
• AUC ¡instrumenta&on ¡
• Modes ¡of ¡opera&on ¡
• Some ¡theory ¡
• SE ¡versus ¡SV ¡
• Data ¡analysis ¡
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• Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡
• Some ¡theory ¡
• SoOware ¡
• HYDRO++ ¡
• Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α5β1 ¡ligands ¡
• HYDROPRO ¡
• SOMO ¡
• Example: ¡Tpx ¡

¡

Many ¡methods ¡& ¡programs ¡for ¡SV ¡data ¡analysis ¡

• Too ¡many ¡for ¡comprehensive ¡review ¡here. ¡
• Model ¡independent: ¡
• dC/dt ¡(Stafford, ¡SedAnal) ¡
• Eliminates ¡&me ¡invariant ¡noise. ¡Resultant ¡curves ¡can ¡be ¡fiped ¡with ¡Gaussians ¡to ¡reveal ¡

species ¡content ¡and ¡sedimenta&on ¡coefficients. ¡

• c(s) ¡(Schuck, ¡Sedfit) ¡
• Good ¡for ¡“first ¡look” ¡at ¡data ¡to ¡get ¡an ¡idea ¡of ¡number ¡of ¡species. ¡ ¡Not ¡a ¡proper ¡fit ¡to ¡data. ¡ ¡
• van ¡Holde-­‑Weischet ¡(Demeler, ¡UltraScan ¡II) ¡
• Diffusion ¡corrected ¡s ¡distribu&on. ¡ ¡Good ¡for ¡detec&on ¡of ¡aggregates ¡and ¡iden&fica&on ¡of ¡

underlying ¡model. ¡

• Model ¡dependent: ¡
• Non-­‑interac&ng ¡discrete ¡species ¡(Schuck, ¡Sedfit) ¡
• Up ¡to ¡4 ¡separate ¡species ¡can ¡be ¡fiped. ¡
• Self-­‑associa&on ¡(Stafford, ¡SedAnal; ¡Demeler, ¡UltraScan ¡II) ¡
• Determina&on ¡of ¡Kd, ¡kon, ¡koff, ¡stoichiometry ¡

Almost ¡all ¡AUC ¡data ¡analysis ¡soOware ¡is ¡freely ¡available ¡

• The ¡RASMB ¡website ¡ ¡
• “Reversible ¡Associa&ons ¡in ¡Structural ¡and ¡Molecular ¡Biology” ¡
• hpp://www.rasmb.bbri.org/ ¡
• Access ¡to ¡freely ¡available ¡soOware ¡
• Subscrip&on ¡to ¡AUC-­‑related ¡discussion ¡group ¡
• Schuck ¡lab ¡(SEDFIT, ¡SEDPHAT) ¡
• hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡
• Demeler ¡lab ¡(UltraScan ¡II ¡(including ¡SOMO)) ¡
• hpp://www.ultrascan.uthscsa.edu/ ¡

SEDNTERP: ¡Calcula&on ¡of ¡ρ, ¡η ¡and ¡par&al ¡specific ¡volume ¡ ¡

¡ hpp://www.rasmb.bbri.org/soOware/PC/sednterp-­‑philo/ ¡

M ¡and ¡psv ¡computed ¡from ¡amino ¡acid ¡sequence ¡

¡ hpp://www.rasmb.bbri.org/soOware/PC/sednterp-­‑philo/ ¡

ρ, ¡η ¡computed ¡from ¡cons&tuents ¡

¡ hpp://www.rasmb.bbri.org/soOware/PC/sednterp-­‑philo/ ¡

Final ¡complete ¡set ¡of ¡parameters ¡for ¡subsequent ¡SV ¡& ¡SE ¡ data ¡analysis ¡ ¡

¡ hpp://www.rasmb.bbri.org/soOware/PC/sednterp-­‑philo/ ¡

c(s) ¡analysis: ¡how ¡many ¡species ¡+ ¡s ¡of ¡species ¡ 1: ¡Load ¡SV ¡data ¡

¡ hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡

2: ¡Specify ¡parameters ¡

¡ hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡

3: ¡Set ¡meniscus, ¡cell ¡base ¡and ¡analysis ¡limits ¡

¡ hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡

4: ¡Run ¡

¡ hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡

5: ¡Subtract ¡&me ¡and ¡radial ¡invariant ¡noise ¡

¡ hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡

6: ¡Fit ¡(with ¡solu&ons ¡to ¡the ¡Lamm ¡equa&on) ¡

¡ hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡

7: ¡Integrate ¡to ¡obtain ¡es&mate ¡of ¡concentra&on ¡of ¡species ¡ and ¡weight-­‑average ¡values ¡

¡ hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡

Non-­‑interac&ng ¡discrete ¡species ¡model ¡(NIDS) ¡

¡ hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡

NIDS ¡provides ¡a ¡fit ¡to ¡the ¡data ¡with ¡a ¡defined ¡model ¡

¡ hpp://www.analy&calultracentrifuga&on.com/default.htm ¡

Tpx ¡example ¡

• Give ¡brief ¡biology ¡background ¡
• Give ¡stats ¡– ¡mol ¡weight, ¡sequence, ¡mx ¡structure ¡– ¡but ¡not ¡N-­‑term ¡36 ¡a.a. ¡
• SV ¡data ¡for ¡tpx ¡alone ¡– ¡dimer ¡
• SOMO ¡modelling ¡
• SE ¡data ¡for ¡tpx ¡alone ¡– ¡dimer ¡
• Drug ¡binding ¡– ¡ME0055 ¡observed ¡at ¡its ¡lambda ¡
• Gave ¡stoichiometry ¡& ¡Kd ¡
• Have ¡also ¡done ¡SAXS ¡– ¡consistent ¡with ¡hydrodynamics ¡

PhtD ¡

• Give ¡brief ¡biology ¡background ¡
• Give ¡stats ¡– ¡mol ¡weight, ¡sequence, ¡no ¡structure ¡
• I-­‑TASSER ¡
• SV ¡data ¡for ¡PhtD ¡alone ¡– ¡monomer ¡
• SOMO ¡modelling ¡of ¡I-­‑TASSER ¡
• SE ¡data ¡for ¡PhtD ¡alone ¡– ¡monomer ¡
• SAXS ¡just ¡done ¡

YgaU ¡

• Give ¡brief ¡biology ¡background ¡
• Give ¡stats ¡– ¡mol ¡weight, ¡sequence, ¡NMR ¡structure ¡– ¡± ¡K+? ¡
• SV ¡data ¡for ¡YgaU ¡± ¡K+ ¡alone ¡– ¡monomer, ¡but ¡different ¡s ¡
• SOMO ¡modelling ¡
• SE ¡data ¡– ¡monomer ¡
• SAXS ¡just ¡done ¡

Structure ¡of ¡this ¡session ¡

• Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡
• Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡
• AUC ¡instrumenta&on ¡
• Modes ¡of ¡opera&on ¡
• Some ¡theory ¡
• SE ¡versus ¡SV ¡
• Data ¡analysis ¡
• Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡
• Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡
• Some ¡theory ¡
• SoOware ¡
• HYDRO++ ¡
• Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α5β1 ¡ligands ¡
• HYDROPRO ¡
• SOMO ¡
• Example: ¡Tpx ¡

¡

Structure ¡of ¡this ¡session ¡

• Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡
• Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡
• AUC ¡instrumenta&on ¡
• Modes ¡of ¡opera&on ¡
• Some ¡theory ¡
• SE ¡versus ¡SV ¡
• Data ¡analysis ¡
• Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡
• Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡
• Some ¡theory ¡
• SoOware ¡
• HYDRO++ ¡
• Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α5β1 ¡ligands ¡
• HYDROPRO ¡
• SOMO ¡
• Example: ¡Tpx ¡

¡

s: ¡inversely ¡related ¡to ¡fric&onal ¡coe• ¡

!! " = #$%" &! #' ()*

M, ¡f0 ¡ M, ¡f>f0 ¡ M, ¡f>f0 ¡

s ¡= ¡devia&on ¡from ¡sphericity ¡+ ¡hydrodynamic ¡hydra&on ¡ M, ¡f>f0 ¡ M, ¡f>>f0 ¡

!! " = #$%" &! #' ()*

M, ¡f0 ¡ M, ¡f>f0 ¡

!" = #$ %& = ' ( !)*

(

Fric&on ¡= ¡Asymmetry ¡+ ¡Hydra&on ¡

M, ¡Vh, ¡s, ¡f ¡ ¡ M, ¡Va, ¡sa, ¡fa ¡ ¡ M, ¡Va, ¡s0, ¡f0 ¡ ¡

!" = #$ %& !" =#!"$"

!" = !# $ $ +!$%

&

" # $ $ % & ' '

% '

Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡(HBM) ¡ s = ? S

Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡

• Fric&onal ¡proper&es ¡of ¡sphere ¡and ¡assemblies ¡of ¡spheres ¡exactly ¡known ¡
• s ¡for ¡molecule ¡represented ¡as ¡sphere ¡assembly ¡(bead ¡model) ¡can ¡be ¡

accurately ¡computed ¡

• If ¡scomp ¡≈ ¡sexp ¡model ¡is ¡one ¡plausible ¡solu&on ¡conforma&on ¡for ¡the ¡molecule ¡
• For ¡one ¡sphere ¡
• For ¡an ¡assembly ¡of ¡spheres ¡an ¡approximate ¡solu&on ¡is ¡ ¡
• where ¡ ¡

!" =#!"$"

Structure ¡of ¡this ¡session ¡

• Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡
• Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡
• AUC ¡instrumenta&on ¡
• Modes ¡of ¡opera&on ¡
• Some ¡theory ¡
• SE ¡versus ¡SV ¡
• Data ¡analysis ¡
• Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡
• Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡
• Some ¡theory ¡
• SoOware ¡
• HYDRO++ ¡
• Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α5β1 ¡ligands ¡
• HYDROPRO ¡
• SOMO ¡
• Example: ¡Tpx ¡

¡

Several ¡freely ¡available ¡programs ¡for ¡HBM ¡

• A ¡more ¡exact ¡expression ¡for ¡ft ¡together ¡with ¡expressions ¡for ¡other ¡

hydrodynamic ¡and ¡related ¡parameters ¡are ¡encoded ¡in ¡HBM ¡soOware ¡ ¡

• From ¡the ¡group ¡of ¡José ¡García ¡de ¡la ¡Torre ¡(Universidad ¡Murcia, ¡Spain) ¡
• hpp://leonardo.inf.um.es/macromol/programs/programs.htm ¡
• HYDRO ¡
• Computes ¡hydrodynamic ¡& ¡other ¡parameters ¡for ¡any ¡bead ¡model ¡
• HYDROPRO ¡
• Computes ¡hydrodynamic ¡& ¡other ¡parameters ¡for ¡models ¡constructed ¡from ¡pdb ¡files ¡
• And ¡many ¡other ¡programs…. ¡
• From ¡a ¡collabora&on ¡between ¡Ma„a ¡Rocco, ¡Emre ¡Brookes, ¡Borries ¡Demeler ¡&

¡ Olwyn ¡Byron ¡

• hpp://www.ultrascan.uthscsa.edu/SOMO ¡
• Generates ¡HBMs ¡from ¡pdb ¡files, ¡computes ¡hydrodynamic ¡& ¡other ¡parameters ¡with ¡

realis&c ¡hydra&on ¡

¡ Reviewed ¡in ¡Byron ¡(2008) ¡Methods ¡in ¡Cell ¡Biology ¡84 ¡327-­‑373 ¡

Parameters ¡that ¡can ¡be ¡computed ¡(1/4) ¡

Parameters ¡that ¡can ¡be ¡computed ¡(2/4) ¡

Parameters ¡that ¡can ¡be ¡computed ¡(3/4) ¡

Parameters ¡that ¡can ¡be ¡computed ¡(4/4) ¡

Structure ¡of ¡this ¡session ¡

• Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡
• Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡
• AUC ¡instrumenta&on ¡
• Modes ¡of ¡opera&on ¡
• Some ¡theory ¡
• SE ¡versus ¡SV ¡
• Data ¡analysis ¡
• Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡
• Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡
• Some ¡theory ¡
• SoOware ¡
• HYDRO++ ¡
• Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α5β1 ¡ligands ¡
• HYDROPRO ¡
• SOMO ¡
• Example: ¡Tpx ¡

¡

HYDRO++ ¡input ¡is ¡bead ¡coordinates ¡plus ¡“control” ¡file ¡

¡ García ¡de ¡la ¡Torre ¡et ¡al. ¡1994 ¡Biophys ¡J. ¡67 ¡530-­‑531 ¡

HYDRO++ ¡runs ¡in ¡DOS ¡window ¡

¡ hpp://leonardo.inf.um.es/macromol/programs/hydro++/hydro++.htm ¡

Output ¡is ¡hydrodynamic ¡+ ¡other ¡parameters ¡ ¡

¡ hpp://leonardo.inf.um.es/macromol/programs/hydro++/hydro++.htm ¡ (data ¡cropped) ¡ (data ¡cropped) ¡

Bead ¡model ¡can ¡be ¡viewed ¡in ¡vrml ¡viewer ¡

¡ hpp://leonardo.inf.um.es/macromol/programs/hydro++/hydro++.htm ¡

Structure ¡of ¡this ¡session ¡

• Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡
• Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡
• AUC ¡instrumenta&on ¡
• Modes ¡of ¡opera&on ¡
• Some ¡theory ¡
• SE ¡versus ¡SV ¡
• Data ¡analysis ¡
• Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡
• Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡
• Some ¡theory ¡
• SoOware ¡
• HYDRO++ ¡
• Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α5β1 ¡ligands ¡
• HYDROPRO ¡
• SOMO ¡
• Example: ¡Tpx ¡

¡

Oligomerisa&on ¡of ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α5β1 ¡ ligands ¡

• α5β1 ¡used ¡to ¡immobilise ¡cells ¡on ¡surfaces ¡via ¡
• 9th ¡type ¡III ¡FN ¡domain ¡synergy ¡site ¡(PHSRN) ¡
• 10th ¡type ¡III ¡FN ¡domain ¡RGD ¡site ¡
• α5β1 ¡oligomers ¡facilitate ¡increased ¡binding ¡
• Oligomerisa&on ¡accomplished ¡via ¡5 ¡heptad ¡repeats ¡based ¡on ¡GCN4 ¡leucine ¡

zipper ¡

• I/L ¡placed ¡variously ¡@ ¡a ¡and ¡d ¡posi&ons ¡to ¡promote ¡di-­‑, ¡tri-­‑ ¡& ¡tetramerisa&on ¡
• Thiol-­‑linked ¡immobilisa&on ¡to ¡surface ¡achieved ¡via ¡C-­‑terminal ¡Cys ¡
• Ques&on: ¡do ¡the ¡ligands ¡oligomerise ¡as ¡designed? ¡

Construc&on ¡of ¡hydrodynamic ¡bead ¡models ¡

• From ¡vector ¡(including ¡His-­‑tag) ¡– ¡too ¡short ¡for ¡e.g. ¡SWISSMODEL ¡
• FN ¡III ¡9-­‑10 ¡domain ¡pair ¡homology ¡model ¡(SWISSMODEL) ¡
• Coiled-­‑coil ¡(42 ¡a.a.) ¡– ¡SWISSMODELs ¡generated ¡for ¡underlined ¡segment ¡
• Synthesised ¡“missing ¡beads” ¡

! ¡ Kreiner ¡et ¡al., ¡(2009) ¡Biophysical ¡Chemistry ¡142 ¡34-­‑39 ¡

Oligomer ¡models ¡generated ¡

linear ¡monomer ¡ s ¡= ¡1.7 ¡S ¡ bent ¡monomer ¡ s ¡= ¡1.8 ¡S ¡ linear ¡dimer ¡ s ¡= ¡2.7 ¡S ¡ bent ¡dimer ¡ s ¡= ¡2.5 ¡S ¡

¡ Kreiner ¡et ¡al., ¡(2009) ¡Biophysical ¡Chemistry ¡142 ¡34-­‑39 ¡

Oligomer ¡models ¡generated ¡

linear ¡trimer ¡ s ¡= ¡3.9 ¡S ¡ bent ¡trimer ¡ s ¡= ¡3.1 ¡S ¡

¡ Kreiner ¡et ¡al., ¡(2009) ¡Biophysical ¡Chemistry ¡142 ¡34-­‑39 ¡

Oligomer ¡models ¡generated ¡

linear ¡tetramer ¡ s ¡= ¡4.7 ¡S ¡ bent ¡tetramer ¡ s ¡= ¡3.7 ¡S ¡ linear ¡hexamer ¡ s ¡= ¡5.0 ¡S ¡

¡ Kreiner ¡et ¡al., ¡(2009) ¡Biophysical ¡Chemistry ¡142 ¡34-­‑39 ¡

AUC ¡SV ¡no ¡DTT: ¡c(s) ¡analysis ¡reveals ¡complex ¡composi&on ¡

“dimer” ¡ “trimer” ¡ “tetramer” ¡

1 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡2 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡3 ¡ ¡ ¡ ¡4 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡6 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ Kreiner ¡et ¡al., ¡(2009) ¡Biophysical ¡Chemistry ¡142 ¡34-­‑39 ¡

AUC ¡SV ¡+ ¡DTT: ¡c(s) ¡analysis ¡reveals ¡simplified ¡composi&on ¡

“dimer” ¡ “trimer” ¡ “tetramer” ¡

1 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡2 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡3 ¡ ¡ ¡ ¡4 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡6 ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ Kreiner ¡et ¡al., ¡(2009) ¡Biophysical ¡Chemistry ¡142 ¡34-­‑39 ¡

Overall ¡conclusions ¡

• All ¡ligands ¡are ¡rela&vely ¡hydrophobic ¡
• Monomer ¡could ¡be ¡straight ¡or ¡bent ¡
• Dimer, ¡trimer ¡and ¡tetramer ¡have ¡straight ¡conforma&ons ¡
• Trimer ¡dimerises ¡via ¡C-­‑terminal ¡Cys ¡

¡ Kreiner ¡et ¡al., ¡(2009) ¡Biophysical ¡Chemistry ¡142 ¡34-­‑39 ¡

Structure ¡of ¡this ¡session ¡

• Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡
• Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡
• AUC ¡instrumenta&on ¡
• Modes ¡of ¡opera&on ¡
• Some ¡theory ¡
• SE ¡versus ¡SV ¡
• Data ¡analysis ¡
• Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡
• Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡
• Some ¡theory ¡
• SoOware ¡
• HYDRO++ ¡
• Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α5β1 ¡ligands ¡
• HYDROPRO ¡
• SOMO ¡
• Example: ¡Tpx ¡

¡

HYDROPRO ¡computes ¡hydrodynamic ¡(& ¡other) ¡parameters ¡ from ¡PDB ¡files ¡

s, etc

atomic element minibead

¡ García ¡de ¡la ¡Torre ¡et ¡al. ¡2000 ¡Biophys ¡J. ¡78 ¡719-­‑730 ¡

HYDROPRO ¡input ¡is ¡PDB ¡plus ¡“control” ¡file ¡

HYDROPRO ¡runs ¡in ¡DOS ¡window ¡

¡ hpp://leonardo.inf.um.es/macromol/programs/hydropro/hydropro.htm ¡

Performs ¡hydrodynamic ¡calcula&ons ¡for ¡shell ¡model ¡

¡ hpp://leonardo.inf.um.es/macromol/programs/hydropro/hydropro.htm ¡

Output ¡is ¡hydrodynamic ¡+ ¡other ¡parameters ¡ ¡

¡ hpp://leonardo.inf.um.es/macromol/programs/hydropro/hydropro.htm ¡

Primary ¡bead ¡model ¡can ¡be ¡viewed ¡in ¡vrml ¡viewer ¡

s ¡is ¡a ¡constraint ¡for ¡ab ¡ini:o ¡SAS ¡models ¡

• HYDROPRO+DAMs: ¡IMPORTANT ¡
• Select ¡atomic ¡element ¡radius ¡> ¡DAM ¡packing ¡radius ¡to ¡ensure ¡hydrodynamic ¡model ¡properly ¡

filled ¡

• Can ¡calculate ¡effec&ve ¡hydra&on ¡of ¡hydrodynamic ¡model ¡
• Should ¡be ¡≥ ¡hydra&on ¡of ¡DAM. ¡DAM ¡volume ¡= ¡that ¡from ¡which ¡water ¡molecules ¡are ¡excluded ¡

which ¡therefore ¡includes ¡some ¡effec&ve ¡hydra&on ¡but ¡not ¡as ¡much ¡as ¡hydrodynamic ¡ hydra&on ¡

• DRMs: ¡IMPORTANT ¡
• Need ¡to ¡delete ¡dummy ¡waters ¡
• HYDRO ¡gives ¡anhydrous ¡parameters ¡
• Hydrate ¡accordingly ¡-­‑ ¡e.g. ¡via ¡uniform ¡expansion ¡
• HYDROPRO ¡gives ¡an ¡effec&ve ¡hydra&on ¡

Structure ¡of ¡this ¡session ¡

• Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡
• Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡
• AUC ¡instrumenta&on ¡
• Modes ¡of ¡opera&on ¡
• Some ¡theory ¡
• SE ¡versus ¡SV ¡
• Data ¡analysis ¡
• Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡
• Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡
• Some ¡theory ¡
• SoOware ¡
• HYDRO++ ¡
• Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α5β1 ¡ligands ¡
• HYDROPRO ¡
• SOMO ¡
• Example: ¡Tpx ¡

¡

SOMO ¡-­‑ ¡construc&on ¡of ¡“intelligently” ¡hydrated ¡bead ¡ models ¡from ¡atomic ¡coordinates ¡

• Water ¡of ¡hydra&on ¡included ¡

in ¡each ¡bead ¡

• Bead ¡overlaps ¡removed ¡

heirarchically ¡

• Reducing ¡radii ¡+ ¡transla&ng ¡bead ¡

centres ¡outwards ¡

• Beads ¡overlapping ¡by ¡> ¡preset ¡

threshold ¡are ¡fused ¡ (“popped”) ¡

• Buried ¡beads ¡excluded ¡from ¡

hydrodynamic ¡calcula&ons ¡

• Reduces ¡cpu ¡&me ¡

¡ ¡ ¡ ¡ exposed ¡acidic ¡ ¡ exposed ¡basic ¡ exposed ¡polar ¡ exposed ¡nonpolar/hydrophobic ¡ mainchain ¡ buried ¡ ¡

Trans ¡

A B C D E Popped beads

AtoB ¡

B C

¡ Rai, ¡Nöllmann, ¡Spotorno, ¡Tassara, ¡Byron ¡& ¡Rocco, ¡Structure ¡(2005) ¡13, ¡723-­‑734 ¡

2 Å 3 Å 5 Å 8 Å

(T2)

SOMO ¡or ¡AtoB? ¡

• AtoB ¡valuable ¡in ¡reducing ¡the ¡number ¡of ¡fric&onal ¡elements ¡in ¡HBM ¡
• SOMO ¡uses ¡a ¡fixed ¡resolu&on ¡and ¡preserves ¡“chemistry” ¡ ¡

SOMO ¡– ¡a ¡module ¡within ¡UltraScan ¡II ¡

¡ hpp://www.ultrascan.uthscsa.edu ¡

1: ¡Load ¡PDB ¡file ¡

¡ hpp://www.ultrascan.uthscsa.edu ¡

2: ¡File ¡read, ¡checked ¡for ¡compa&bility, ¡displayed ¡with ¡ RasMol ¡

¡ hpp://www.ultrascan.uthscsa.edu ¡

3: ¡Compute ¡and ¡display ¡bead ¡model ¡

¡ hpp://www.ultrascan.uthscsa.edu ¡

4: ¡Compute ¡and ¡display ¡hydrodynamic ¡parameters ¡

¡ hpp://www.ultrascan.uthscsa.edu ¡

Structure ¡of ¡this ¡session ¡

• Part ¡1: ¡Analy&cal ¡ultracentrifuga&on ¡
• Ques&ons ¡that ¡can ¡be ¡answered ¡
• AUC ¡instrumenta&on ¡
• Modes ¡of ¡opera&on ¡
• Some ¡theory ¡
• SE ¡versus ¡SV ¡
• Data ¡analysis ¡
• Part ¡2: ¡Tea ¡break ¡
• Part ¡3: ¡Hydrodynamic ¡bead ¡modelling ¡
• Some ¡theory ¡
• SoOware ¡
• HYDRO++ ¡
• Example: ¡synthe&c ¡polyvalent ¡integrin ¡α5β1 ¡ligands ¡
• HYDROPRO ¡
• SOMO ¡
• Example: ¡Tpx ¡

Modelling ¡solu&on ¡conforma&on ¡of ¡Tpx ¡

• SOMO ¡model ¡of ¡Tpx ¡dimer ¡from ¡pdb ¡file ¡
• Computed ¡s ¡(3.06 ¡S) ¡is ¡close ¡to ¡experimental ¡value ¡(3.04 ¡S) ¡
• But ¡model ¡does ¡not ¡include ¡2 ¡x ¡36 ¡amino ¡acid ¡N-­‑termini ¡

Crystal ¡structure ¡lacks ¡2x ¡36 ¡a.a. ¡N-­‑termini ¡

• BUNCH ¡used ¡to ¡posi&on ¡N-­‑termini ¡based ¡on ¡SAXS ¡data ¡
• SOMO ¡used ¡to ¡compute ¡s ¡for ¡resultant ¡models ¡
• s ¡(and ¡other ¡parameters) ¡surprisingly ¡insensi&ve ¡to ¡conforma&on ¡of ¡N-­‑termini ¡
• Computed ¡s ¡(3.45 ¡S) ¡much ¡higher ¡than ¡experimental ¡(3.04 ¡(± ¡0.1) ¡S) ¡ ¡

Monte ¡Carlo ¡modelling ¡of ¡N-­‑terminal ¡conforma&ons ¡

• MONTEHYDRO ¡used ¡to ¡generate ¡15,000 ¡conforma&ons ¡of ¡2 ¡N-­‑termini ¡and ¡

compute ¡ensemble ¡hydrodynamic ¡parameters ¡

• To ¡make ¡computa&onally ¡tractable, ¡Tpx ¡dimer ¡pdb ¡reduced ¡to ¡121 ¡beads ¡using

¡ AtoB ¡within ¡SOMO ¡(note: ¡s ¡hardly ¡changes) ¡

¡ hpp://leonardo.inf.um.es/macromol/programs/montehydro-­‑1d/montehydro-­‑1d.htm ¡

N-­‑terminal ¡HMB ¡computed ¡from ¡rigid ¡body ¡model ¡via ¡AtoB ¡

• AtoB ¡used ¡to ¡generate ¡1 ¡bead-­‑per-­‑residue ¡model ¡of ¡one ¡BUNCH ¡N-­‑termini ¡

model ¡

• Bead ¡radius ¡changed ¡to ¡average ¡radius ¡for ¡N-­‑terminus ¡
• Hydrodynamic ¡computa&ons ¡inaccurate ¡for ¡overlapping ¡beads ¡of ¡differing ¡radii ¡

Hydrodynamics ¡of ¡ensemble ¡computed ¡by ¡MONTEHYDRO ¡

• Coordinates ¡of ¡low ¡resolu&on ¡Tpx ¡dimer ¡plus ¡2x ¡BUNCH ¡N-­‑termini ¡input ¡to ¡

MONTEHYDRO ¡ ! = "#$ %&'! (") ! = "#$%! &#''()""& !*'+$',)""#&*- $#+)*!)"& !'.+ # $ % & ' ( ! ="#$%& !" = !# $ $ +!$%

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Thank ¡you ¡– ¡any ¡ques&ons? ¡