Scientific results of WISDOM first data challenges on malaria and avian flu Young-Min Kim (professor Doman Kim) Chonnam National University, Korea On the behalf of the WISDOM collaboration http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 전 남 대 학 전 남 대 학 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실 기능성 교
Searching for new drugs • Drug development is a long (10-12 years) and expensive (~800 MDollars) process • In silico drug discovery opens new perspectives to speed it up and reduce its cost Target discovery Target discovery Lead discovery Lead discovery Target Target Lead Lead Lead Lead Identification and validation Identification and validation identification identification optimization optimization - 2/5 years - 2/5 years - 0.5 year - 0.5 year - 2/4 years - 2/4 years - 30% success rate - 30% success rate - 65% success rate - 65% success rate - 55% success rate - 55% success rate De novo design, De novo design, Virtual screening, Virtual screening, Gene expression analysis, Gene expression analysis, Virtual screening Virtual screening QSAR QSAR Target function prediction, Target function prediction, Target structure prediction Target structure prediction From Dr. Vincent Breton http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz http:// altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 전 남 대 학 전 남 대 학 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실 기능성 교
A first step towards in silico drug discovery: virtual screening Starting compound Starting target database structure model • In silico virtual screening – Starting from millions Define binding site Filter, preparation of compounds, select Visual evaluation Computational demand a handful of compounds for in Docking, scoring, filter Visual evaluation vitro testing – Very computationally Predicted binding models intensive but potentially much Protein surface Protein surface Post-analysis Water Water cheaper and time Visual evaluation Ligand Ligand effective than typical Compounds in vitro testing for assay From Dr. Vincent Breton http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz http:// altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 전 남 대 학 전 남 대 학 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실 기능성 교
Wisdom I workflow for malaria inhibitor development Molecular docking Millions FLEXX AUTODOCK Molecular dynamics 5000 AMBER Re-ranking MMPBSA-GBSA Ligand Amber Ligand Ligand CHIMERA 2 Hydrogen 4 H bonds 180 Complex Bonds Catalytic aspartic residues Catalytic aspartic residues visualization Catalytic aspartic residues In vitro 30 WET LABORATORY tests From Ana & Vinod http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz http:// altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 전 남 대 학 전 남 대 학 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실 기능성 교
Inhibition of Plasme psin II Ar e as whe r e malar ia transmission oc c ur s Ar e as with limite d r isk No malar ia http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 전 남 대 학 전 남 대 학 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실 기능성 교
Plasme psin II II Plasme psin -Ma la ria , a dre adful dise a se is c a use b y pro to zo a n pa ra site , plasmo dium . - Plasmo dium spe c ise : Plasmo dium falc iparum, P. vivax, P. malariae , P. o vale - One o f the c ruc ia l drug ta rg e ts in ma la ria a re pla sme psin. -Pla sme psins a re invo lve d in the he mo g lo b in de g ra da tio n inside the fo o d va c uo le during the e rythro c ytic pha se o f the life c yc le . - T e n diffe re nt iso fo rms (PMI , I I , I I I , I V, V, VI , VI I , I X, X a nd HAP) is re spo nsib le fo r initia l a tta c k o n the he mo g lo b in α -c ha in b e twe e n - Pla sme psin I I the re sidue s Phe 33 and L e u 34 , in the hing e re g io n. He moglobin (Hb) He me Plasme psins I, II, IV and HAP oxida tion L ar ge fr agme nts F alc ipain, plasme psin He matin Small pe ptide s polyme riza tion F alc ilysin, aminope pdidase s He mozoin Amino ac ids (malarial pigme nt) <He moglobin de gr adation in Plasmodium fac ipur am > http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz http:// altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 전 남 대 학 전 남 대 학 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실 기능성 교
Pe pstatin A vs. Ne w pote ntial A vs. Ne w pote ntial plasme psin plasme psin inhibitor inhibitor s Pe pstatin s Pe pstatin A - Ge ne ra l inhib ito r o f aspa rtic pro te a se s - inhib itio n o f he mo g lo b in de g ra da tio n b y e xtra c ts o f dig e stive va c uo le s o f P. fac iparum (Phe 33 and L e u34 in the hing e re g io n o f the α -c ha in) http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 전 남 대 학 전 남 대 학 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실 기능성 교
E xpr e ssion and pur ific ation of r e c ombinant plasme psin II M 1 2 - Pla smids na me : rPMI I(pla sme psin I I ), kDa - ve c to r : pE T -3d (4,640 b p, se le c tio n ma rke r : a mpic illin) - tra nsfo rma tio n o f E . c o li BL 21(DE 3) 66 44 ) : g ro wn to a n OD 600 o f 0.5 a t 37 o C - I PT G induc tio n (1 L � a dditio n o f I G � 18 o C 37 kDa PT 31 L a ne 1: c e ll supe rna ta nt a fte r tre a tme nt o f 8 M ure a L a ne 2 : purifie d e nzyme using Q-Se pha ro se c o lumn Q-Se phar ose c hr omatogr aphy Binding Washing Elution from 0 M to 1 M 2. 5 1. 2 Binding b y 20 mM T ris b uffe r pH 8.0 E a c h fra c tio n: 5 ml NaCl concentration 1 2 Wa shing b y sa me b uffe r E a c h fra c tio ns: 30 ml 0. 8 1. 5 OD280 E lutio n b y fro m 0 to 1 M Na Cl in sa me b uffe r 0. 6 E a c h fra c tio n: 3 ml 1 0. 4 0. 5 On UV 0. 2 0 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 Fr act i o n N o . http:// http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 전 남 대 학 전 남 대 학 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실 기능성 교
Malar ia Aspar tyl pr ote inase F RE T assay DABCYL -Glu-Ar g-Nle -Phe -L e u-Se r -Phe -Pr o-E DANS c le ava ge site O Prote ase Dye Pe ptide Dye Pe ptide C NH COOH + H 2 N <Carboxype ptidase re ac tion of “pe ptide - CO- NH- Dye ” fluoroge nic substr ate > - Synthe tic pe ptide de sig ne d to mimic the c le a va g e site pre se nt in he mo g lo b in 1 2 3 1 2 3 la ne 1 : F RE T sub stra te (10 μ M) la ne 2 : a c tive rPM2 la ne 3 : F RE T sub stra te + a c tive rPM2 Be fore re a c tion Afte r re ac tion http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz http:// altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 전 남 대 학 전 남 대 학 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실 기능성 교
r PM2 ac tivity assay I F I Ra nk I F I Ra nk NI 3418 15 1760 20 PA 1059 16 1214 8 Plasme psin assay 1 2200 23 17 1046 4 - Pla sme psin ac tiva tio n : rPMI I+ a ssa y 2 2074 18 1173 22 7 b uffe r (pH 4.5) + 1 μ l inhib ito r (100 nM) 3 2981 19 1059 5 27 � 37 o C, 30 min induc tio n 4 1439 16 20 1026 3 5 2485 26 21 1016 1 - F RE T assa y 6 1297 11 22 2322 25 1) Ac tiva te d e nzyme (75 ng ) + 3 μ M 7 1230 9 23 1414 14 sub stra te pe ptide (50 μ l fina l vo lume ) 8 1402 24 1642 13 19 � 30 min inc ub a tio n a t ro o m 9 3534 30 25 1253 10 te mpe ra ture 10 3430 28 26 1341 12 2) me a suring using a fluo re sc e nc e 11 1531 17 27 1074 6 mic ro pla te re a de r (e xc ita tio n 405 nm, 12 1808 21 28 1426 15 e missio n 510 nm) � de te c tio n o f 13 2209 24 29 1631 18 fluo re sc e nc e spe c tra o r UV spe c tra 30 3499 14 1025 2 29 I – Inhibitors; NI – w/o inhibitor PA – w/ pepstatin A (reference) � Similar or better inhibitions : 6/30 * Red valued inhibitors – contain own fluorescence. compounds [21,14, 20, 17, 19, (27)] http://altair.chonnam.ac.kr/~carboenz http:// altair.chonnam.ac.kr/~carboenz 전 남 대 학 전 남 대 학 기능성 탄수화물 탄수화물 효소 효소 및 및 미생물 미생물 유전체 유전체 연구실 연구실 기능성 교
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